抗CCR5的afucosylated抗体及其用途的制作方法

专利名称：抗CCR5的afucosylated抗体及其用途的制作方法
抗CCR5的afucosy Iated抗体及其用途本发明涉及抗CCR5的afucosylated抗体、生产所述抗体的方法、包含所述抗体的 药物组合物，及所述抗体在治疗炎症病况(例如急性和慢性移植排斥)中的用途。
背景技术：
已知趋化因子及其受体通过介导白细胞运输参与同种异体移植排斥。Panzer， U.等人(Transplantation 78(2004) 1341-50)报导过在急性人同种异体移植排斥中 的 CCR5 阳性 T 细胞募集，Luckow，B.等人(Eur. J. Immunol. 34 (2004) 2568-78)在 CCR5 缺乏的动物中观察到移植物内金属蛋白酶水平的降低和动脉硬化。另外，Gao，W.等 人(Transplantation 72(2001) 1199-1205)证明，在用CCR5特异性单克隆抗体处理 的小鼠和CCR5缺乏的小鼠中具有延长的同种异体移植存活。Schroeder，C.等人， J. Immunol. 179 (2007) 2289-2299 探讨了一种 CCR5 拮抗剂在食蟹猴(cynomolgus)心脏同种 异体移植模型中的作用以研究在炎症和同种异型免疫中的CCR5调节。此外，一个在人移植 受体同龄群组中的回顾性研究揭示CCR5缺乏患者(δ 32)显示了延长的同种异体移植存活 (Fischereder, Μ.，等人，Lancet 357 (2001) 1758-1761)。在实验模型中，由于受体-配体相互作用的冗余性，单种趋化因子的缺乏或阻断不 能保护同种异体移植免受急性排斥(Fischereder，M.，等人，Lancet 357(2001) 1758-1761 ； Gao, W.，等人，Transplantation 72(2001) 1199-1205 ；Hancock, W. W.，等人，Curr. Opin. Immunol. 12(2000)511-516 ；Hancock, W. W.，等人，Curr. Opin. Immunol. 15(2003)479-486)。WO 01/78707涉及抑制移植排斥的方法，所述方法包含施用CCR5功能的拮抗剂。单克隆抗体经细胞介导的效应子功能可通过改造其寡糖组分而增强，如Umana， P.，等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 和 US6, 602, 684 所述。在癌症免疫 治疗中最广泛使用的IgGl型抗体是在每个CH2结构域的Asn297具有保守的N-连接 的糖基化位点的糖蛋白。Asn297连接的2个复杂双触角寡糖埋藏在CH2结构域之间， 和多肽骨架形成广泛的接触，它们的存在对抗体介导的效应子功能(例如抗体依赖性 细胞毒作用(ADCC))是必需的(Lifely，Μ. R.，等人，Glycobiology 5 (1995) 813-822 ； Jefferis, R.,等人，Immunol. Rev. 163(1998)59—76 ；Wright, Α.禾口 Morrison，S. L. ，Trends Biotechnol.15(1997)26-32)。Umana, P.,等人，Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180 和TO 99/54342显示了在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中过表达β (1,4)-N-乙酰氨基葡 萄糖转移酶III (“ GnTIII")，一种催化分叉的寡糖形成的糖基转移酶，显著增加了抗 体在体外的ADCC活性。Ν297的糖组成的改变或消除也影响其与Fc γ R和Clq的结合 (Umana, P.，等人，Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180 ；Davies, J.，等人，Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294 ；Mimura, Y.，等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547 ； Radaev, S.，等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483 ；Shields, R. L.，等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ；Shields, R. L.，等人，J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740 ； Simmons, L. C.，等人，J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147)。Iida, S.，等人，Clin. Cancer Res. 12 (2006) 2879-2887 显示，加入岩藻糖基化抗 ⑶20抗体可抑制非岩藻糖基化抗⑶20抗体的效力。1 9的(10yg/ml)非岩藻糖基化
4和岩藻糖基化抗CD20抗体混合物的效力低于1，000倍(0. 01 μ g/ml)稀释的单独非岩藻 糖基化抗CD20抗体的效力。他们推断非岩藻糖基化IgGl (不包括岩藻糖基化相似物)通 过其与Fc γ RIIIa的高度结合可躲避血浆IgG对ADCC的抑制作用。Natsume，Α.，等人，在 J. Immunol. Methods 306(2005)93-103中显示，去除人IgGl型抗体的复杂型寡糖中的岩藻 糖导致抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的强烈增强。Satoh，Μ.，等人，Expert Opin. Biol. Ther. 6 (2006) 1161-1173讨论了将非岩藻糖基化的治疗抗体作为下一代治疗抗体。Satoh 的结论是，认为仅包含非岩藻糖基化的人IgGl形式的抗体是理想的(治疗抗体)。Kanda, Y.，等人，Bioteehnol. Bioeng. 94(2006)680-688 比较了岩藻糖基化抗 CD20 抗体(96%岩 藻糖基化，CH0/DG441H5)和非岩藻糖基化抗CD20抗体。Davies, J.，等人，Bioteehnol. Bioeng. 74(2001) 288-294报导，就抗CD20抗体而言，增加的ADCC和增加的FcyRIII结合 相关。增强单克隆抗体的细胞介导的效应子功能的方法已被描述于例如WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700、WO 2004/065540、WO 2005/011735、WO 2005/027966,WO 1997/028267,US 2006/0134709,US 2005/0054048,US 2005/0152894、WO 2003/035835 和 WO 2000/061739 中。发明概述本发明包含与CCR5结合并在Asn297被糖链糖基化的抗体，所述抗体其特征在于， 在所述糖链中的岩藻糖量为65%或更低。本发明包含与CCR5结合并在其Asn297被糖链糖基化的抗体，所述抗体其特 征在于，在所述糖链中的岩藻糖量在一个实施方案中为5-65%，在另一个实施方案中为 20-40% ο根据本发明，包含这些岩藻糖量的所述抗体被进一步称为afucosylated。本发明包含与CCR5结合并在其Asn297被糖链糖基化的抗体，所述抗体其特征在 于，显示了与Fc γ RIII的高结合亲和力。在一个实施方案中抗体为人IgGl或IgG3型。在另一个实施方案中，在所述糖链中的NGNA量为或更少，和/或N-端α_1， 3_半乳糖量为或更少。在另一个实施方案中，NGNA量为0.5%或更少，在另一个实施方案中，为0. 或 更少，在另一个实施方案中甚至检测不到(LCMS)。在一个实施方案中，在所述糖链中的N-端α -1，3-半乳糖量为0. 5 %或更少，在另 一个实施方案中，为0. 或更少，在另一个实施方案中甚至检测不到(LCMS)。在一个实施方案中与CCR5结合的抗体为T细胞表位消除的抗体，或单特异性的四 价抗体，或多特异性抗体。所述糖链显示的特征在于，连接于结合CCR5的抗体Asn297的N-连接的聚糖在 CHO细胞中重组表达。本发明包含与CCR5结合的afucosylated抗体，其特征在于所述抗体与人CCR5结 合并阻断其功能，从而在体外和体内消耗CCR5+T细胞。根据本发明的抗体显示对需要抑制移植排斥的患者有益。抗体在一个实施方案中为单克隆抗体，在另一个实施方案中为嵌合抗体(人恒定链)或人源化抗体，或在另一个实施方案中为人抗体。本发明还包含药物组合物，其包含根据本发明的抗体，任选地还包含对药用的抗 体制剂有用的缓冲液和/或佐剂。本发明还包含药物组合物，其包含本发明的抗体。本发明还提供药物组合物，其包含本发明的抗体和可药用的载体。在一个实施方 案中，药物组合物可包含于制品或试剂盒中。本发明还提供了根据本发明的抗体在制备用 于治疗移植排斥的药物组合物中的用途。抗体以药物有效量使用。本发明还包含根据本发明的抗体在制备用于预防同种异体移植排斥和炎症和免 疫介导性疾病的药物组合物中的用途。在一个实施方案中，所述疾病为类风湿关节炎(RA)、 或慢性阻塞性肺疾病(COPD)、或肉芽肿性结肠炎和局限性肠炎(克罗恩氏病)。抗体以药 物有效量使用。本发明还包含生产根据本发明的重组人抗体的方法，其特征在于，在CHO宿主细 胞中表达编码与CCR5结合的抗体的核酸(该细胞将所述抗体以根据本发明的量岩藻糖基 化)，并从所述细胞中回收所述抗体。本发明还包含通过此重组方法可获得的抗体。本发明还包含CHO细胞，该细胞能够重组表达β (1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 III (GnTIII)，任选的也表达甘露糖苷酶(ManII)和抗CCR5抗体。该CHO细胞为用如下所 述DNA序列转化的CHO细胞第1条DNA序列，其编码具有GnTIII活性的多肽，任选的具 有ManII活性的多肽；第2条DNA序列，其至少编码抗CCR5抗体的重链可变结构域；第3条 DNA序列，其至少编码抗CCR5抗体的轻链可变结构域。在一个实施方案中，第2和第3条 DNA序列编码人IgGl型抗CCR5抗体的重链和轻链。本发明还包含生产显示根据本发明性能的抗CCR5抗体的方法，包含以下步骤在 宿主细胞(优选的为CHO细胞)中转化编码具有GnTIII活性的多肽的第1条DNA序列，至 少编码抗CCR5抗体重链可变结构域的第2条DNA序列，和至少编码抗CCR5抗体轻链可变 结构域的第3条DNA序列，在发酵培养基中培养所述宿主细胞(在一个实施方案中，所述细 胞独立表达所述第1、2和3条DNA序列，这是在所述宿主细胞分泌所述抗体至发酵培养基 的条件下)，并从发酵培养基中分离所述抗体。本发明还涉及在哺乳动物(包括人)中治疗或预防急性和慢性器官移植排斥(同 种异体移植、异种移植)的方法，包含对所述哺乳动物施用根据本发明的抗CCR5抗体。发明详述术语“CCR5”表示人趋化因子受体(见例如Swiss Prot P51681和Mueller，Α.， 和 Strange, P. G.，Int. J. Biochem. Cell Biol. 36(2004)35-38)。术语 “CCR5 抗体”意为抗 CCR5 的抗体(antibody against CCR5)，抗 CCR5 抗体(anti_CCR5antibody)。术语“抗体”包含抗体的多种形式，包括但不限于整个抗体、抗体片段、人抗体、人 源化抗体和基因工程抗体，只要保留根据本发明的特征性能。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般至少为抗原结合部分或其可变区。抗体 片段的实例包括双抗体、单链抗体分子、缀合物例如免疫毒素和包含抗体片段的多特异性 抗体。此处使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有单一氨基酸组成的 抗体分子的制品。相应的，术语“人单克隆抗体”指展示单一结合特异性的抗体，其具有来
