加兰他敏长效缓释注射微球组合物及其制备方法

专利名称：：加兰他敏长效缓释注射微球组合物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种注射微球组合物及制备方法，更具体地说，涉及一种可生物降解的加兰他敏长效注射缓释微球组合物及制备方法。
背景技术：
：加兰他敏属第二代竞争性胆碱脂酶抑制剂，能透过血脑屏障，使受阻碍的神经肌肉传导恢复，改善各种末梢神经肌肉障碍的麻痹状态。早期用于治疗重症肌无力，近年来发现加兰他敏可显著改善老年患者记忆，主要用于治疗轻度、中度和重度阿尔海默氏疾病(AD)，用药68周后疗效显著，本品适用于良性记忆障碍，提高患者指向记忆、联想学习、图像回忆、无意义图形再认及人像回忆等能力。对痴呆患者和脑器质性病变引起的记忆障碍亦有明显改善作用。加兰他敏的常用剂型有片剂(5mg/片)、胶囊(5mg/粒)和注射剂(lmg、2.5mg、5mg/ml)。由于加兰他敏的溶解性较差，故通常将其制成氢溴酸盐，以增加其溶解性。已研究的剂型有口服液、注射液、普通片、分散片、缓释片、胶囊剂、乳膏剂等。常用剂型的给药剂量、疗程等用法如下(胶囊、片剂)5mg/粒，4次/日；注射剂肌注或皮下注射，每次2.5-10mg，1次/日，1个疗程2-6周。因此，由于加兰他敏的生物半衰期较短，约为5小时，口服每日给药需4次，给药频繁，临床用药十分不方便，并且AD患者记忆、判断、思维能力衰退、丧失，多次给药，治疗的顺应性得不到保障，经常出现病人漏服或多服的现象。注射剂肌注或皮下给药，1次/日，疗程长，注射给药治疗不便，给患者造成较多痛苦。常规制剂如口服制剂和溶液注射剂，除了给药频繁不便之外，药物浓度峰谷现象也是个问题。据报道，由于血药浓度过高，可能过度抑制乙酰胆碱酯酶，将会引起明显的消化道及血管平滑肌等不良反应，其不良反应随着剂量的增大而加大。因此，制备加兰他敏的缓释制剂，可降低给药次数，提高病人的顺应性，减少血药波动造成的不良反应。目前加兰他敏的缓释制剂的研究，文献报道为缓释片剂，如刘玮(刘玮，平其能.氢溴酸加兰他敏缓释片的研制[J].江苏药学与临床研究，2006;14(4):215-217)以单硬脂酸甘油酯、丙烯酸树脂EudragitL100-55为主要缓释材料，制备缓释片，结果氢溴酸加兰他敏缓释片在24h内呈现良好的缓释特性。陈昂、贺芬(陈昂，贺芬.含药树脂表面修饰法制备加兰他敏口服缓释混悬液[J].中国医药工业杂志，2007，38(3):227-232)采用离子交换吸附技术，用丙烯酸树脂RS100修饰结合有氢溴酸加兰他敏的树脂表面，制成缓释混悬液，可缓释12h。口服的缓释制剂缓释时间一般为12-24h，对AD病人来说，给药次数还是较多，容易发生漏服或多服的现象。因此，相对比较，长效缓释制剂，如缓释周期达半个月至一个月的制剂，从实际治疗应用来讲，可以极大降低频率，提高了病人的治疗依从性，降低治疗成本，可很好满足AD的临床治疗需求，具有很好的应用潜力。可生物降解材料是近年来在国内外得到广泛研究和应用的新型材料，包括聚乳酸(PLA)，聚乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)等。聚乳酸系列材料为优良的长效缓释材料，具有一定的机械强度，组织相容性好，无免疫反应，在体内可生物降解为乳酸、羟基乙酸，最终降解为二氧化碳和水，因此植入或注射皮下、肌肉后无需手术取出。自日本武田制药公司采用PLGA成功研制并上市缓释1个月的醋酸亮丙瑞林长效缓释微球(商品名抑那通，LeupD印ot)以来，聚乳酸类材料在长效微球给药系统中得到了日益广泛的应用。长效缓释微球技术是药物制剂中的尖端技术，已经成为国内外制剂研发的热点。采用可生物降解材料PLGA制备注射给药的长效微球的技术手段得到广泛的认同。采用生物可降解聚合物，包裹药物制备成微球注射剂，微球的粒径大小一般在100m，以冻干粉针剂的形式分装，使用前加入灭菌注射用水或生理盐水作分散介质，轻微振摇，即可形成稳定的混悬剂，采用常规注射器皮下或肌内的途径注射给药即可，通针性好，不需要手术植入。微球经皮下、肌内注射给药后，随着材料在注射给药部位的缓慢溶蚀、生物降解，药物释放出来、吸收进入血液循环，因此吸收速度慢，并且可根据材料的聚合度、分子量、单体的比例等材料的选择来控制药物释放速度，从而可在体内起到长效缓释的给药目的。目前，尚未见加兰他敏长效缓释微球注射剂的研究报道，因此研究开发该新剂型具有很好的研究价值。长效缓释微球注射剂的制备工艺常用搅拌乳化(0/W，W/0或W/0/W)-溶剂挥发法(Emulsion-solventevaporationmethod)、喷雾干燥法(Spraydryingmethod)、超临界流体技术沉积法(SupercriticalfluidC02anti-solventmethod)等。但是这些常用微球的制备方法存在着共同的缺点之一微球的粒径不能得到很好的控制，因此微球的体积大小差异大，粒径分布宽。