专利名称：文蛤铁蛋白基因及编码蛋白和其体外重组表达产物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及文蛤铁蛋白基因克隆及体外重组表达技术，具体地说是从幼虫cDNA 文库中筛选获得铁蛋白基因的EST序列，设计引物，采用RACE技术克隆出文蛤铁蛋白基因 的cDNA全序列，并对该序列进行了原核重组表达，还涉及到该基因及其表达产物在文蛤苗 种繁育中幼虫生长发育调控和免疫调节中的应用。
背景技术：
铁蛋白是典型的细胞内蛋白(Tacchini et al.，1992)，铁离子通过铁吸收机制通 过细胞膜进入细胞后就储存在铁蛋白中，当机体需要铁离子时再被释放出来。铁蛋白是由 M个结构上等同的亚基组成的中空的球状大分子，中空部分最多可容纳4500个铁原子。铁 蛋白亚基分为2种类型，即H型亚基和L型亚基。H亚基和L亚基在结构上是等同的，但是 在铁的储存与吸收方面这两种亚基是功能互补的，H亚基上有一个铁氧化酶位点，L亚基缺 乏这一位点，但是有一个在内表面的附加的谷氨酰胺位点，这就可以产生一个有利于三价 铁离子在H亚基的氧化酶位点反转和矿化的微环境。铁蛋白在生物体内有两种主要作用， 其一为储存铁离子，为生物体提供必须的铁离子；另外则是解毒作用，清除二价铁带给机 体的毒性作用。归结起来，它涉及两种生理功能(1)与机体的生长发育有关，Roskams等 (1994)发现铁和铁蛋白在大鼠出生后随脑部发育表达上调，推测与脑部发育有很重要的 作用，^iang等报道铁蛋白与牡蛎壳的形成有关。( 与动物的免疫相关，Beck等 (2002)认为海胆铁蛋白是一种应激蛋白，在棘皮动物的免疫过程中起着重要作用，在对虾 类的研究中发现铁蛋白基因在病原感染前后都有明显的上调表达。文蛤是我国重要的经济贝类，肉味鲜美、营养价值高，在国内外市场都受到广泛欢 迎，因而文蛤养殖具有广阔的发展前景。随着我国人民生活水平的提高，贝类等海产品的消 费需求日益增长。过去文蛤养殖所用苗种主要依赖自然采捕野生苗种，每年苗量的丰欠严 重影响着养殖产业的发展。目前全国文蛤养殖面积约50万亩，年需苗种100亿粒，由于养 殖业户对苗种的需求很大，对自然苗种的高强度采捕对文蛤资源造成了很大破坏。文蛤苗 种的稳定高效生产，是制约文蛤养殖产业的瓶颈。在苗种繁育过程中，通过人工调控幼虫的 发育和生长，对于提高育苗的成功率具有重要的价值。铁蛋白对文蛤等幼虫的发育调节和 免疫增强作用，为应用于苗种生产提供了可能。
发明内容
本发明的目的是提供一种文蛤铁蛋白基因及编码蛋白和其体外重组表达产物的 应用，从文蛤中克隆到铁蛋白的cDNA序列，并对其实现原核表达及重组产物的活性鉴定， 为进一步研究文蛤幼虫发育机制提供基础，并为文蛤苗种繁育生产中幼虫发育调控和免疫 调节提供技术手段。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种文蛤铁蛋白基因，具有序列表SEQ ID NO. 1中碱基序列。其是从文蛤中克隆到铁蛋白的cDNA序列，该序列全长798bp，包括51!3bp的开放阅读框，编码171个氨基酸， 5’非编码区长119bp，3’非编码区长154bp，有一个加尾信号，该基因在文蛤幼虫发育中贝 壳形成方面发挥着重要作用。利用PGEX-4T-1表达载体在大肠杆菌BL21(DE!3)中重组表达 了该蛋白，表达产物具有将1 2+氧化为1 3+的蛋白活性。其编码蛋白具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，分子量为19. 9kDa，等电点为 5.四。重组铁蛋白具有脊椎动物H型铁蛋白的典型结构，不同亚基通过非共价键结和在一 起，包含有一个氧化狗2+的氧化中心，7个氨基酸残基分别是Glu25、Tyr30、Glu59、Glu60、 His63、Glul05和Glnl39。该蛋白可以参与铁离子的氧化和储运，调控文蛤等贝类幼虫贝壳 的形成和生长，可应用于贝类苗种繁育的人工调控。本发明利用表达序列标签(EST)技术、cDNA末端快速扩增(RACE)技术从文蛤中 克隆到铁蛋白基因cDNA全长序列，通过PCR技术，扩增编码铁蛋白成熟肽的基因片断并将 其克隆到PGEX-4T-1表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了原核体外重组表达。重 组产物经GSTrap affinity columns纯化，并进一步将GST切去后对1 2+有氧化作用。本 发明可为进一步研究文蛤幼虫发育机制提供理论基础，并为文蛤苗种繁育生产中幼虫发育 调控和免疫调节提供技术手段。
图1 :BCA蛋白检测试剂盒检测文蛤重组铁蛋白浓度，图中1 蛋白标准分子量；2 BSA (0. 5mg/ml) ；3 重组铁蛋白。图2 重组铁蛋白MmeFer-GST凝血酶切GST图谱，图中1.蛋白标准分子量2.铁 蛋白 3. GST。