6源于人种系免疫球蛋白序列的可变框架区和恒定区。术语“嵌合抗体”指单克隆抗体，其包含来自一种来源或种的可变区(即结合区) 和来自另一种来源或种的至少一部分恒定区，通常由重组DNA技术制备。特别优选的，嵌合 抗体包含鼠可变区和人恒定区。这些鼠/人嵌合抗体为免疫球蛋白基因的表达产物，所述 基因包含编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段。本 发明包含的“嵌合抗体”的其他形式为和原始抗体相比其中类或亚类被修饰或改变的形式。 这些“嵌合”抗体也被称作“类别转换抗体”。制备嵌合抗体的方法涉及目前领域内熟知的 传统重组DNA技术和基因转染技术。见例如Morrison，S. L.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984)6851-6855，US 5，202，238 和 US 5,204,244。术语“人源化抗体”指其框架区(FRs)和/或“互补决定区”(CDRs)被修饰以包含 和亲本免疫球蛋白相比具不同特异性的免疫球蛋白CDR的抗体。在一个实施方案中，鼠类 ⑶R被移植入人抗体的框架区以制备“人源化抗体”。见例如Riechmarm，L.，等人，Nature 332(1988)323-327 ；和 Neuberger，M.S.，等人，Nature 314(1985)268-270。具体的，CDRs 对应于识别就嵌合和双功能抗体在此处指出的抗原的代表序列。在一个实施方案中所述抗 原为CCR5的表位。如此处所使用的，术语“人抗体”旨为包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列 的可变和恒定区的抗体。可变重链区在一个实施方案中来源于种系序列DP-50 (GenBank L06618)且可变轻链区来源于种系序列L6(GenBank X01668)，或可变重链区来源于 DP-61 (GenBank M99682)且可变轻链区来源于种系序列L15 (GenBank K01323)。抗体恒定区 为人IgGl型恒定区。这些区域可为异型的，在例如Johnson，G.和Wu，T. Τ.，NucleicAcids Res. 28 (2000) 214-218和其中的参考数据库所描述，术语“重组人抗体”指具有重排形式的来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒 定区的抗体。根据本发明的重组人抗体经受了体内的体细胞高变。因此，尽管来源于人种 系VH和VL序列并与其有关，重组抗体可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)的氨基酸序列 可能并不自然存在于体内的人抗体种系库中。如此处所使用的，术语“结合”指抗体以约10_13至10_8M(KD)的亲和力与CCR5结 合，在一个实施方案中为约10_13至10_9M。如此处所使用的，术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可为 单链或双链的，但优选的为双链DNA。具有IgGl或IgG3型的人恒定区详细描述于Kabat，等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)，Bruggemann, Μ.，等人，J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 和 Love，Τ. W.，等人，MethodsEnzymol. 178(1989)515-527。实例显示于 SEQ ID N0:01 至 03。人IgGl、IgG2或IgG3型恒定区在Asn297糖基化。根据本发明的“Asn297”意为位 于Fc区域的约297位的氨基酸天冬酰胺；基于抗体的细微序列变化，Asn297也可位于297 位上游或下游若干氨基酸，通常不超过+3个氨基酸，即，294位和300位之间。如此处所使用的，术语“可变区”(轻链(VL)可变区和重链(VH)可变区)表示成 对的轻链和重链结构域的每个成员，其直接参与抗体和抗原的结合。人轻和重链的可变区 具有相同的一般结构，各自包含4个序列广泛保守的“框架区”(FR)，由3个“高变区”(或互补决定区，⑶Rs)连接。框架区采用β-折叠构象，⑶Rs可能形成环以连接β-折叠结 构。每条链的CDRs通过框架区维持其三维结构，并和其他链的CDRs共同形成抗原结合位 点。抗体重和轻链可变区的CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和力中特别重 要，因此提供了本发明的另一个方面。此处使用的术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指抗体用于抗原结合的氨 基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“⑶Rs”的氨基酸残基。“框架区”或“FR”区 为如此处定义的高变区残基以外的可变结构域区域。因此，抗体的轻和重链从N-到C-端 包含结构域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别的，重链的CDR3是在抗原结合 中贡献最大并表征抗体的区域。CDR和FR区根据Kabat，等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)中的标准定义确定，并且/或为组成“高变环”的残基。术语“表位”表示能够与抗体特异结合的蛋白质决定簇。表位通常由化学活性的 表面分子基团例如氨基酸或糖侧链组成，并通常具有特异的三维结构特征和特异的电荷特 征。构象和非构象表位的区别是，(抗体)与前者而不是后者的结合在变性剂的存在下消 失。抗体A(DSM ACC 2683)与包含在CCR5ECL2结构域上的氨基酸的表位结合(Lee， B.，等人，J. Biol. Chem. 274 (1999) 9617-9626)，该表位不同于抗体2D7识别的表位(2D7与 ECL2A的K171和E172氨基酸结合，而非ECL2B的184-189位氨基酸)。已发现抗体A的表位 结合对于CCR5突变体K171A或E172A (如果Glul72突变为Ala)为20%。对于野生型CCR5 的表位结合被定义为100%。由此本发明的另一个实施方案为与CCR5结合的afucosylated 抗体，并且其结合于和抗体A相同的表位。结合抑制可通过sra测定检测，使用固定化的 浓度为20-50nM的抗体A和CCR5，以及浓度为IOOnM的待检测抗体。50%或更多的信号降 低显示上述抗体和抗体A竞争。表位结合也可使用CCR5的丙氨酸突变研究，根据Olson， W. C.，等人，J. Virol. 73(1999)4145-4155描述的用于表位作图的方法。75%或更多的信号 降低显示突变的氨基酸贡献于所述抗体的表位。如果贡献于待研究抗体表位的一或多个氨 基酸和贡献于抗体A表位的一或多个氨基酸相同，可知二者结合于相同表位。在一个实施 方案中，根据本发明的抗体和CCR5的ECL2结构域结合。优选的根据本发明的CCR5抗体的氨基酸序列在WO 2006/103100和WO 2008/037419 中描述。本发明包含与CCR5结合的afucosylated抗体，其特征在于所述抗体的可变重链 氨基酸序列CDR3选自重链CDR3序列SEQ ID NO 04或05。所述抗体在一个实施方案中的特征在于，包含SEQ ID NO :06的⑶Rs作为重链 CDRs 和 SEQ ID NO 07 的 CDRs 作为轻链 CDRs, SEQ IDNO 08 的 CDRs 作为重链 CDRs 和 SEQ ID NO 09 的 CDRs 作为轻链 CDRs, SEQ ID NO 10 的 CDRs 作为重链 CDRs 和 SEQ ID NO 11 的 CDRs 作为轻链 CDRs，SEQ ID NO 12 的 CDRs 作为重链 CDRs 和 SEQ ID NO 13 的 CDRs 作为轻链⑶Rs，SEQ ID NO 14的⑶Rs作为重链⑶Rs和SEQ ID NO 15的⑶Rs作为轻链 CDRs, SEQ ID NO 16 的 CDRs 作为重链 CDRs 和 SEQ ID NO 19 的 CDRs 作为轻链 CDRs, SEQ ID NO 16 的 CDRs 作为重链 CDRs 和 SEQ ID NO 20 的 CDRs 作为轻链 CDRs, SEQID NO 17 的 CDRs 作为重链 CDRs 和 SEQ ID NO 19 的 CDRs 作为轻链 CDRs，SEQ ID NO 17 的 CDRs 作为
8重链 CDRs 和 SEQ ID NO 20 的 CDRs 作为轻链 CDRs, SEQ ID NO 18 的 CDRs 作为重链 CDRs
和SEQID NO 19的CDRs作为轻链CDRs，或者SEQ ID NO 18的CDRs作为重链CDRs和SEQ