针对这一问题，一般方法是采用最终微球的筛选法，筛除粒径过大或过小的微球，选取合适范围的微球作为合格品，因此会造成一定程度的浪费，并且筛选后的微球分布仍让较宽，这样终产品中存在一定比例的小粒径微球。由于粒径小的微球表面积大，注射剂中小粒径微球比例过高容易造成长效缓释微球注射剂的体外、体内释放过程中的药物突释现象。如果突释过大，药物释放量过大，会造成不良反应加大。一般来讲，微球包封的药物一般为剂量小，药效强的药物，因此突释现象容易造成单日给药剂量过高，产生中毒现象。另外，常用的微球制备工艺在制备过程中不能对微球的粒径大小和分布进行较为精确地控制，这会导致微球产品的粒径大小和分布的批间差异大，药物体外、体内的释放不能得到较好的控制。因此，目前常用的微球制备方法有必要进行改革，从而达到能够均匀控制微球粒径的目的。微球的突释现象原因较多，除了粒径差异大之外，还有药物自身的溶解性、制备工艺、包封材料的质量(分子量范围、低聚物的比例)等，其中一个容易忽视的重要原因就是要根据包封药物的特点，注意采用适宜端基修饰的聚乳酸类材料，如专利(CN1723895A)报道，发明人丁平田等采用末端残基没有酯化修饰、带羧基(-C00H)的PLGA，采用传统的乳化(0/W)-溶剂挥发法，制备石杉碱甲微球，结果表明，采用末端为羧基的PLGA材料，可以提高石杉碱甲的载药量和包封率，同时体外释放表明，采用该种规格的PLGA可很好的控制微球的突释。该专利中没有分析末端带羧基的PLGA材料能够提高载药量、包封率以及降低突释的原因。其实，这跟药物自身的理化特点有关。石杉碱甲是生物碱，分子结构中的碱性基团为伯胺，极性大，因此石杉碱甲有一定的水溶性(0.8mg/ml，25°C)，因此通常采用的乳化(0/W)-溶剂挥发法的包封率低、載药量低，药物在乳剂中扩散所造成的微球表面的微孔多，因此药物突释现象严重。利用PLGA包封含有胺基基团的药物时，可以利用末端没有酯化修饰，带羧基(-C00H)材料，可以利用微球中药物和载体的相互作用，即药物的胺基跟材料的羧基形成氢键，从而可以起到稳定包封药、提高载药量、包封率。微球中药物的释放速率也由于药物跟载体材料的氢键作用而得到更好的控制。最早上市的亮丙瑞林长效缓释注射微球正是利用药物中的胺基跟材料的羧基的氢键作用，材料选用PLGA-C00H(0kadaH，One—andthree—monthreleaseinjectablemicrospheresofLH—RHs卯eragonistleuporelinacetate[J].AdvancedDrugDeliveryReview,1997，28(1):43-47)。力口兰他敏是生物碱，分子结构中的有一个叔胺，也可利用这个结构特点，提高微球的载药量、包封率和控制释放。针对石杉碱甲微球的突释问题，专利(CN1981744A)的发明人陈庆华等，通过制备方法入手，采用乳化(w/o)-溶剂挥发法制备微球，体外的释放试验表明，微球的突释得到较好的控制，但体内释药ld释放为16%，突释现象仍较明显。乳化(W/0)的方法制备微球，后续处理较为麻烦，一般不常用。该制备方法外相为玉米油等植物油，乳化剂为Span80，因此微球的清洗需要石油醚等有机溶剂，不利于微球的大规模生产制备，微球中残留的Span80乳化剂的控制也是一个值得考虑的问题。国外已经上市的长效缓释微球注射剂如醋酸亮丙瑞林微球，生产中采用的工艺为搅拌乳化(w/o/w)-溶剂挥发法，国内仿制的该品种也是采用这种生产工艺，该生产工艺通过机械搅拌作功，分散PLGA的二氯甲烷溶液，形成W/0/W，溶剂挥发后，乳滴固化，即形成微球。虽然生产工艺具有一定的生产应用价值，但采用该方法制备微球，存在着实验室制备过度到中试规模、生产规模的工艺放大难题，原因就在于随着制备规模的增大，搅拌乳化的乳化效果不容易控制。另外，该生产工艺中粒径大小和分布的取决于搅拌乳化所制备的乳滴大小和分布，但是由于机械搅拌力量分布的不均匀性，导致形成的乳滴粒径大小差异大，因此该工艺制备的微球粒径大小和分布都不易控制。针对搅拌乳化(0/W)-溶剂挥发法制备微球存在的工艺放大难题，专利发明人侯惠民等(CN2719296Y)设计制备了专门的设备可以利用该方法连续制备微球的装置，提高了生产效率，并且可以连续生产。该设备可以较好地解决乳化(0/W)-挥发法微球制备工艺的放大难题。但该装备不能对微球进行粒径大小和分布进行控制是个较大的遗憾。另一个缺点就是只适合水不溶性药物的包封，不适合水溶性药物包封采用的复乳法(w/o/w)-溶剂挥发法。振动喷嘴法(Vibratingnozzlebreakupmethod)通过喷嘴直径、高频振动和高压静电场，可以达到精确控制生产的液滴粒径大小。近几年来该法在细胞生物工程领域已成功运用到海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微囊(APA微囊)的制备来包封细胞和组织。