具体实施例方式下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。实施例1.一种克隆得到的文蛤铁蛋白基因，具有SEQ ID NO. 1所示的序列。本发明中的文蛤铁蛋白基因的cDNA序列克隆包括下列步骤a)文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化；b)文蛤cDNA文库构建；c)文蛤cDNA文库EST序列的测定；d)文蛤EST序列的同源性分析及铁蛋白基因片段的筛选；e)RACE技术获得铁蛋白基因的全序列。具体操作如下a)文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化利用hvitrogen公司的Trizol试剂从文 蛤幼虫中提取总RNA，利用QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒纯化mRNA。b)文蛤 cDNA 文库构建利用 Stratagene 公司 cDNA Synthesis Kit 和 ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene)进行cDNA的合成，双链cDNA经末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Β ο I内切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit对大于IOObp的酶切片段进行回收，与hvitrogen公司Uni-ZAP XRvector 载体连接，利用 Stratagene 公司的ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒进行文库包装，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株从Uni-ZAP XR Vector上体外切割pBluescript成为质粒文库。c)文蛤cDNA文库EST序列的规模测定文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物 T3在MegaBACElOOO测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*. abi，abd文件) 数据经Phred程序处理转化为序列文件(*. seq)和质量文件(*. seq. qual)，依据质量文件 提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-mach程序屏蔽数据中 的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13(准确率大于95% )且长度大于 IOObp的序列作为EST数据，具体参见《基因表达序列标签(EST)数据分析手册》(胡松年 著，浙江大学出版社，2005年)。d)文蛤EST序列的同源性分析及铁蛋白基因片段的筛选将获得的全部有效的 EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获的Contigs与Singletons 在数据库中进行BLASTx分析，显示其中的EST序列与珍珠贝铁蛋白相似性达78%，与长牡 蛎中两种铁蛋白亚基GFl和GF2分别是78%和77%，根据该相似性分析结果确定了文蛤铁 蛋白的EST序列。e)文蛤铁蛋白基因cDNA全长序列的克隆根据与铁蛋白基因同源的EST序列设 计一对特异性引物，Fl :5’ -GCAAACATCGCACAAAA-3’ 和 Rl :5’ -CCATCATCTGGGCATC-3，。利 用引物Fl和接头引物AP (5，-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3，)进行3，末端的扩增；引物Rl和 T3(5’ -ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’ )进行5’末端的扩增。PCR产物用1. 5%琼脂糖凝胶电 泳进行检测，用胶回收试剂盒(上海生工)进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T(大 连宝生物工程有限公司)连接，参照《分子克隆第三版》(黄培堂译，科学出版社，2002年) 的方法转化大肠杆菌ToplO，挑选阳性克隆提取质粒并进行PCR检测，确认插入片段大小后 进行序列测定，测得的序列经CLUSTER分析和拼接后得到全长序列，见SEQ ID N0. 1。3，RACE 扩增25 μ 1反应体系灭菌超纯水17.25 μ cDNA模板1 μ IOxbuffer2.5 μ MgCl2 (25 mM)1.5 μ dNTP (IOmM)0.5 μ Fl (10 μΜ)1 μ AP (10 μΜ)1 μ Taq DNA Polymerase (5 u/μ )0.25 μ 扩增所用PCR反应程序94°C变性％iin，1个循环；94°C变性50s，50°C退火50s， 72°C延伸lmin,30个循环；72°C延伸IOmin, 1个循环；4°C保温。