ID NO20 的 CDRs 作为轻链 CDRs。本发明的另一个实施方案包含与CCR5结合的afucosylated抗体，其特征在于重 链可变区包含以下通式的氨基酸序列Gln-Val-Gln-Leu-X01-X02-Ser-Gly-Pro-Gly-Leu-Val-X03-Pro-Ser-Gln-Ser-Leu-Ser-Ile-Thr-Cys-Thr-Val-Ser-Gly-Phe-Pro-Leu-Gly-Ala-Phe-Gly-Val-His-Trp-Val-Arg-Gln-Ser-Pro-Gly-Lys-Gly-X04-Glu-Trp-Leu-Gly-Val-IIe-Trp-Lys-Gly-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-X05-Ser-Arg-Leu-Arg-IIe-Thr-Lys-Asp-Asn-Ser-Lys-Ser-Gln-Val-Phe-Phe-Arg-Met-Asn-Ser-Leu-Gln-Thr-Asp-Asp-Thr-Ala-X06-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Val-Asn-Leu-Ala-Asp-Ala-Met-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-X07-Val-X08-Val-Ser-Ser,其中XOl 为 Lys 或 Gin,X02 为 Gln 或 Glu，X03 为 Arg 或 Lys，X04 为 Leu 或 Pro，X05 为 Met 或 Lys，X06 为 Ile 或 Thr，X07 为 Ser 或 Thr，X08 为 Ile 或 Thr(SEQ ID NO 14)。在一个实施方案中此抗体的特征在于，所述抗体的轻链可变结构域包含以下通式 的氨基酸序列Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ser-Ala-Ser-Val-Gly-Glu-Thr-Val-Thr-Ile-Thr-Cys-Arg-Ala-Ser-Gly-Asn-Xio-His-Gly-Tyr-Leu-Ala-Trp-Xll-Gln-Gln-Lys-X12-Gly-Lys-X13-Pro-X14-Leu-Leu-X15-Tyr-Asn-Thr-Lys-Thr-Leu-Ala-Glu-Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr-X16-Phe-X17-X18-X19-Ile-X20-Ser-X21-Gln-Pro-Glu-Asp-Phe-X22-X23-Tyr-Tyr-Cys-Gln-His-His-Tyr-Asp-Leu-Pro-Arg-Thr-Phe-Gly-Gly-Gly-Thr-Lys-X24-Glu-Ile-Lys,其中XlO 为 lie 或 Ala，Xll 为 Phe 或 Tyr，X12 为 Gln 或 Pro，X13 为 Ser 或 Ala，X14 为 Gln 或 Lys,X15 为 Val 或 lie,X16 为 Gln 或 Asp,Xl7 为 Ser 或 Thr，
X18 为 Leu 或 Ala，X19 为 Lys 或 Thr，X20 为 Asn 或 Ser,X21 为 Leu 或 Ala，X22 为 Gly 或 Ala,X23 为 Asn 或 Thr，X24 为 Leu 或 Val(SEQ ID NO 15)。根据本发明的抗体在一个实施方案中的特征在于，所述抗体与CCR5结合并包含 选自可变区组的可变重链或轻链结构域，所述可变区组包含SEQ ID NO :14的重链可变结构 域、SEQ ID NO 15的轻链可变结构域或其CCR5结合片段。根据本发明的抗体在一个实施方案中的特征在于恒定区(轻和重链)为人源的。 这样的恒定区(链)为本领域熟知的，例如描述于Kabat (见例如Johnson，G.和Wu，T.T.， Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218)。例如，有用的人重链恒定区包含独立选自SEQ ID NO 01或02的氨基酸序列。例如，有用的人轻链恒定区包含SEQ ID NO 03的κ轻链恒定 区氨基酸序列。在另一个实施方案中为小鼠来源的抗体，包含小鼠抗体的抗体可变序列框， 根据 Kabat (见例如 Johnson, G.和 ffu, Τ. T.，Nucleic AcidsRes. 28 (2000) 214-218)。根据本发明的抗体抑制人CCR5的一种或多种功能，例如配体和CCR5的结合、信号 转导活性(例如激活哺乳动物G蛋白的激活、诱导胞质游离Ca2+浓度的快速瞬时增加和/或 刺激细胞反应(例如刺激趋化作用、白细胞的胞吐作用或炎症介质释放、整联蛋白激活))。 所述抗体抑制RANTES、MIP-1 α和/或MIP-I β与人CCR5的结合，和/或抑制人CCR5介导 的功能，如白细胞运输、T细胞活化、炎症介质释放和/或白细胞脱粒。在一个实施方案中根据本发明的抗体在结合测定中当抗体浓度高至100yg/ml 时，不抑制趋化因子与CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR6和CXCR4的结合。人IgGl或IgG3的糖基化以核心岩藻糖基化双触角复合物寡糖发生于Asn297， 由此糖基化以多至2个Gal残基终止。这些结构根据末端Gal残基的量(Raju，Τ. S., Bioprocess Int. , April 2003，44-53)被指定为 GO、Gl ( α-1，6-或 α-1，3_)或 G2 聚 糖残基。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如描述于Routier，F. H.，Glycoconjugate J. 14(1997)201-207。在非糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体通常以至少85%的量 (mol-%，摩尔百分比)在Asn297岩藻糖基化。根据本发明，术语“岩藻糖量”意为在Asn297糖链中的岩藻糖的量，相对于和 Asn297连接的所有糖残基的总和(例如复合、杂和和高甘露糖结构)，使用MALDI-T0F质谱 测量，并以平均值计算(见实施例8)。岩藻糖相对量指包含岩藻糖的结构相对所有糖结构 的百分比，在用N-糖苷酶F处理的样品(例如复合、杂和_、寡-和高_甘露糖结构，分别 地)中使用MALDI-T0F鉴定。根据本发明的afucosylated抗CCR5抗体可在一种糖修饰的宿主细胞中表达，所 述细胞被改造为表达至少一种编码具有GnTIII活性的多肽的核酸，任选的还表达编码具 有ManII活性的多肽的核酸，用于以根据本发明的量岩藻糖基化根据本发明的抗体的Fc 区。在一个实施方案中，具有GnTIII活性的多肽为融合多肽。可选的可根据US 6，946，292降低或消除宿主细胞的α 1，6-岩藻糖基转移酶活性，以生成糖修饰的宿主细胞。抗体岩藻 糖基化的量可通过例如发酵条件或组合至少两种不同岩藻糖基化量的抗体预先决定。根据本发明的抗CCR5抗体可在宿主细胞中经以下方法制备，所述方法包含(a) 在允许制备具有根据本发明的(所述抗体Fc区上存在的寡糖的)岩藻糖量的所述抗体的 条件下培养宿主细胞，所述细胞被改造以表达至少一种编码具有GnTIII活性的多肽的多 核苷酸，任选的还表达编码具有ManII活性的多肽的多核苷酸；和(b)从细胞或培养基中 分离所述抗体。在一个实施方案中，具有GnTIII活性的多肽为融合多肽，在另一个实施方 案中，融合多肽包含GnTIII的催化结构域和异源高尔基体驻留多肽的高尔基体定位结构 域，所述定位结构域选自甘露糖苷酶II的定位结构域、β (1,2)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 I(" GnTI")的定位结构域、甘露糖苷酶I的定位结构域、β (1，2)-Ν-乙酰氨基葡萄糖转 移酶II(" GnTII")的定位结构域和α (1-6)核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。在一 个实施方案中高尔基体定位结构域从甘露糖苷酶II或GnTI中获得。在另一个方面，本发明涉及用上述方法修饰抗CCR5抗体的糖基化特征的方法。在 此方面，本发明涉及修饰抗CCR5抗体的糖基化的方法，使用具有GnTIII活性和包含异源高 尔基体驻留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。在一个实施方案中，本发明的融合多 肽包含GnTIII的催化结构域。在另一个实施方案中，高尔基体定位结构域选自甘露糖苷酶 II的定位结构域、GnTI的定位结构域、甘露糖苷酶I的定位结构域、GnTII的定位结构域或 α (1-6)核心岩藻糖基转移酶的定位结构域。在一个实施方案中高尔基体定位结构域从甘 露糖苷酶II或GnTI中获得。根据本发明，这些抗CCR5抗体的经修饰的寡糖可为杂和的或复合的。在一个实施 方案中，分叉的非岩藻糖基化寡糖为杂和的。在另一个实施方案中，分叉的非岩藻糖基化寡 糖为复合的。如此处所使用的，“具有GnTIII活性的多肽”指能够催化β _1_4连接中的N-乙 酰葡糖胺(GlcNAc)残基加至N-连接的寡糖三甘露糖基核心上的连接的甘露糖苷的多 肽。这包括融合多肽，其展示与β (1，4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III (又名为β-1，4-甘 露糖基-糖蛋白4-β-Ν-乙酰氨基葡萄糖转移酶(EC 2.4. 1. 144))活性相似的、但无须相 同的酶活性，所述命名是根据生物化学和分子生物学国际联盟命名委员会(NC-IUBMB)，上 述是在特定的生物测定中测定，具有或不具有剂量依赖性。在存在剂量依赖性的情形中，所 述酶活性不需要和GnTIII活性相同，但在给定活性下具有与GnTIII相比基本上相似的剂 量依赖性(即候选多肽展示相对于GnTIII更大的活性或不超过约少25倍的活性，在一个 实施方案中不超过约少10倍的活性，在另一个实施方案中不超过约少3倍的活性)。如此 处所使用的，术语“高尔基体定位结构域”指高尔基体驻留多肽的氨基酸序列，其用于将多 肽锚定于高尔基复合物的区域内。一般的，定位结构域包含酶的氨基端“尾巴”。根据本发明的抗体显示了与Fc γ受体III (Fe γ RIII，⑶16a)的高结合亲和力。 与Fc γ RIII的高结合亲和力表示，相对于在CHO宿主细胞(例如CHO DG44或CHO Kl细 胞)中表达的作为参照的野生型抗CCR5抗体(95%岩藻糖基化)(见实施例5)，所述抗体 对⑶16a/F158的结合增强至少10倍，或/并且相对于野生型抗CCR5抗体，对⑶16a/V158 的结合增强至少20倍，这是用固定化的CD16a在IOOnM抗体浓度下使用表面等离振子共振 (SPR)测量(见实施例3)。