具有生产效率高、微囊粒径大小均匀、工艺易于放大的优点。国外已有实验室、中试、生产规模的微囊仪商业化生产设备(瑞士InotechBiosystem公司，InotechEnc即sulator系列微囊仪)。但尚未有利用该法制备长效缓释注射微球的应用报道。原因在于微囊仪的设计目的是制备APA微囊，粒径大小要求为300500iim以上，而注射微球的粒径要求要小的多，平均粒径100ym左右，一般要小于200iim，否则，微球注射剂临床注射给药的通针性会受到影响。因此必须设计制备符合注射微球粒径大小要求的振动喷嘴。另外，微囊仪喷出的是海藻酸钠水溶液，而微球制备采用的是PLGA的二氯甲烷等有机溶剂或W/0初乳，两者在表面活性、黏度等方面差别显著，因此必须对振动频率、电场电压等工艺参数进行大的摸索和调整。
发明内容针对现有技术的不足，本发明需要解决的技术问题是公开一种加兰他敏长效缓释注射微球组合物的新剂型以及新的微球制备方法。本发明中所使用的加兰他敏(Galanthamine)是源于石蒜属植物雪片莲(Leucoj咖aestiv咖)的一种菲啶类生物碱，化学名为11-甲基_3-甲氧基-4a，5，9，10，11，12-六氢-6H-苯并呋喃[3a，3，2_ef][2]苯并氮杂卓_6-醇。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>本发明人针对现有的技术状况进行了深入研究，通过大量的实验结果发现，采用下述技术方案即可达到上述目的，从而完成了本发明。本发明的技术方案如下—种加兰他敏微球，包括占微球总重量5-40%的加兰他敏碱基和占总微球总重量60_95%的聚乳酸/羟基乙酸共聚物。前述的加兰他敏微球，优选的技术方案是，微球粒径为25-200iim，更加优选为50-150iim。前述的加兰他敏微球，优选的技术方案是，所述聚乳酸/羟基乙酸共聚物中乳酸(LA)与羟基乙酸(GA)的摩尔比为30:70-70:30，所述聚乳酸/羟基乙酸共聚物的分子量为5000-50000道尔顿，优选为10000-30000道尔顿。前述的加兰他敏微球，优选的技术方案是，所述聚乳酸/羟基乙酸共聚物的端基为-COOH基团。本发明还提供了一种加兰他敏长效缓释注射微球组合物，其组分和重量百分含量为加兰他敏微球60-90%，冻干支撑剂5-25%，助悬剂0.5-5%，润湿剂0.5-5%，渗透压调节剂1-25%。前述的加兰他敏长效缓释注射微球组合物，优选的方案是，所说的冻干支撑剂为甘露醇、蔗糖、海藻糖、乳糖中的一种及一种以上。前述的加兰他敏长效缓释注射微球组合物，优选的方案是，所说的助悬剂为羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素、右旋糖酐、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮中的一种以及一种以上。前述的加兰他敏长效缓释注射微球组合物，优选的方案是，所说的润湿剂为吐温80，所说的渗透压调节剂为氯化钠。本发明还提供了前述加兰他敏长效缓释注射微球组合物的制备方法，包括下述两个步骤加兰他敏微球的制备和冻干粉针剂的制备所述加兰他敏微球的制备采用振动喷嘴法结合乳化法(0/W)-溶剂挥发法，步骤如下将加兰他敏碱基、聚乳酸/羟基乙酸共聚物溶解于有机溶剂，作为分散相；采用直径为25或50iim喷嘴，振动频率2000-5000Hz，电场电压500-1500V，分散相中聚乳酸/羟基乙酸共聚物的浓度0.05-0.5g/ml，将分散相形成均匀液滴，滴加到浓度为0.l-5wt^的聚乙烯醇水溶液中，乳化，凝聚成微球，微球固化后，分离出加兰他敏微球，洗涤；所述冻干粉针的制备将助悬剂、冻干支撑剂、渗透压调节剂、润湿剂用灭菌注射H多CO'用水溶解，无菌过滤除去试剂中的细菌和杂质，作为微球注射剂的混悬剂介质，将制备的加兰他敏微球混悬于混悬剂介质中，搅拌均匀，即得微球混悬剂，混悬剂的沉降比15min大于0.8，将该混悬剂在搅拌条件下分装于西林瓶中，迅速冷冻干燥，水分含量控制在0.l-5wt^，即得最终成品。前述加兰他敏长效缓释注射微球组合物的制备方法，优选的技术方案是，在加兰他敏微球的制备中所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一种或一种以上。本发明的主要创造性贡献体现在提供一种基于加兰他敏微球的长效缓释注射剂及其制备方法，即表现在下述两个方面(1)振动喷嘴法(Vibratingnozzlebreakupmethod)制备力口兰他敏微球。该制备方法是对传统的乳化(0/W)-溶剂挥发法进行创新，通过更换不同直径大小的喷嘴，调整振动频率、电场电压、分散相中PLGA的浓度等因素，精确控制乳剂制备时的分散相的粒径，从而控制生产的乳滴粒径，最终达到控制微球粒径相对集中的目的。