5，RACE 扩增25 μ 1反应体系:灭菌超纯水 cDNA模板 IOxbuffer MgCl2 (25 mM) dNTP (IOmM) Rl (10 μΜ) Τ3 (ΙΟμΜ)Taq DNA Polymerase (5 u/μ )17.25 μ 1 μ 2.5 μ 1.5 μ 0.5 μ 1 μ 1 μ 0.25 μ 扩增所用PCR反应程序94°C变性5min，1个循环；94°C变性30s，59°C退火30s， 72°C延伸50s, 34个循环；72°C延伸IOmin, 1个循环。实施例2.根据SEQ ID NO. 1的cDNA序列，设计特异性引物。利用引物F2 =GCC GGATCCATGGCAGATTCAAGACC 和 R2 :CGCGTCGAC TTAGGATTGCAGTTCTCTGTC,通过 PCR 技术扩增 编码铁蛋白成熟肽的基因片段，反应在MJ Research PTC-100型中进行，反应条件为首先 94°C预变性5min，然后进入下列循环94°C变性45s，50°C退火45s，72°C延伸40s，共进行 30个循环，最后72°C延伸5min。按照《分子克隆第三版》的方法将其克隆到pGEX_4T_l表 达载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经测序确认表达框与SEQ ID NO. 1的序列一致。接种 阳性克隆到LB.培养基中，37°C振荡培养至OD600O. 6-0. 8，加入ImM的IPTG诱导3h，离心 保存菌体沉淀。菌体以lmg/mL鸡蛋清溶菌酶处理30min后超声破碎500W，超声30min， 每次ls，间隔k。离心收集上清和沉淀，从包涵体中纯化目的蛋白参照Kuhelj等(Kuhelj et al. 1995)方法进行，主要步骤包括离心收集细胞，细胞沉淀加入PBS悬浮细胞，并加 入Triton X-100至终浓度为1%。超声波破碎细胞，收集沉淀。用Bufer A(50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA),0. 1% Triton X-100，pH 8.0)洗涤沉淀 2 次， 再用 Bufer B(50mmol/L Tris-HCI，5mmol/L EDTA，2mol/L urea, pH 8.0)洗涤 2 次，将洗 涤后的沉淀溶于 5mL Bufer C(0. lmol/L Tris-HCl，10mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，8mol/L urea, pH 8.0)中，37°C快摇40min，用BuferC将样品稀释到500 μ g/mL，在10倍体积透析 液(0. lmol/L Tris-HCI，5mmol/L EDTA,5mmol/L Cysteine,pH 8.0)中透析使蛋白复性，中 间换2次透析液。上述复性后的样品经过离心，用GSTrap affinity columns纯化，获得纯 化的GST-MmeFer融合蛋白(图1)。经质谱鉴定，三段序列(-RVGAGHGEWHYDRE-，-RVVLQNI QKPDRD-，-KTVNQSLLDLHKI_)与文蛤铁蛋白氨基酸序列一致，因此该重组蛋白为重组文蛤铁 蛋白(GST-Mmei^er)，用凝血酶直接在柱子上酶切掉GST 裂解过夜)，获得文蛤重组铁蛋 白(图2)，用于活性验证。透析复性后的重组产物体外活性验证根据Kim的方法(Kim et al.，2002)，将 铁蛋白在含巯基乙酸的0. IM乙酸钠的溶液(PH5. 5)中孵育18h，除去铁蛋白中的铁离 子。过量的2，2-联吡啶添加到该溶液中将铁离子螯合掉，并将该溶液在0. IM Hepes (pH 7. 0)溶液中透析，然后将20 μ g/mL铁蛋白和对照蛋白(BSA)在含有ImM硫酸亚铁铵的0. IM Hepes中室温孵育lOmin，于310nm检测，铁蛋白(20 μ g/ml)活性达到0. 476，见表1。表1重组铁蛋白吸收铁离子的活性在310nm下的吸收值，BSA为对照
权利要求
1.文蛤铁蛋白基因，其特征在于具有序列表SEQID No 1中碱基序列。
2.—种权利要求1所述文蛤铁蛋白基因编码蛋白，其特征在于具有序列表SEQ ID No 2中氨基酸序列。
3.—种权利要求1所述文蛤铁蛋白基因体外重组表达产物的应用，其特征在于文蛤 铁蛋白基因的重组表达产物可将狗2+氧化为狗3+，具有铁蛋白活性，可进
全文摘要
本发明涉及分子生物学中文蛤铁蛋白基因克隆及体外重组表达技术。本发明利用表达序列标签(EST)技术、3’和5’末端快速扩增技术(RACE)从文蛤幼虫中克隆到铁蛋白基因cDNA全长798bp，包括513bp的开放阅读框，编码171个氨基酸，5’非编码区长119bp，3’非编码区长154bp，有一个加尾信号，该基因在文蛤幼虫发育中贝壳形成方面发挥着重要作用。本发明利用体外原核重组表达技术获得了重组的文蛤铁蛋白，该蛋白具有氧化活性，可以参与调控文蛤等贝类幼虫贝壳的形成和生长，可应用于贝类苗种生产中发育调节和免疫增强。
文档编号A61P43/00GK102051363SQ20091022980
公开日2011年5月11日 申请日期2009年10月30日 优先权日2009年10月30日
发明者刘保忠, 姚学良, 张继泉, 王晓梅, 相建海 申请人:中国科学院海洋研究所