可通过根据现有技术的方法增加Fc γ RIII的结合，例如通过修饰抗体Fc部分的氨基酸序列或Fc部分的糖基化。如此处所使用的，术语“与CCR5结合”表示在体外测定中(在一个实施方案中时在 结合测定中)抗体与CCR5的结合，其中抗体结合于表面，使用表面等离振子共振(SPR)测 量(抗体)与CCR5的结合。结合意为ICT8M或更低的结合亲和力(Kd)，在一个实施方案中为 ICT13M至 1(Γ9Μ。抗体与 CCR5 或Fc yRIII 的结合可通过BIAcore 测定(PharmaciaBiosensor AB, Uppsala, Sweden)进行研究。结合亲和力可由术语Ka(抗体/抗原复合物中抗体的缔 合速率常数)，Kd (解离常数)和KD(kd/ka)定义。根据本发明的抗体与CCR5的结合显示了 10_8M或更低的KD。术语“表达CCR5的细胞”指这样的细胞，其为a)自然表达CCR5 (例如⑶4+和⑶8+T细胞，以及单核细胞和其他免疫细胞)，b)重组的改造的小鼠 LL 2 细胞(ATCC HB204)和 CHO 细胞(CH0K1-ATCC CCL-61， CHO DG44-Urlaub 等人 Cell 33 (1983) 405-412)，或其他细胞系，c)经细胞因子、HIV、丁酸钠或其他刺激物刺激后表达CCR5的细胞。术语“CCR5+”表示在其外侧细胞膜表面表达和呈递趋化因子受体CCR5的细胞。术语“抗体依赖性细胞毒作用(ADCC) ”指在效应细胞存在下通过根据本发明的抗 体裂解人靶细胞。在一个实施方案中，通过下述方法测量ADCC 在效应细胞存在下用根据 本发明的抗体处理表达CCR5的细胞准备物，所述效应细胞为例如新鲜分离的PBMC或从暗 黄覆盖层纯化的效应细胞，例如单核细胞或天然杀伤(NK)细胞或永久生长的NK细胞系。如此处所使用的，术语“宿主细胞”表示任何种类的可被改造以生成本发明的多肽 和抗原结合分子的细胞系统。在一个实施方案中，宿主细胞能够并被改造为可产生具有修 饰糖形的抗原结合分子。宿主细胞可被进一步操纵为表达增加水平的具有GnTIII活性的 一种或多种多肽。在一个实施方案中宿主细胞为CHO细胞。为在宿主细胞中表达蛋白质，使用标准方法将编码轻和重链或其片段的核酸插 入表达载体中。在该宿主细胞中进行表达，从细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收抗 体。制备重组抗体的一般方法为熟知的现有技术，并描述于综述文章中，例如Makrides， S. C. , Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 ；Geisse, S.,等 K, Protein Expr. Purif. 8(1996) 271—282 ；Kaufman, R. J.，Mol. Biotechnol. 16(2000) 151 — 160 ；Werner, R. G.，Drug Res. 48 (1998) 870-880。抗体可以在整个细胞、细胞裂解物种存在或以纯化形式存在。使用标准技术进行 纯化以消除其他细胞组分或污染物，例如细胞内的核酸或蛋白质，所述技术包括碱/SDS处 理、CsCl显带法、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其他本领域熟知的技术。见例如Ausubel，F.， 等人，编辑 CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)。适用于原核生物的控制序列包括例如，启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合 位点。已知真核细胞可利用启动子、增强子和多聚腺苷酸化信号。当核酸被置于与另一条核酸序列具有功能性关系的位置时，该核酸为“有效连接 的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA为有效连接的，当前者作为参与多 肽的分泌的前蛋白表达时；启动子或增强子与编码序列为有效连接的，如果前者影响序列 的转录；或核糖体结合位点与编码序列为有效连接的，如果前者被置于的位置能促进翻译。一般的，“有效连接的”意为连接的DNA序列为相邻的，在分泌前导序列的情况下为相邻的且 符合读框的。但是增强子不需要为相邻的。使用合适的限制性位点的连接来实现连接。如 果这样的位点不存在，则依照传统的做法使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。使用如下的传统免疫球蛋白纯化步骤将单克隆抗体从培养基中适当地分离，例如 蛋白质A-琼脂糖层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。编码单克隆抗体的 DNA和RNA可使用传统步骤容易的分离和测序。杂交瘤细胞可作为这些DNA和RNA的来源。本发明的一些方面为用于治疗或预防患有同种异体移植排斥的患者的方法，及用 于治疗炎症和其他免疫介导疾病的方法，其特征在于对患者施用根据本发明的抗体。同样 的，本发明的一些方面为抗体在制备用于治疗或预防同种异体移植排斥、治疗炎症、或治疗 其他免疫介导疾病的药物中的用途。本发明的另一个实施方案为用于治疗患有移植排斥或移植物抗宿主病的患者的 方法，其特征在于对患者施用本发明的抗体。同样的，本发明的方面为根据本发明的抗体在 制备用于治疗移植排斥或移植物抗宿主病的药物中的用途。本发明的一方面为包含根据本发明的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面为 根据本发明的抗体在制备药物组合物中的用途。本发明的另一个方面为制备药物组合物的 方法，所述药物组合物包含根据本发明的抗体和任选的可药用的赋形剂或载体。在一个实 施方案中，药物组合物包含根据本发明的抗体和免疫抑制剂的组合。术语“免疫抑制剂”表示下述化合物，当其施用于生物时可降低或抑制所述生物的 免疫反应。免疫抑制剂的实例为钙依赖磷酸酶抑制剂，例如环孢菌素A。因此，在一个实施 方案中免疫抑制剂为钙依赖磷酸酶抑制剂。在另一个实施方案中免疫抑制剂为环孢菌素A。在另一个方面，本发明提供了组合物，例如药物组合物，其包含本发明的抗体，所 述制剂与药用载体一起配制。如此处所使用的，“药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗 真菌剂、等渗和吸收延迟剂、和生理上相容的类似物。在一个实施方案中载体适用于静脉内 的、肌内的、皮下的、肠胃外的、脊柱的或表皮的施用(例如通过注射或输注)。本发明的组合物可通过本领域公知的多种方法施用。熟练技术人员应当理解，施 用的途径和/或模式将根据想要的结果而变化。为了以某种施用途径施用本发明的化合物，可能必须使用物质包被化合物、或将 所述物质和化合物共同施用以避免其失活。例如可在合适的载体中对受试者施用化合物， 所述载体例如脂质体或稀释剂。可药用的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药用载体包括无菌水溶液或分散体，和用于临时配制无菌可注射用的溶液或分散 体的无菌粉末。这些用于药用活性物质的介质和活性剂的用途为本领域公知的。如本文所用的短语“肠胃外给药”和“经肠胃外给药”，表示不同于肠和局部给药 的给药方式，通常是通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏 内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内 注射和输注。根据本发明的组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过 前述灭菌操作，以及通过纳入多种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯 酚、山梨酸等，均可以确保防止微生物的存在。还可能期望在组合物中纳入等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可注射药物形式的延迟吸收可以通过纳入延迟吸收的活性剂如单硬脂酸铝 和明胶来实现。无论所选的施用路径如何，可以以适宜水合物形式使用的本发明的化合物和/或 本发明的药物组合物通过本领域公知的常规方法配制为可药用剂型。根据本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可有变动，以获得有效量的活 性成分，从而对于特定的患者、组合物和给药方式实现期望的治疗反应，而对患者没有毒 性。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明特定组合物的活 性、给药路径、给药时间、所采用特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所采用特定组合 物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、总体健 康和既往病史、以及医学领域众所周知的类似因素。组合物必需是无菌和流动的，其程度使得组合物可以通过注射器递送。除了水之 外，载体在一个实施方案中是等渗缓冲盐溶液。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂，分散剂的情况下通过维持所需的颗粒大小，通 过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。在许多情况下，有利地在组合物中纳入等渗剂， 例如糖，多元醇如甘露醇或山梨糖醇，和氯化钠。根据现有技术用多种细胞类型、组织类型和器官类型进行移植，例如胰岛、角膜、 骨髓、干细胞、皮肤移植、骨骼肌、主动脉和主动脉瓣，和器官如心脏、肺、肾、肝和胰腺。本发明包含根据本发明的抗体在治疗患有GvHD (移植物抗宿主病)或Hv⑶(宿主 抗移植物疾病)(例如移植后)的患者中的用途。本发明还包含用于治疗患有这些GvHD和 HvGD的患者的方法。本发明另外包含根据本发明的抗体在制备用于治疗GvHD或HvGD的药 物中的用途。本发明还提供了有效量的根据本发明的抗体在制备药物制剂(优选的与可药用 的载体一起)中的用途，用于治疗患有CCR5介导的炎症介质释放的患者。如本申请所使用的，术语“移植排斥”表示人免疫系统对移植组织的反应。如果将 组织从供体移植到宿主，供体组织中的人类白细胞抗原基因很可能与宿主组织中的不同。 因此，宿主免疫系统将移植组织识别为外来的并产生被称为移植排斥的免疫反应。此移植 排斥反应被称为“移植物抗宿主病”(GvHD)。术语“所述糖链显示的特征在于，连接于结合CCR5的抗体Asn297的N-连接的聚 糖在CHO细胞中重组表达”表示，根据本发明的抗体的Asn297位糖链与在未修饰的CHO细 胞中表达的抗CCR5抗体(例如，根据WO 2006/103100的那些抗CCR5抗体)的Asn297位 糖链相比，具有相同的结构和除了岩藻糖残基以外的相同的糖残基序列。如本申请所使用的，术语“NGNA”表示糖残基N-羟乙酰神经氨酸。因此，本发明提供了用于治疗或预防在哺乳动物(包括人)中的急性和慢性器官 移植排斥的方法，其特征在于对所述哺乳动物施用根据本发明的抗体。本发明还提供了用 于治疗或预防在哺乳动物(包括人)中的急性和慢性器官移植排斥的根据本发明的抗体。 本发明还包含根据本发明的抗体在制备用于治疗急性和慢性移植排斥的药物中的用途。选择5只食蟹猴作为心脏同种异体移植受体。单独使用根据本发明的抗体处理猴 (η = 2，单独疗法)，或将所述抗体与治疗剂量的环孢菌素A (CsA，η = 3，组合疗法)组合处 理猴。此研究显示根据本发明的抗体为免疫抑制的，原因为