该法具有微球粒径大小均匀、分布范围窄的明显优势，另外，振动喷嘴法生成液滴的速度快，效率高，制备容器容易进行无菌操作，生产过程可连续进行，工艺易于放大应用等优点。本申请发明人通过大量试验发现，该法特别适用于聚合物材料的有机溶剂分散相液滴的形成。因此，本发明采用加兰他敏的碱基制备微球，而没有采用水溶性的氢溴酸盐。由于受分散相的黏度因素的限制，本申请发明人多次试图利用初乳(W/0)作为分散相，通过复乳法(W/0/W)制备水溶性药物的缓释微球没有得到较为理想的控制微球粒径的效果。因此，该制备方法适用于水难溶性药物微球的制备。本领域技术人员容易理解的，对一些水溶性有机酸碱类药物，可利用其碱基、酸基水溶性低的特点，通过振动喷嘴结合乳化(0/W)-溶剂挥发法制备这类药物的碱基或酸基的微球。(2)加兰他敏长效缓释注射微球组合物的构成。上述的加兰他敏微球可用于制备加兰他敏长效缓释注射微球，为一种灌封于西林瓶中的冻干粉针剂，其中包括治疗剂量的加兰他敏微球和助悬剂、支撑剂、润湿剂、渗透压调节剂，其优选的组分和重量百分比含量包括加兰他敏微球6090%，冻干支撑剂525%，助悬剂0.55%，润湿剂0.55%，渗透压调节剂125%。所述的助悬剂为羧甲基纤维素钠，羟丙甲纤维素，聚乙烯吡咯烷酮。所述的支撑剂为甘露醇、蔗糖、乳糖等，其主要作用是在冷冻干燥时起分散作用，防止微球之间的粘连。所述的润湿剂为吐温80，其主要作用是使微球表面容易润湿，从而使微球较好地分散在注射液中。本发明的加兰他敏长效注射缓释微球组合物可用于制备治疗阿尔海默氏综合征的药物，将微球组合物加入灭菌注射用水(注射用水的加入量为加兰他敏长效注射缓释微球组合物重量的15倍)，轻轻振摇，混匀，肌内注射给药。每半个月或一个月注射一次。微球中的加兰他敏通过扩散作用和PLGA材料的生物降解、溶蚀而释放出来，缓释时间可维持半个月或一个月。图1为实施例3制备的加兰他敏PLGA微球显微照片。图2为实施例3制备的加兰他敏PLGA微球的体外释放曲线。图3为实施例7制备的加兰他敏PLGA微球的体外释放曲线。图4为实施例3制备的加兰他敏PLGA微球的体内释放曲线。图5为实施例7制备的加兰他敏PLGA微球的体内释放曲线。具体实施例方式以下结合具体实施例来对本发明的技术特征作进一步的详细说明。但本发明不受这些具体实施例的限制。实施例中所用原料或设备均可从市场获得。其中，加兰他敏购自常州天普制药有限公司；聚乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)购自山东省医疗器械研究所；聚乙烯醇17-88，05-88购自北京有机化工厂；聚乙烯醇1750购自中国医药集团上海化学试剂采购站；二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮均购自中国医药集团济南化学试剂采购站；甘露醇购自青岛明月海藻集团有限公司；蔗糖购自山东聊城安信药用辅料有限公司；海藻糖购自武汉远城科技发展有限公司；羧甲基纤维素钠购自安徽淮南山河药用辅料有限公司；右旋糖酐购自上海华茂药业有限公司；吐温80购自青岛天力源生物科技有限公司；InotechIE50R微囊仪购自瑞士InotechBiosystem公司；振动喷嘴(孑L径25，50iim)购自瑞士InotechBiosystem公司；真空泵(厦门迈凯伦科技有限公司)；恒温水浴振荡器购自金坛市顺华仪器有限公司；透析袋(分子截留质量为8000-14400u)购自北京夏斯生物技术公司。振动喷嘴法结合乳化(0/W)-溶剂挥发法制备微球的制备(1)振动喷嘴法结合乳化(0/W)-溶剂挥发法制备微球的工艺研究主要考察振动喷嘴的孔径大小、分散相中PLGA的浓度、振动频率、电场的电压等工艺因素对微球制备的圆整性、粒径大小和分布、载药量和包封率的影响。(2)处方研究主要考察药物和载体PLGA的比例、PLGA聚合单体(LA:GA=50:50，75:25)比例等因素对微球载药量、包封率、体外释药的影响。以InotechIE50R微囊仪原型机(购自瑞士InotechBiosystem公司)为振动喷嘴法结合乳化(0/W)-溶剂挥发法制备微球的微球仪技术平台。根据仪器自身特点和乳化(0/W)-溶剂挥发法制备微球的要求，对该仪器作了以下改进(1)控制粒径大小的关键部件是振动喷嘴的直径，而生产厂家原有的喷嘴配件，直径分别为100，150，200，300iim，没有lOOym以下的振动喷嘴。现有的振动喷嘴直径过大，因此必须更换现有仪器的振动喷嘴。本申请发明人通过跟厂家联系，厂家同意根据原有喷嘴尺寸大小，提供直径分别为25，50iim的两种直径规格的振动喷嘴。(2)采用真空泵抽气，促进微球中有机溶剂的挥发。通过以上措施，InotechIE50R微囊仪改进为可以用于微球制备的设备，本发明人命名为振动喷嘴法微球仪。利用本发明的振动喷嘴法成功制备了加兰他敏PLGA微球。