-和未处理对照相比，在单独疗法中观察到延长的移植存活(19士5.7天对 6. 4 士 0.4 天；ρ = 0. 034)，-和CsA单独疗法相比，使用根据本发明的抗体和CsA的组合疗法抑制慢性同种 异体移植排斥(慢性同种异体移植血管病变(0六力)(0六￥评分0.2士0.1对1.9士0.4，？= 0. 024)，-和CsA单独疗法相比，使用根据本发明的抗体和CsA的组合疗法抑制抗供体的同 种抗体的产生，-和有免疫抑制的迹象的CsA单独疗法相比，在使用根据本发明的抗体和CsA的组 合疗法中有延长的原发性移植物存活。术语“组合疗法”指以一种单一制剂或两种分开的制剂施用根据本发明的抗CCR5 抗体和免疫抑制剂。施用可为同时的或任一顺序相继的，其中在一个实施方案中具有一定 时间阶段，但是两种(或所有)活性剂同时发挥它们的生物学活性。所述抗CCR5抗体和所 述免疫抑制剂在组合疗法中或者同时施用，或者相继施用(例如经过静脉内的(i. v.)连续 输注(一为抗体，后一为免疫抑制剂))。不言而喻的，对患者施用“治疗有效量”(或仅仅“有效量”)的抗体，所述量为可 在研究者、兽医、医学博士(medical doctor)或其他临床医生所正调查的组织、系统、动物 或人中引起生物学或医学反应的单独化合物或组合的量。所述抗CCR5抗体和所述免疫抑制剂的量及施用的时机取决于被治疗患者的类 型(物种、性别、年龄、体重等等)和病症，以及被治疗疾病或病症的严重性。根据疾病的 类型和严重性，对患者施用两种药物的起始候选剂量为所述抗CCR5抗体为约1 μ g/kg到 50mg/kg(在一个实施方案中为10-25mg/kg)，所述免疫抑制剂为1μ g/kg到50mg/kg (在一 个实施方案中为5-20mg/kg)。因此，本发明的一个方面为在与免疫抑制剂组合疗法中，抗CCR5抗体在制备用于 治疗移植排斥的药物中的用途。本发明还包含使用根据本发明的抗CCR5抗体和免疫抑制 剂的组合疗法在患者中治疗移植排斥的方法。本发明的另一个方面为抗CCR5抗体在制备用于在与免疫抑制剂组合疗法中，治 疗抗供体同种抗体产生的药物中的用途。本发明还包含使用根据本发明的抗CCR5抗体和 免疫抑制剂的组合疗法对患者治疗抗供体同种抗体产生的方法。术语“同种抗体”表示器官针对相同种的人外来组织产生的抗体。通过根据本发明的抗体靶向CCR5，由于CCR5+细胞的消耗，可减弱或甚至预防急 性同种异体移植排斥。因此，通过应用根据本发明的抗体，可观察到延长的同种异体移植存 活和完全预防的慢性排斥(通过CAV发病率和严重性证实)。因此，本发明的一些方面为根据本发明的抗CCR5抗体在预防同种异体移植排斥 或治疗同种异体移植受体的同种异型免疫中的用途，根据本发明的抗CCR5抗体在制备用 于预防同种异体移植排斥或治疗同种异体移植受者的同种异型免疫的药物中的用途，和对 所述受体施用根据本发明的抗体以用于预防同种异体移植排斥或治疗同种异体移植受者 的同种异型免疫的方法。在一个实施方案中根据本发明的抗CCR5抗体在与免疫抑制剂组 合疗法中施用。用10mg/kg的抗体单独疗法，以第一周每3-5天，以后每周，来处理食蟹猴，心脏的同种异体移植物存活了 14和23天，显著长于未处理的猴(MST 6. 5士0.4天；η = 5，ρ = 0. 034)(见图5)。急性细胞排斥经组织学确认。通过使用如上剂量的本发明的抗CCR5抗 体和CsA的组合疗法，3只被组合处理的动物直至观察期末(在85-90天)没有1只发展出 症状性排斥。在移植物外植后发现移植物不具有排斥的临床证据。因此，在本发明的抗CCR5抗体和CsA的组合疗法处理中发现没有可检测的急性移 植排斥发作，并且所有3个移植物在约90天时被可选地外植，具有正常的功能。相反，在用CsA单独疗法处理的8只历史动物中的4只中，在90天前(分别在7、 23、44和71天)检测到症状性急性同种异体移植排斥(移植物心动过缓和/或减弱的收缩 性、受者发热)的首次发作。在这些动物中3只为类固醇反应性的(每天3次类固醇推注， 使用Solu-Medrol , I0mg/kg) ；ι个移植物在治疗开始前7天发生排斥。ι只历史对照 动物在第26天死亡，死于中心静脉管道感染引起的败血病。剩下的3个历史移植物没有急 性排斥地存活至第85-90天选择性移植物外植时。因此，发现根据本发明的抗-CCR5抗体和CsA的组合疗法可提供延长的移植存活 和减弱的急性移植排斥。中值存活时间(MST)为超过90天，相对于用CsA单独疗法的71 天(P = 0. 13)，用根据本发明的抗CCR5抗体和CsA组合疗法相较于CsA单独的急性排斥发 病率为0/3，相对于4/7 (ρ = 0. 2)。单独疗法下的同种异体移植排斥显示了严重急性细胞排斥(3R级，具有弥漫性炎 症浸润和多病灶心肌细胞损伤并伴随水肿和出血)的典型特征，根据国际心肺移植学会 (ISHLT)。相反，与用根据本发明的抗CCR5抗体单独疗法的或不经处理的猴相比，在用根据 本发明的抗CCR5抗体和CsA组合疗法处理的猴中排斥评分一致的更低(0或1级)。显著 的，尽管用CsA单独疗法处理的移植物在外植体显示了中度到严重的心脏同种异体移植血 管病变(CAV严重性评分1. 9士0. 4 ；所有评分彡1. 5，N = 6))，与CsA单独疗法相比，与根 据本发明的抗CCR5抗体和CsA组合疗法相关的CAV评分显著降低(0. 2士0. 1，η = 3 ;ρ = 0. 024 相对 CsA)(图 6)。用抗CCR5抗体单独疗法(10. 7mg/kg)处理的2只动物在2周内检测到同种抗体的 确立。当在一个实施方案中，在与CsA的组合疗法中，施用18-22mg/kg(21.4mg/kg)的较高 剂量的根据本发明的抗CCR5抗体，3只动物中的2只生成了仅痕量/可测量的抗供体IgG 抗体且3只均未达到10%的阳性阈值，这些中仅有1只在1个月时也展现了瞬时的低滴度 IgM。相反，在用CsA单独疗法处理的6/7 (TgM)和4/7(IgG)历史对照动物中，在90天内检 测同种抗体的产生。因此，使用根据本发明的抗CCR5抗体的组合疗法在伴随钙依赖磷酸酶 抑制剂治疗的背景下，减弱了响应心脏同种异体移植的同种抗体的生成。CsA的剂量在本发 明的一个实施方案中为每天肌内15士 10mg/kg(即从5mg/kg到25mg/kg的剂量)以使治疗 的波谷水平达到> 400ng/ml。因此，本发明的另一个方面为根据本发明的抗-CCR5抗体和钙依赖磷酸酶抑制剂 疗法组合在减弱针对同种异体抗原的体液免疫中的用途。CCR5消耗，作为维持治疗，因此可允许使用显著更低剂量的CsA。在移植排斥时(被根据本发明的抗CCR5抗体的单独疗法所延长)进行组织学比 较，该单独疗法单独未预防移植物的细胞浸润。具体的，大量T细胞和巨噬细胞进入移植 物，尽管部分CCR5+细胞消耗与抗体单独疗法相关。
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表1 下表显示了用CsA单独或与根据本发明的抗体组合治疗的受体中的移植结 果和组织学总结(二次存活表示在第一次急性排斥发作被治疗后被排斥移植物外植的时 间；> 表示移植物外植但仍跳动；CAV 心脏同种异体移植血管病变；ISHLT 根据国际心 肺移植学会的排斥评分；CsA 环孢菌素A，在移植物外植的情况下每天给药15士 10mg/ml以 达到波谷水平> 400ng/ml ；抗体用根据本发明的抗CCR5抗体处理，以10mg/kg在第_1、5、 8、14、21和28天给药，或直至移植物外植(单独疗法)，或以20mg/kg在第_1、5、8、14天和 之后每周给药直至90天(组合疗法))。
抗体保藏 为帮助理解本发明，提供以下所列的实施例、图和序列，本发明的真正范围在附加 的权利要求书中阐明。应当理解，可以对阐明的步骤进行修改而不背离本发明的精神。
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厘

图1 :CH0细胞上的Fc受体结合，afucosylated抗体( )，野生型抗体(■)。图2 =ADCC, afucosylated抗体(■)，野生型抗体(眷)和LALA突变抗体(▲)。图3 :CCR5+细胞的体内消耗图4 ⑶8+细胞、⑶4+细胞和单核细胞中的CCR5细胞表达监测。灰色对照，非特 异性单克隆抗体；黑色经处理的食蟹猴图5 在接受根据本发明的抗CCR5抗体的食蟹猴中延长的心脏同种异体移植存 活，其中 20图6 组合疗法可预防心脏受体食蟹猴中的心脏同种异体移植血管病变，其中