工艺参数控制如下振动喷嘴直径25或50iim，加兰他敏理论载药量550%(重量百分比)，分散相中PLGA的浓度550%(重量百分浓度)，振动频率20005000Hz，电场电压5001500V，可制备出粒径大小25200iim的加兰他敏PLGA微球。实施例1:振动喷嘴法制备加兰他敏PLGA微球。精密称量加兰他敏碱基约55mg，PLGA约1000mg(单体比例LA:GA50:50，分子量12000)加至5ml二氯甲烷中，涡旋使其溶解完全，作分散相。将分散相转移至20ml玻璃注射器中。采用振动喷嘴法结合乳化法(0/W)-溶剂挥发法制备微球。制备仪器采用改进的振动喷嘴法微球仪，工艺参数如下喷嘴的孔径50iim，振动频率2000Hz，电场电压500V，分散相液体的流速lml/min，使喷嘴能够产生均匀、连续的液滴，滴入取5%PVA17-88水溶液200ml的连续相中，中速磁力搅拌lh，然后低速磁力搅拌4h，减压促进有机溶剂发挥，离心收集微球，水洗、真空干燥即得。实施例2:振动喷嘴法制备加兰他敏PLGA微球。精密称量加兰他敏碱基约130mg，PLGA约1000mg(单体比例LA:GA50:50，分子量12000)加至20ml乙酸乙酯中，涡旋使其溶解完全，作分散相。将分散相转移至20ml玻璃注射器中。采用振动喷嘴法结合乳化法(0/W)-溶剂挥发法制备微球。制制备仪器采用改进的振动喷嘴法微球仪，工艺参数如下喷嘴的孔径25iim，振动频率3000Hz，电场电压1000V，分散相液体的流速2ml/min，使喷嘴能够产生均匀、连续的液滴，滴入取2%PVA17-50水溶液200ml的连续相中，中速磁力搅拌lh，然后低速磁力搅拌4h，减压促进有机溶剂发挥，离心收集微球，水洗、真空干燥即得。实施例3:振动喷嘴法制备加兰他敏PLGA微球。精密称量加兰他敏碱基约300mg，PLGA约1000mg(单体比例LA:GA50:50，分子量12000)加至10ml二氯甲烷中，涡旋使其溶解完全，作分散相。将分散相转移至20ml玻璃注射器中。采用振动喷嘴法结合乳化法(0/W)-溶剂挥发法制备微球。工艺参数如下喷嘴的孔径50iim，振动频率2000Hz，电场电压1500V，分散相液体的流速lml/min，使喷嘴能够产生均匀、连续的液滴，滴入取1.0%PVA17-88水溶液200ml的连续相中，中速磁力搅拌lh，然后低速磁力搅拌4h，减压促进有机溶剂发挥，离心收集微球，水洗、真空干燥即得。实施例3制备的微球的显微镜观察照片见说明书附图1，由图可见，采用本发明的振动喷嘴法制备加兰他敏微球，可有效控制微球粒径大小，分布集中，微球粒径集中在75150um。实施例4:振动喷嘴法制备加兰他敏PLGA微球。精密称量加兰他敏碱基约550mg，PLGA约1000mg(单体比例LA:GA50:50，分子量12000)加至5ml丙酮中，涡旋使其溶解完全，作分散相。将分散相转移至20ml玻璃注射器中。采用振动喷嘴法结合乳化法(0/W)-溶剂挥发法制备微球，工艺参数如下喷嘴的孔径25iim，振动频率3000Hz，电场电压500V，分散相液体的流速lml/min，使喷嘴能够产生均匀、连续的液滴，滴入取0.5%PVA17-88水溶液200ml的连续相中，中速磁力搅拌lh，然后低速磁力搅拌4h，减压促进有机溶剂发挥，离心收集微球，水洗、真空干燥即得。实施例5:振动喷嘴法制备加兰他敏PLGA微球。精密称量加兰他敏碱基约750mg，PLGA约1000mg(单体比例LA:GA50:50，分子量12000)加至10ml乙酸乙酯中，涡旋使其溶解完全，作分散相。将分散相转移至20ml玻璃注射器中。采用振动喷嘴法结合乳化法(0/W)-溶剂挥发法制备微球，工艺参数如下喷嘴的孔径50iim，振动频率5000Hz，电场电压IOOOV，分散相液体的流速lml/min，使喷嘴能够产生均匀、连续的液滴，滴入取0.5%PVA17-88水溶液200ml的连续相中，中速磁力搅拌lh，然后低速磁力搅拌4h，减压促进有机溶剂发挥，离心收集微球，水洗、真空干燥即得。实施例6:振动喷嘴法制备加兰他敏PLGA微球。精密称量加兰他敏碱基130约mg，PLGA约1000mg(单体比例LA:GA75:25，分子量15000)加至2ml有机溶剂(二氯甲烷lml，丙酮为lml)中，涡旋使其溶解完全，作分散相。将分散相转移至20ml玻璃注射器中。采用振动喷嘴法结合乳化法(0/W)-溶剂挥发法制备微球，工艺参数如下喷嘴的孔径50iim，振动频率3000Hz，电场电压1000V，分散相液体的流速0.5ml/min，使喷嘴能够产生均匀、连续的液滴，滴入取5%PVA17-88水溶液300ml的连续相中，中速磁力搅拌lh，然后低速磁力搅拌4h，减压促进有机溶剂发挥，离心收集微球，水洗、干燥即得。实施例7:振动喷嘴法制备加兰他敏PLGA微球。精密称量加兰他敏碱基300约mg，PLGA约1000mg(单体比例LA:GA75:25，分子量15000)加至10ml二氯甲烷中，涡旋使其溶解完全，作分散相。将分散相转移至20ml玻璃注射器中。采用振动喷嘴法结合乳化法(0/W)-溶剂挥发法制备微球，工艺参数如下喷嘴的孔径50iim，振动频率3000Hz，电场电压1500V，分散相液体的流速lml/min，使喷嘴能够产生均匀、连续的液滴，滴入取1%PVA05-88水溶液300ml的连续相中，中速磁力搅拌lh，然后低速磁力搅拌4h，减压促进有机溶剂发挥，离心收集微球，水洗、干燥即得。实施例8:振动喷嘴法制备加兰他敏PLGA微球。精密称量加兰他敏碱基550约mg，PLGA约1000mg(单体比例LA:GA75:25，分子量15000)加至5ml二氯甲烷中，涡旋使其溶解完全，作分散相。将分散相转移至20ml玻璃注射器中。采用振动喷嘴法结合乳化法(0/W)-溶剂挥发法制备微球，工艺参数如下喷嘴的孔径25iim，振动频率2000Hz，电场电压500V，分散相液体的流速lml/min，使喷嘴能够产生均匀、连续的液滴，滴入取2%PVA17-88水溶液300ml的连续相中，中速磁力搅拌lh，然后低速磁力搅拌4h，减压促进有机溶剂发挥，离心收集微球，水洗、干燥即得。实施例9:加兰他敏长效缓释微球注射剂的制备(缓释周期半个月)。处方组成(以100个剂量计)加兰他敏碱基15gPLGA(单体比例LA:GA50:50，分子量12000)50g甘露醇20g羧甲基纤维素钠1.5g氯化钠1.5g吐温800.5g制备工艺按照实施例3所述方法制备微球。将甘露醇、羧甲基纤维素钠、氯化钠和吐温80用灭菌注射用水溶解，O.22Pm微孔滤膜无菌过滤除去试剂中的细菌和杂质，作为微球注射剂的混悬剂基质。将微球混悬于混悬剂基质中，搅拌均匀，即得微球混悬剂。将该混悬剂在搅拌条件下分装于10ml西林瓶中，同时迅速冷冻，将冷冻好的样品置于冷冻干燥机中，加上冻干胶塞，冷冻干燥72h，水分含量符合要求，铝盖密封，即得最终成品。实施例10:加兰他敏长效缓释微球注射剂的制备(缓释周期半个月)。处方组成(以100个剂量计)加兰他敏碱基15gPLGA(单体比例LA:GA50:50，分子量12000)50g海藻糖25g羧甲基纤维素钠1.5g氯化钠2g吐温800.5g制备工艺按照实施例3所述方法制备微球。将甘露醇、羧甲基纤维素钠、氯化钠和吐温80用灭菌注射用水溶解，O.22Pm微孔滤膜无菌过滤除去试剂中的细菌和杂质，作为微球注射剂的混悬剂基质。将微球混悬于混悬剂基质中，搅拌均匀，即得微球混悬剂。将该混悬剂在搅拌条件下分装于10ml西林瓶中，同时迅速冷冻，将冷冻好的样品置于冷冻干燥机中，加上冻干胶塞，冷冻干燥72h，水分含量符合要求，铝盖密封，即得最终成品。实施例11:加兰他敏长效缓释微球注射剂的制备(缓释周期半个月)。处方组成(以100个剂量计)加兰他敏碱基15gPLGA(单体比例LA:GA50:50，分子量12000)50g蔗糖40g羧甲基纤维素钠5g氯化钠1.5g吐温801.5g制备工艺按照实施例3所述方法制备微球。将甘露醇、羧甲基纤维素钠、氯化钠和吐温80用灭菌注射用水溶解，O.22Pm微孔滤膜无菌过滤除去试剂中的细菌和杂质，作为微球注射剂的混悬剂基质。将微球混悬于混悬剂基质中，搅拌均匀，即得微球混悬剂。将该混悬剂在搅拌条件下分装于10ml西林瓶中，同时迅速冷冻，将冷冻好的样品置于冷冻干燥机中，加上冻干胶塞，冷冻干燥72h，水分含量符合要求，铝盖密封，即得最终成品。实施例12:加兰他敏长效缓释微球注射剂的制备(缓释周期1个月)。处方组成(以100个剂量计)加兰他敏碱基15gPLGA(单体比例LA:GA75:25，分子量15000)50g甘露醇20g右旋糖酐1.5g氯化钠1.5g吐温800.5g制各工艺按照实施例7所述方法制备微球。将甘露醇、羧甲基纤维素钠、氯化钠和吐温80用灭菌注射用水溶解，O.22Pm微孔滤膜无菌过滤除去试剂中的细菌和杂质，作为微球注射剂的混悬剂基质。将微球混悬于混悬剂基质中，搅拌均匀，即得微球混悬剂。将该混悬剂在搅拌条件下分装于10ml西林瓶中，同时迅速冷冻，将冷冻好的样品置于冷冻干燥机中，加上冻干胶塞，冷冻干燥72h，水分含量符合要求，铝盖密封，即得最终成品。实施例13:加兰他敏长效缓释微球注射剂的制备(缓释周期1个月)。处方组成(以100个剂量计)加兰他敏碱基15gPLGA(单体比例LA:GA75:25，分子量15000)50g蔗糖25g羧甲基纤维素钠1.5g氯化钠1.5g吐温800.5g制备工艺按照实施例7所述方法制备微球。将甘露醇、羧甲基纤维素钠、氯化钠和吐温80用灭菌注射用水溶解，O.22Pm微孔滤膜无菌过滤除去试剂中的细菌和杂质，作为微球注射剂的混悬剂基质。将微球混悬于混悬剂基质中，搅拌均匀，即得微球混悬剂。将该混悬剂在搅拌条件下分装于10ml西林瓶中，同时迅速冷冻，将冷冻好的样品置于冷冻干燥机中，加上冻干胶塞，冷冻干燥72h，水分含量符合要求，铝盖密封，即得最终成品。实验例1:HPLC-UV法测定加兰他敏微球的载药量和包封率。