实施例材料和方法抗体使用如WO 2006/103100和WO 2008/037419中所述的抗CCR5IgGl抗体作为抗体 (可变区见 SEQ ID N0:06 至 SEQ ID NO 13，CDR 序列见 SEQ ID NO :04、05，和 SEQ ID NO:21至35)。使用所述抗体作为野生型抗体(WT Ab, 8% afucosylated)、afucosylated抗体 (afucosylated Ab)和 LALA 突变抗体(见 WO 2008/037419) (LALA 突变 Ab)。术语 LALA 表 示在所述抗体恒定区234和235位的亮氨酸到丙氨酸的氨基酸替换(L234A，L235A)。JlS表达系统包含CMV启动子系统(EP 0323997)并描述于表2和表3。表2 :pETR 3928 (抗体表达载体) 表3 :pETR 2896 (糖基化载体) 人CCR5细胞系使用稳定表达人CCR5受体的Li. 2细胞系(Li. 2hCCR5细胞)用于人CCR5趋 化性测定。Li. 2hCCR5细胞培养于包含10% FBS、10单位/ml青霉素、10μ g/ml链霉素、 0. ImM谷氨酰胺、ImM丙酮酸钠、55 μ M 2-巯基乙醇、250 μ g/ml遗传霉素的RPMI 1640中 (均购自Invitrogen)。在趋化性测定开始前，将细胞离心并重悬于趋化缓冲液(包含 0. 1% BSA(Sigma)禾Π IOmM HEPES 缓冲液(Invitrogen 公司，USA)的 Hank，s 平衡盐溶液 HBSS(Invitrogen))中。细胞以5X IO6细胞/ml的终浓度用于趋化性测定。食蟹猴CCR5细胞系使用稳定表达食蟹猴CCR5受体的Li. 2细胞系(Li. 2cynoCCR5细胞)用于食蟹猴 CCR5趋化性测定。L1.2cyn0CCR5细胞培养于和L1.2hCCR5细胞相同的生长培养基中。在 测定前一天将细胞以8 X IO5细胞/ml的密度接种于包含5mM 丁酸钠(Sigma)的生长培养 基中。在趋化性测定开始前，将细胞离心并重悬于趋化缓冲液。细胞以5X IO6细胞/ml的 终浓度用于趋化性测定。配体的准备CCR5配体人MIPl α、MIPl β或RANTES (R&D Systems)稀释于趋化缓冲液中并以 IOnM的终浓度使用。LALA突变Ab和同种型对照小鼠IgG2A(BD Biosciences,USA)稀释于 趋化缓冲液中。抗CCR5抗体的制备将质粒pETR 3928转染至已预先转染了质粒pETR 2896的谷氨酰胺原养型CHO或 HEK293宿主细胞中(EP 0256055)。细胞系以补料分批培养在无血清培养基中培养至多14 天以生成具有不同量岩藻糖基化的抗体批次(样品1-4，CH0)。抗体从上清液中分离并用 层析方法纯化。在HEK 293或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系CH0-DG44中重组生产野生型抗体(92% 岩藻糖基化)或 LALA 突变 Ab (Flintoff，W. F.，等人，Somat. Cell Genet. 2 (1976) 245-261 ； Flintoff, W. L.,等人，Mol. Cell. Biol. 2 (1982) 275-285 ；Urlaub, G.,等人，Cell 33(1983)405-412 ；Urlaub, G.，等人，Somat. Cell Mol. Genet. 12 (1986) 555-566)。CH0-DG44 细胞生长于 MEMalpha Minus Medium (Gibco No. 22561)、10 % 经透析的 FCS (Gibco No. 26400-044)和2mmol/L L-谷氨酰胺，100 μ M次黄嘌呤、16 μ M胸腺嘧啶核苷(HT添加 物)。动物食蟹猴(Macaca fascicularis) (3到7kg)通过血型相容、混合淋巴细胞反应 (MLR)错配(实际SI范围6-8)配对。动物在传统条件下饲养，遵照实验动物护理和使用 指南(HHS, NIH Publication 86-23，1985)。
猴心脏移棺和免疫抑制所有受体动物接受了如前述的异位腹内心脏同种异体移植(Schroeder. C.，等人， J. Immunol. 179 (2007) 2289-2299)。2只动物使用抗体单独疗法处理，在第_1、5、8、14、21和 28天以10mg/kg每天静脉内注射。另外3只动物接受20mg/kg的抗体，在第-1、5、8、14天， 和之后每周直至90天，并另外接受环孢菌素A (CsA，来自Bedford Laboratories, Bedford, OH,USA的通用制剂)。CsA从手术当天直至90天每天给药1次(肌内(IM)，15士 10mg/kg) 以达到目标波谷水平(> 400ng/ml)。经历了急性排斥发作的动物接受了 3天的类固醇疗 程(10mg/kg 推注，Solu-Medrol , Pharmacia, Kalamozoo, MI, USA)以达到 90 天的移植 存活。在移植物血管再形成后30分钟和手术后第5 (仅单独疗法)、14、28和56天进行开 心活检。通过内植的遥测装置(Data Sciences International, St. Paul, MN, USA)至少每 天监控移植物的功能。基于以下3种心脏症状中的2种，可怀疑为临床急性移植排斥持续 的高体温(> 38. 5°C )；移植心率的降低(至< 120下每分钟(bpm))或与稳定的基线相比 持续> 40bpm( 20% )的下落)；或移植物脉压(收缩压减舒张压)的下降> 20mmHg，排 除技术测量的因素。以遥测装置对收缩丧失定义为移植失败，通过外植体观察确认，并通常 在之前有急性排斥症状。使用DSI遥测系统每天测量体温，并记录为单次早晨测量。参考 动物包括未接受处理(η = 5)或接受达到目标波谷水平> 400ng/ml剂量的CsA(CsA单独 疗法，η = 8)的历史动物。CBC 禾口 FACS 分析在新鲜收集的EDTA-血上进行全血细胞(CBC)测定，使用自动细胞计数器 (Hemavet)的猴设置。全血收集于EDTA(100 μ 1)，对从淋巴结(LN)分离的细胞(IXlO6 细胞)定期分析CCR5的表达。简言之，细胞经4°C 20分钟的染色，使用在FACS清洗 缓冲液(添加10 % FCS和0. 2 %叠氮化钠的PBS (磷酸缓冲盐溶液))中的以下抗体 PerCP-Cy5. 5-缀合的抗人 CD4mAb (L200, BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)，APC-缀合 的抗人 CD8 α (3Β5, Caltag, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，AlexaFluor488-缀合的抗人 CD14(M5E2, BD Pharmingen, USA)，和 PE-缀合的抗人 CD195 (CCR5) (3A9, BD Pharmingen, USA)。使用BD FACSLyse裂解红血细胞。在一些实验中，细胞还用AlexaFluor488_缀合的 抗人CD183 (CXCR3) (1C6，BD Pharmingen, USA)针对CXCR3进行染色，在2个例子中移植物 浸润细胞(GILs)通过胶原酶消化和Ficoll梯度分离来分离，并按上述方法染色。通过前向 /侧向散射分析门控淋巴细胞群以去除碎片。使用CellQuest或Winlist软件进行数据分 析和图形显示。将CCR5阳性细胞占血液中⑶4+或⑶8+淋巴细胞的比例乘以⑶4+和CD8 的绝对数(通过示差分析得到的淋巴细胞数计算得到)以得到每μ 1血液中CCR5+⑶4+和 CCR5+CD8+细胞的绝对数。抗供体同种抗体的检测通过流式细胞仪回顾性测量同种抗体，如前述(Schroeder，C.，等人，2007，见 上)。简言之，封存的冷冻供体脾细胞(0.5X106细胞)和热失活的受体血清(50 μ 1)于 4°C孵育30分钟。清洗后，抗体结合的显示使用PE-标记的山羊抗人IgM(Fe γ特异性)抗 体(Biosource, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，或使用生物素标记的山羊抗猴 IgG (Fe γ 特异性)抗体(Nordic，Tilburg，荷兰)，随后使用PE标记的链霉抗生物素(BDPharmingen， San Diego, CA, USA)。加入 FITC 标记的抗人 CD3 (BDPharmingen，USA)以门控 T 细胞。数
22据表示为移植后的阳性T细胞减去移植前水平后计算的百分比。超过10%的增长被定义为 反应性。组织学组织用10%福尔马林固定和常规处理以用于石蜡包埋。石蜡包埋的组织切片使用 苏木精和伊红染色。通过ISHLT标准对急性排斥进行细胞浸润液评级。以在各个时间点涉 及的动脉和小动脉血管(CAV评分> 1)的百分比记录70天后外植的跳动心脏中的CAV发 病率。这些外植心脏的CAV严重性按如下所述评分0级，正常动脉形态；1级，具有增大的 细胞核和/或粘附白细胞的激活的内皮细胞，没有腔变窄(< 10%) ；2级，明显的新血管 内膜增厚，腔变窄<50% ;3级，广泛的新血管内膜增生和超过50%的腔闭塞。由3位对处 理组毫不知情的评价者对每一颗外植心脏进行独立评分。每次活检或外植的平均CAV评分 使用以下公式计算[(#0级-血管xO) + (#1级-血管xl) + (#2级-血管x2) + (#3级-血管 x3)]/(评分动脉血管的总数)。将个体移植物的CAV评分平均来计算每个处理组的组平均 值(士 SD)。免疫组织化学免疫组织化学染色使用如下所述的自动化方法进行。福尔马林固定石蜡包 埋的(FFPE)组织切片在Ventana ES自动化染色机上使用ABC法(Ventana Medical Systems, Inc.，Tucson, AZ, USA)脱石蜡和染色。所有在Ventana仪器中放置的试剂均购 买自Ventana。在mild CCl、conditioner 1和standard 1上调整设定。使用以下一抗 CD3(2GV6, Ventana, USA)、CD68 (KP1，DAK0)和 CD20 (L26，DAKO，Copenhagen，Denmark)。对用 抗体单独疗法处理的动物和未处理的对照，使用如下方法计算细胞数评估组织中具有低 度、中度或强的细胞浸润的区域，然后取对应于代表性区域的10张照片。然后对每个区域 的细胞数计数，并计算每个区域的细胞平均数。如果组织样品分离在不同的工作板(block) 上，则单独处理所有工作板，将所有工作板中的细胞/区域数平均以获得该组织样品的细 胞数。对用抗体和CsA组合疗法处理的动物和用CsA单独疗法处理的对照，使用如下标准 对细胞浸润评分0，没有侵润细胞；1，局灶性染色或弱弥散；2，1-3个结节或轻微弥散性间 质浸润；3，3-10个结节或中度浸润；4，> 10个结节或强浸润；5，大量浸润。实时PCR心脏组织在液氮中速冻并贮藏于_70°C。使用Qiagen(Valencia，CA，USA)的 RNeasy mini试剂盒从心脏移植物中分离总RNA以用于进一步分析。药物水平分析在各个研究时间点收集血清样品并测量抗体水平。使用HPLC方法测量CsA血浆 水平。统计学分析移植存活时间以中值存活时间(MST)表示并使用Kaplan-Meier法作图。使用 log-级检验比较不同组的存活时间。除非另有提示，连续变量以平均值+标准差表示，并 使用Marm-Whitney非参数检验比较。名义变量(即早期排斥的发病率)使用相依表和 Fischer精确检验衡量。认为ρ值低于0. 05是统计上显著的。所有统计分析在个人电脑上进 行，使用用于 Windows XP 的统计软件包 SPSS (11. 0 版，SPSS, Chicago, IL, USA)或 GraphPad InStat (5. 1 版，GraphPad Software, San Diego, CA, USA)。
实施例1抗CCR5抗体与CCR5的结合比较了 afucosylated抗体(Ab)和野生型抗CCR5抗体与CCR5的结合能力。使用 鼠L1.2hCCR5细胞系作为靶细胞系。使用FITC-缀合的Affinipure F (ab) 2片段山羊抗人 IgG Fc γ 特异性抗体(JacksonImmunoResearch Lab# 109-096-098)作为二抗。使用抗人 CCR5-FITC(Becton-Dickinson,BD 555992)和小鼠 IgG2a_FITC 作为对照抗体。细胞培养基 为RPMI 1640培养基+10%FCS+1%谷氨酰胺+1%丙酮酸钠+0. 05mM β -巯基乙醇+0. 8mg/ ml G418。为了诱导细胞表面的hCCR5表达，在包含ImM 丁酸钠(Sigma B5887)的培养基中 孵育0. 2X IO6-O. 5X IO6细胞/ml。将不与丁酸钠孵育的细胞作为阴性对照。方法将用PBS/0. 1 % BSA稀释0. 2X IO6细胞/180 μ 1孔置于96孔圆底板中，并加入 20 μ 1稀释的抗体。4°C孵育30分钟后，细胞用PBS/0. 1% BSA清洗并加入15 μ 1孔稀释的 二抗或对照。细胞于4°C再孵育30分钟，接着是两次清洗步骤。在用FACSCanto测量细胞 前，加入碘化丙啶。结果野生型Ab和afucosylated Ab显示了依赖于抗体浓度的在靶细胞上的类似结 合。使用GraphPad Prism 4计算了两种抗体的EC5tl值。排除了 100 μ g/ml抗体的平均值。 afucosylated Ab 的 EC50 值为 0. 1376 ；野生型 Ab 的 EC50 值为 0. 09407。实施例2细胞Fc结合研究了 afucosyIatedAb相对野生型Ab的Fc-结合。将表达> 104CCR5分子/细胞的CHO细胞系作为靶细胞系。使用抗体FITC-缀合的 AffiniPure F (ab) 2 片段山羊抗人 IgG F (ab) 2 片段特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Lab#109-096-097)作为二抗。使用抗人 CD16-FITC(Beckman Coulter PN IM0814)；小鼠 IgGl同种型小鼠IgGl-FITC作为对照。细胞培养基为IMDM+Glutamax+25mM HEPES(Gibco 31980)+10% FCS+HT补充物+6 μ M嘌呤霉素。中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)培养于Τ150 摇瓶中，当密度达到13Χ IO6细胞/瓶时用于测定。使用胰蛋白酶/EDTA收获细胞。细胞培养培养基为IMDM+Glutamax+25mM HEPES (Gibco 31980) +10% FCS+HT 补充物 +6 μ M 嘌呤霉素。中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)培养于Τ150瓶中，当密度达到13Χ106细胞/瓶 时用于测定。使用胰蛋白酶/EDTA收获细胞。方法在96孔圆底平板中铺板在PBS/0. 1 % BSA中稀释的0. 2X IO6细胞/180 μ 1/孔， 并加入20 μ 1稀释的抗体。4°C孵育30分钟后，细胞用PBS/0. BSA清洗并加入12 μ 1/ 孔稀释的二抗或对照。细胞于4°C再孵育30分钟后进行2次清洗步骤。细胞用2% PFA于 4°C固定20分钟，然后经清洗后在FACSCantoce中测量它们(图1)。实施例3抗CCR5抗体与Fc yRIII(CD16a)的亲和力测定His-⑶16a被胺偶联至CM5芯片的表面。在BIACORE 3000仪器上进行测量。运行和稀释缓冲液为HBS-P。芯片的表面用His-⑶16a饱和。使胺偶联基团饱和。将分析物 加入恒定浓度为IOnM的缓冲液流中，而将抑制剂，可溶性⑶16a，加入渐增浓度(O-IOOOnM) 的缓冲液流中。RU值反应了抗体和⑶16a间的亲和力。表4 实施例4抗CCR5单克降抗体与NK细胞的Fc Y RIIIa的结合潜力为测定本发明的抗体与天然杀伤(NK)细胞的Fc γ RIIIa(⑶16)的结合能力，外 周血单核细胞(PBMCs)被分离，并在存在或不存在20μβ/πι1的Fc γ RIIIa封闭小鼠抗体 (抗CD16，克隆3G8，RDI，Flanders, NJ)的情况下，与20 μ g/ml的抗体和对照抗体孵育以 确定经Fc γ RIIIa的结合。使用不与？0^1 111￡1结合的人化62和化64(结合位点)作为 阴性对照。纳入人IgGl和IgG3 (结合位点)作为Fc YRIIIa结合的阳性对照。用FACS分 析检测NK细胞上结合的抗体，使用PE标记的小鼠抗人⑶56 (NK细胞表面标记)抗体(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)和 FITC 标记的山羊 F(ab)2 抗人 IgG(Fe)抗体 (Protos Immunoresearch, Burlingame, CA)的组合。在抗体浓度为 20 μ g/ml 时测定最大 结合(Bmax)。与人IgGl的100% Bmax相比，对照抗体(人IgG4)显示了最高达30%的Bmax。 因此，“不与Fc YRIIIa结合或没有ADCC”意为，在抗体浓度为20 μ g/ml时，与人IgGl相比 Bmax值最高达30%。通过铭51-释放测定测量ADCC和CDC材料铬购自Amersham，Cat#CJSll ；圆底聚丙烯板购自 costar，Cat#3790 ； Lumaplate-96(固体闪烁剂包被的聚苯乙烯板)购自Perkin-Elmer，Part#_6006633。靶细胞表达CCR5的细胞(Li. 2细胞系，见实施例2)。效应细胞或补体血清(人PBMCs，分离的NK细胞)。方法
25
1 X IO6靶细胞使用100 μ Ci铬51标记，37°C 1小时。标记细胞用培养基清洗4次 并重悬于5ml (浓度为200，000细胞/ml)。每孔放置50 μ 1靶细胞(以200，000细胞/ml 浓度)。加入50 μ 1不同浓度待测抗体并于4°C孵育1小时。以想要的E T比例加入效 应细胞(以想要的比例)或补体血清，并将细胞于37°C孵育4小时。对照混合并测量50 μ 1靶细胞和100 μ 1培养基用于自发裂解对照。使用50 μ 1标记 的靶细胞+50μ1 Triton-X-100 (1%于PBS中)+50 μ 1培养基测量最大裂解。在孵育结束 时，将50 μ 1培养上清液加至Luma板。以最高计数(topcoimt)读出结果。细胞毒性使用 以下公式计算细胞毒性百分比=(样品CPM-自发裂解CPM)/(最大裂解CPM-自发裂解 CPM)X100。结果显示于图2。实施例5CCR5趋化件测定含有人CCR5的Li. 2hCCR5细胞或含有食蟹猴CCR5的Li. 2mCCR5细胞培养于包 含10%胎牛血清、IX青霉素/链霉素、IX谷氨酰胺、IX丙酮酸钠、IX β-巯基乙醇和 250 μ g/ml G418的RPMI 1640中(均购自Invitrogen)。在趋化性测定开始前，将细胞 离心并重悬于趋化缓冲液(包含0. 1 % BSA(Sigma)和IOmM HEPES的Hank，s平衡盐溶 液HBSS(Invitrogen))中。细胞以5X IO6细胞/ml的终浓度用于趋化性测定。CCR5配体 hMIPl α、hMIP10或hRANTES(R&D Systems)稀释于趋化缓冲液中并以20nM的终浓度使用。 测试抗体或合适的同种型对照抗体稀释于HBSS。趋化性在0. 5 μ m孔的96孔ChemoTXK系 统(Neuroprobe)中开始。每种抗体与一种CCR5配体混合并将30 μ 1混合物置于ChemoTxK 系统的底孔。在底孔的顶端放置过滤筛。每种抗体与Li. 2hCCR5或Li. 2mCCR5细胞混合并 将20 μ 1混合物置于过滤筛上。之后将板置于加湿培养箱，于37°C 5% CO2孵育3小时。孵 育后将细胞从过滤筛中刮掉并将板置于台式离心机中以2，OOOrpm离心10分钟。之后除去 过滤筛并根据制造商的说明书使用CyQUANT 细胞增殖测定试剂盒(Invitrogen)和 Spectra MAX GeminiXS平板读数器(Molecular Devices)检测迁移至底孔的细胞密度。使 用 Prism 4 (GraphPad)计算 IC500在测定前24小时将含有2mM丁酸钠的Li. 2CCR5细胞以8X IO5细胞/ml接种。将 抗体稀释于CTX缓冲液(HBSS，0. 1 % BSA, 1 OmMHEPES)中。将配体稀释(在CTX缓冲液中 MIPla、MIPlb、RANTES，20nM贮存液(2x))。清洗细胞并以1 X IO7重悬于CTX缓冲液(HBSS, IOmM HEPES，0. 1%BSA)中(2x)。在深孔中准备封闭液抗体+配体，在顶孔中准备抗体+细 胞悬浮液。在101-5ChemOTXR(NeurOprObe)板上进行趋化性测定，在加湿培养箱中于37°C 孵育3小时。将细胞从过滤筛上部清洗和刮除，将板以2，OOOrpm离心10分钟。除去过滤 筛，从每个底孔取出IOml上清液。经冻/融后每孔加入10ml 2x CyQUANT (Invitrogen)，在 荧光板读数仪上读出结果。结果野生型Ab和afucosylated Ab有效阻滞了人CCR5细胞的迁移(表5)。表5
实施例6
|-Q258] CCR5+细胞的体内消耗食蟹猴以lmg/kg或10mg/kg接受1次单一的afucosylated Ab的静脉内输注。 数据以CCR5+细胞占所示血液中亚群(⑶8+和⑶4+T细胞，以及单核细胞)的百分比显示 (图 3)。实施例7体内消耗毒件研究目标监测⑶8+细胞、⑶4+细胞和单核细胞中的CCR5细胞表达。确定在用 afucosylated Ab处理的动物中⑶8+细胞是否消耗以确定对组织中CCR5表达的处理效果。· 12只动物4只对照，8只用21mg/kg/天·第1天和第15天给药·全血用于染色·在第 6 天预给药(pre-dose)、在第 1、2、4、8、15、16、18、22、29、36、43、50、57、64