色谱条件ShimpackODSC18柱(150mmX5mm，5ym);流动相甲醇-水-冰醋酸(75:925:10);UV检测波长:289nm;流速1.Oml/min;进样量:20。在此色谱条件下，加兰他敏保留时间为6.7min，理论板数按加兰他敏峰计算为1800。含量测定方法精密称取加兰他敏微球适量(约含加兰他敏5mg)置10ml量瓶中，加乙腈2ml，涡旋至溶解，用甲醇定容，摇匀。用0.22iim尼龙滤膜过滤，取续滤液以流动相稀释10倍，离心(17000Xg)10min后，取上清液20ia进样，HPLC法测定含量。载药量和包封率的计算载药量(％)=(微球中所含药物质量)/(微球的总质量)X100X包封率(％)=(微球的实际载药量)/(微球的理论载药量)X100%实验结果和讨论实施例18微球的载药量和包封率测定结果见表1。由表1可以发现，两种不同单体比例的PLGA材料，对加兰他敏的载药量、包封率没有明显差另lj。随着理论载药量的升高，微球的包封率逐渐降低，由最高的93.2%降低至68.1%。理论载药药量为23%时，包封率仍可保持较高的水平，86.7%，符合药典对微粒制剂指导原则中的包封率要求。表1加兰他敏长效缓释微球的载药量和包封率测定<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实验例2:加兰他敏微球的微球体外释药试验。实验方法精密称取加兰他敏微球适量(约含加兰他敏10mg)，置透析袋中，加入0.Olmol/L生理等渗磷酸盐缓冲液(pH7.4，含有0.02%NaN3，0.1%吐温80)0.5ml以分散微球，然后将透析袋置O.Olmol/L生理等渗磷酸盐缓冲液(pH7.4)50ml中，在37。C恒温摇床中，50次/min，振摇距离4cm/次，定时更换全部介质，释放液经0.22ym微孔滤膜过滤，取续滤液20ii1进样测定，HPLC-UV法测定溶出介质中药物含量。实验结果和讨论实施例3所述微球的体外释药曲线见说明书附图2，由图可见，实施例3的微球体外释放较为恒定，ld释放10.1%，没有突释现象，7d释放52.3%，14d释放92.1%，微球可持续释放达14d。实施例7所述微球的体内释药曲线见附图3，由图可见，实施例7的微球体外释放较为恒定，ld释放8.3%，没有突释现象，14d释放45.1%，28d释放89.6%，微球可持续释放达30d。实验例3:加兰他敏微球的微球体内释药试验。试验目的考察该制剂在动物体内的释放性能。试验样品根据本发明实施例3和7所述的方法制备的加兰他敏长效缓释微球。试验动物SD大鼠，36只，雌雄各半，随机分成6组，每组6只。试验方法将加兰他敏微球注入大鼠腹部皮下，于不同的时间间隔小心切取注射部位的微球和肌肉组织，匀浆化后测定残留的药量，间接反映微球的体内释药速度。精密称取微球适量置安瓿中，用含O.5%羧甲纤维素钠和0.1%吐温80的灭菌注射用水溶液混悬。每只大鼠于腹部皮下注射O.5ml(相当于12mg)。同时用适量乙腈溶解注射器及安瓿中残余的微球，测定残余的药量，计算实际给药量。取样方法和时间点大鼠回笼饲养，分别于注射微球后d1、3、5、7、10、14(实施例3所述的微球)，d1、7、14、21、35(实施例7所说的微球)处死1组，剖开注射部位的表皮，小心取下微球及周围组织，冷冻后切成薄片，置玻璃匀浆器中，加乙腈-水(9:1)2ml，反复研磨5min，用流动相稀释至10ml，涡旋混匀，离心(17000Xg)10min后，取上清液50y1进样，HPLC-UV法测定样品中加兰他敏的含量。实验结果和讨论实施例3所述的微球的体内释药曲线见说明书附图4。由图可见，实施例3所述的微球的体内释放较为恒定，ld释放12.1%，7d释放58.3%，14d释放94.7%以每日6.6%的释药速度几乎释完全部药物。这种释药模式和周期作为缓释半个月的加兰他敏缓释注射剂是较合理的。实施例7所述的微球的体内释药曲线见说明书附图5。由图可见，实施例7所述的微球的体内释放较为恒定，ld释放10.4%，没有明显的突释现象。14d释放52.1%，28(1释放86.1%。以每日3.1%的释药速度几乎释完全部药物。这种释药模式和周期作为加兰他敏缓释一个月的注射剂是较合理的。实验例4:加兰他敏长效缓释注射微球药效学实验。实验目的采用东莨菪碱所致大鼠记忆获得障碍模型验证加兰他敏长效缓释注射微球对大鼠改善学习记忆作用。实验动物SD大鼠40只，雌雄不限。药品和仪器氢溴酸东莨菪碱注射液(上海禾丰制药有限公司，规格0.3mg:lml);氢溴酸加兰他敏注射液(上海旭东海普药业有限公司，规格lmg:lml);加兰他敏长效缓释微球注射剂(实施例3，微球实际载药量20.05%)。实验方法Morris水迷宫方法的建立采用文献方法(段新，马光瑜.纳洛酮与加兰他敏对东莨菪碱所致大鼠空间工作记忆障碍的干预效果[J].中国临床康复，2005;9(16):110-111.段新，马光瑜.纳洛酮改善东莨菪碱所致大鼠空间工作记忆障碍的神经机制研究[J].精神疾病与精神卫生，2004;4(6):413-413.)。通过训练每只大鼠表现呈现稳定。给药方法对SD大鼠随机分为正常对照组、东莨菪碱组、加兰他敏注射液组治疗组、加兰他敏长效缓释注射微球治疗组。每组10只。给药剂量和给药途径东莨菪碱按0.4mg/kg，腹腔注射给药，每日给药一次，连续给药14天；加兰他敏注射液按2mg/kg，腹腔注射给药，每日给药一次，连续给药14天；正常对照组给予等体积生理盐水，每日给药一次，连续给药14天；加兰他敏长效缓释注射微球按28mg/kg，精称微球，混悬剂混悬，腹部皮下注射给药，于0d给药1次。实验记录和主要观察指标于ld，7d，14d，16d，20d给药后开始水迷宫延缓性匹配作业，记录每只大鼠的逃避潜伏期，数据t检验统计分析。实验结果结果表明，在对由东莨菪碱所致的大鼠记忆获得障碍模型试验中，加兰他敏长效缓释微球注射剂对大鼠记忆获得障碍模型有显著疗效，药效强度与常规加兰他敏注射液(相同剂量，每日给药一次)相当。加兰他敏长效缓释微球注射剂给药ld即显效，此作用可维持至16d，20d作用消失。药效学试验结果表明，加兰他敏长效缓释注射剂具有明显的药物缓释、药效长效作用。权利要求一种加兰他敏微球，其特征在于，包括占微球总重量5-40％的加兰他敏碱基和占总微球总重量60-95％的聚乳酸/羟基乙酸共聚物。2.根据权利要求1所述的加兰他敏微球，其特征在于，微球粒径为25-200ym，优选为50-150iim。3.根据权利要求l所述的加兰他敏微球，其特征在于，所述聚乳酸/羟基乙酸共聚物中乳酸(LA)与羟基乙酸(GA)的摩尔比为30:70-70:30，所述聚乳酸/羟基乙酸共聚物的分子量为5000-50000道尔顿，优选为10000-30000道尔顿。4.根据权利要求3所述的加兰他敏微球，其特征在于，所述聚乳酸/羟基乙酸共聚物的端基为-COOH基团。5.—种加兰他敏长效缓释注射微球组合物，其特征在于，组分和重量百分含量为加兰他敏微球60-90%，冻干支撑剂5-25%，助悬剂0.5-5%，润湿剂0.5_5%，渗透压调节剂1-25%。6.根据权利要求5所述的加兰他敏长效缓释注射微球组合物，其特征在于，所说的冻干支撑剂为甘露醇、蔗糖、海藻糖、乳糖中的一种及一种以上。7.根据权利要求5所述的加兰他敏长效缓释注射微球组合物，其特征在于，所说的助悬剂为羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素、右旋糖酐、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮中的一种以及一种以上。8.根据权利要求5所述的加兰他敏长效缓释注射微球组合物，其特征在于，所说的润湿剂为吐温80，所说的渗透压调节剂为氯化钠。9.权利要求5-8任一所述加兰他敏长效缓释注射微球组合物的制备方法，其特征在于，包括下述两个步骤加兰他敏微球的制备和冻干粉针剂的制备所述加兰他敏微球的制备采用振动喷嘴法结合乳化法(0/W)-溶剂挥发法，步骤如下将加兰他敏碱基、聚乳酸/羟基乙酸共聚物溶解于有机溶剂，作为分散相；采用直径为25或50iim喷嘴，振动频率2000-5000Hz，电场电压500-1500V，分散相中聚乳酸/羟基乙酸共聚物的浓度0.05-0.5g/ml，将分散相形成均匀液滴，滴加到浓度为0.l-5wt^的聚乙烯醇水溶液中，乳化，凝聚成微球，微球固化后，分离出加兰他敏微球，洗涤；所述冻干粉针的制备将助悬剂、冻干支撑剂、渗透压调节剂、润湿剂用灭菌注射用水溶解，无菌过滤除去试剂中的细菌和杂质，作为微球注射剂的混悬剂介质，将制备的加兰他敏微球混悬于混悬剂介质中，搅拌均匀，即得微球混悬剂，混悬剂的沉降比15min大于0.8，将该混悬剂在搅拌条件下分装于西林瓶中，迅速冷冻干燥，水分含量控制在0.l-5wt%，即得最终成品。10.权利要求9所述加兰他敏长效缓释注射微球组合物的制备方法，其特征在于，在加兰他敏微球的制备中所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一种或一种以上。全文摘要本发明公开了一种加兰他敏微球，包括占微球总重量5-40％的加兰他敏碱基和占总微球总重量60-95％的聚乳酸/羟基乙酸共聚物。本发明还提供了一种加兰他敏长效缓释注射微球组合物，其组分和重量百分含量为加兰他敏微球60-90％，冻干支撑剂5-25％，助悬剂0.5-5％，润湿剂0.5-5％，渗透压调节剂1-25％。本发明采用振动喷嘴法结合乳化法(O/W)-溶剂挥发法，其具有生成液滴的速度快，效率高，制备容器容易进行无菌操作，生产过程可连续进行，工艺易于放大应用等优点。文档编号A61K9/16GK101703482SQ20091023029公开日2010年5月12日申请日期2009年11月20日优先权日2009年11月20日发明者冯润良,刘善奎,王海龙,王芳,谭晓军申请人:济南大学