和71天预给药。·在CD8+、CD4+、CD8+CD4+和单核细胞中对CCR5+染色(通过门控(gate))·在 CD8+ 和 CD4+ 中对 CXCR3+ 染色·使用计数微球(bead)确定消耗·在第8、15、18和71天对肾、淋巴结和骨髓中的CCR5染色结果显示于图4。实施例8抗体糖结构的分析为确定包含岩藻糖和非岩藻糖(非岩藻糖(afucose))的寡糖结构的相对比例，使 用MALDI-Tof质谱分析纯化的抗体材料释放的聚糖。为此，将抗体样品(约50yg)在0. IM pH6. 0磷酸钠缓冲液中与5mU N-糖苷酶F (Prozyme#GKE-5010B)于37°C孵育过夜以将寡糖 从蛋白质骨架中释放。之后使用NuTip-Carbon移液枪头(购自Glygen =NuTip 1-10 μ 1， Cat. Nr. #NT1CAR)将释放的聚糖结构分离和脱盐。作为第一步，用3 μ LIMNaOH、之后20 μ L 纯水(例如Baker的HPLC-梯度级，#4218)、3 μ L 30% (ν/ν)乙酸和再一次20 μ L纯净水清 洗NuTip-Carbon移液枪头以准备其用于结合寡糖。为此，将溶液分别上样至NuTip-Carbon 移液枪头的层析材料上端并推压出。之后，将上述N-糖苷酶F消化物吹打4到5次使对应 于10 μ g抗体的聚糖结构结合至NuTip-Carbon移液枪头中的材料上。用20 μ L纯水按上 述方法清洗结合在NuTip-Carbon移液枪头材料上的聚糖，并分别用0. 5 μ L 10%和2. Ομ L20%乙腈逐步洗脱。为此步骤，将洗脱溶液装在0.5mL反应瓶中并每个吹打4到5次。将2 次洗脱物组合以用于MALDI-Tof质谱分析。将0. 4 μ L组合的洗脱物与1. 6 μ L SDHB基质 溶液(2. 5-二羟基苯甲酸/2-羟基-5-甲氧基苯甲酸[Bruker Daltonics#209813,以5mg/ ml溶于20%乙醇/5mM NaCl])在MALDI靶上混合用于这一测量，使用调校合适的Bruker Ultraflex T0F/T0F仪器进行分析。常规的，记录50-300次照射并累加为一次实验。得到的 光谱使用flex分析软件(BrukerDaltonics)评估并测定每个检测峰的质量。之后，通过比 较计算质量和各个结构(例如复合、杂和以及寡或高甘露糖，分别地，含有和不含岩藻糖) 的理论预期质量，将峰归类于包含岩藻糖或非岩藻糖(afucose)(非岩藻糖)的糖结构。为测定杂和结构的比例，同时用N-糖苷酶F和糖苷内切糖苷酶H消化抗体样品。 N-糖苷酶F将所有N-连接的聚糖结构(复合、杂和、寡和高甘露糖结构)从蛋白质骨架中 释放，内切糖苷酶H在聚糖还原端切割另外在2个GIcNAC残基之间的所有杂和型聚糖。之 后按上述用于N-糖苷酶F消化的样品同样的方法将这一消化物处理和用MALDI-Tof质谱 分析。通过比较N-糖苷酶F消化物和N-糖苷酶F/内切糖苷酶H组合消化物的模式，使用 特定糖结构信号减少的程度估算杂和结构的相对含量。通过单个糖结构的峰高和所有检测到的糖结构的峰高总和的比例计算每种糖结 构的相对量。非岩藻糖的相对量为缺少岩藻糖的结构相对于在N-糖苷酶F处理样品中鉴 定出的所有糖结构的百分比(例如复合、杂和以及寡和高甘露糖结构，分别地)，见表6。表6 实施例9絲鍵)心麵嫌舯胃捕CCR5秘_痛吿丨丨摊从错配的供体动物处接受心脏移植的食蟹猴体内的CCR5+细胞消耗证实了单克 隆抗体X的效力。CCR5+细胞的数量在移植后4-5天的移植物中测量。此外单克隆抗体X 的免疫抑制效果以单独疗法评估，通过同种异体移植存活的持续时间测量。动物错配的成年雄性食蟹猴；体重约为3_6kg ；没有已存在的明显的病理，特别是没有 例如猿猴逆转录病毒的感染。N = I 期 5 个移植(A+B)[为确证I期的观察，也描述了以后的II期研究N= 10]移植步骤
所有步骤根据IA⑶C-认可的方案进行手术前血型，MLR (确认ABO相容性，高应答者=MHC错配)。封存的血清，淋巴细 胞(基线)。异位心脏移植(heterotopic heart transplant)( 一位供体，一位受体)，系绳放 置(tether placement)，第0天内植遥测装置。第4-5天、14天、28-30天和60天活检移植物(脾、淋巴结)，第90天外植。第90天或更早的移植物外植后30天处死动物。第0天、每次活检日和第21、45、75天抽血(细胞、血清)用于同种抗体、FACS和 RO水平，封存细胞用于以后的研究。第14天使用疫苗免疫，之后监控反应。研究计划作为单独疗法，与历史对照相比(6天)，抗CCR5抗体提供了显著更长的移植存活 (> 10天)。处理动物直至排斥或进行90天(视先发生的而定)。施用10mg/kgCCR5抗体(静脉内，每隔一周1次)直至移植后90天。在第3_5天 进行移植物活检和取血样，并分别用IHC和FACS评估。之后，在第14天取血样，1周1次至 第30天，之后2周1次。每月获得活检直至实验终止于移植失败或第90天(视先发生的 而定)。在终止时评估移植物的CAV。如果移植失败在第60天前发生，如果动物情况允许， 在移植物外植后将动物恢复以用于另外30天的免疫监控。实施例10(I 猴)心脏谢言It型中基于抗CCR5抗体的免疫抑制方案—— 组合疗法在另一个实验中评估了单克隆抗体X组合1种或多种其他免疫抑制剂的免疫抑制 效果，通过心脏同种异体移植血管病变(CAV)的发病率和严重性测量。使用的动物和移植步骤在实施例9中已描述。施用10mg/kgCCR5抗体(静脉内，每隔一周1次)直至移植后90天。组合疗法包 括开始剂量为12. 5mg/kg的环孢菌素A(CsA) (5_20mg/kg，使治疗波谷CsA水平> 300的给 药剂量)，由PI决定剂量直至移植物丧失。使用类固醇治疗急性排斥(通过3种心脏症状 中的2种诊断降低的移植心率、降低的移植物收缩力和升高的受体体温；活检确认诊断)。 在第4-5天和第14天进行移植物活检和取血样，并分别用IHC和FACS评估。之后，在第14 天取血样，1周1次至第30天，之后2周1次。每月获得活检直至实验终止于移植失败或第 90天(视先发生的而定)。在终止时评估移植物的CAV。如果移植失败在第60天前发生， 如果动物情况允许，在移植物外植后将动物恢复以用于另外30天的免疫监控。
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权利要求
与CCR5结合并在Asn297用糖链糖基化的抗体，所述抗体的特征在于，在所述糖链中的岩藻糖量为65％或更低。
2.根据权利要求1的抗体，其特征在于在所述糖链中的岩藻糖量为5%和65%之间。
3.根据权利要求1或2的抗体，其特征在于NGNA量为或更少，和/或N-端α-1， 3_半乳糖量为或更少。
4.根据权利要求1-3中任一项的抗体，其特征在于NGNA量为0.5%或更少。
5.根据权利要求1-4中任一项的抗体，其特征在于N-端α-1，3-半乳糖量为0.5%或 更少。
6.根据权利要求1-5中任一项的抗体，其特征在于抗体为嵌合的、人源化的或人抗体。
7.根据权利要求1-6中任一项的抗体，其特征在于与CCR5的亲和力为约10_13至 ICT9M(Kd)。
8.根据权利要求1-7中任一项的抗体，其特征在于包含SEQID NO :06的⑶Rs作为重 链互补决定区(CDRs)和SEQ ID NO 07的CDRs作为轻链CDRs, SEQ ID NO 08的CDRs作为 重链 CDRs 和 SEQ ID NO 09 的 CDRs 作为轻链 CDRs, SEQ ID NO 10 的 CDRs 作为重链 CDRs 和 SEQID NO 11 的 CDRs 作为轻链 CDRs，SEQ ID NO 12 的 CDRs 作为重链 CDRs 和 SEQ ID NO 13 的 CDRs 作为轻链 CDRs，SEQ ID NO 14 的 CDRs 作为重链 CDRs 和 SEQ ID NO 15 的 CDRs 作为轻链 CDRs，SEQ ID NO 16 的 CDRs 作为重链 CDRs 和 SEQ ID NO 19 的 CDRs 作为 轻链 CDRs, SEQ ID NO 16 的 CDRs 作为重链 CDRs 和 SEQ ID NO 20 的 CDRs 作为轻链 CDRs, SEQ ID NO 17 的 CDRs 作为重链 CDRs 和 SEQ ID NO 19 的 CDRs 作为轻链 CDRs，SEQ ID NO 17 的 CDRs 作为重链 CDRs 和 SEQID NO 20 的 CDRs 作为轻链 CDRs, SEQ ID NO 18 的 CDRs 作为重链⑶Rs和SEQ ID NO 19的⑶Rs作为轻链⑶Rs，或者SEQ ID NO 18的⑶Rs作为 重链CDRs和SEQ ID NO 20的CDRs作为轻链CDRs。
9.与CCR5结合的并在Asn297用糖链糖基化的抗体，所述抗体特征在于，显示了与 FcyRIII的高结合亲和力。
10.根据权利要求1-9中任一项的抗体在制备药物组合物中的用途。
11.药物组合物，其包含根据权利要求1-9的抗体。
12.制备包含根据权利要求1-9的抗体的药物组合物的方法。
13.治疗或预防在哺乳动物包括人中的急性和慢性器官移植排斥的方法，其特征在于 对所述哺乳动物施用根据权利要求1-9中任一项的抗体。
14.能够重组表达GnTIII和抗CCR5抗体的CHO细胞。
15.根据权利要求14的CHO细胞，其额外重组表达ManII。
16.根据权利要求1-9中任一项的抗体在制备用于治疗或预防在哺乳动物包括人中的 急性和慢性器官移植排斥的药物中的用途。
17.根据权利要求1-9中任一项的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预 防同种异体移植排斥或用于治疗炎症或用于治疗其他免疫介导疾病。
18.根据权利要求1-9中任一项的抗体在制备药物中的用途，所述药物在与免疫抑制 剂的组合疗法中用于治疗移植排斥。
19.根据权利要求18的用途，其特征在于所述免疫抑制剂为钙依赖磷酸酶抑制剂。
20.根据权利要求1-9中任一项的抗体在制备药物中的用途，所述药物在与免疫抑制剂的组合疗法中，用于治疗抗供体同种抗体产生。
21.根据权利要求17-20中任一项的用途，其特征在于所述抗体以10-25mg/kg的剂量 施用。
22.根据权利要求18-21中任一项的用途，其特征在于所述免疫抑制剂为环孢菌素A。
23.根据权利要求22的用途，其特征在于所述环孢菌素A以5-20mg/kg的剂量施用。
全文摘要
与CCR5结合并在Asn297用糖链糖基化的抗体，所述抗体特征在于，在所述糖链中为65％或更低的岩藻糖量在抗炎症治疗中具有改进的性能。
文档编号A61K39/395GK101918451SQ200980102290
公开日2010年12月15日 申请日期2009年1月13日 优先权日2008年1月15日
发明者A·贝尔松, D·C·博里, J·M·洛拉, J·奥尔, M·布兰特, S·里斯 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司