乙酰水杨酸盐用于治疗病毒感染的用途的制作方法

专利名称：乙酰水杨酸盐用于治疗病毒感染的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及含O-乙酰水杨酸和碱性氨基酸的盐的组合物用于制备药物组合物的 新型用途。现有技术和
背景技术：
流行性感冒(influenza)仍然属于具有大流行潜力的大病疫类型。仅存在少数药 物对抗该诱发性病原体，也即流行性感冒A病毒，它们全都是直接对抗该病毒。问题是会相 对快地产生抗性。此外，存在禽类中流行性发生的由H5流行性感冒A病毒感染引起的禽流 感(avian influenza)还传播到人类的风险。特别是与被感染的禽类接触的人员因此处于 高风险。特别地，必须注意的是，越来越密集地报道出H5W病毒对抗少数经证实有效的药 物(例如奥塞米韦(oseltamivir))。因此迫切需要新的和有效的用于预防和治疗病毒感染 的抗流行性感冒药物，并且如果可能的话，该药物应当不触发任何抗性。由文件W02004/060360A1已知，乙酰水杨酸能够抑制宿主细胞中的转录因子 NF-K B，和在该NF-K B信号通路的抑制过程中，必需的病毒成分将保留在细胞核中和不再 能整合到病毒颗粒中。从该文件中还已知的是，产气式地(aerogenic)给药乙酰水杨酸以 预防或治疗病毒感染。例如，从文件DE 10202019A1已知乙酰水杨酸和碱性氨基酸的盐，由此获得的制 剂被专用于口服给药。从该文献中，还获知了这种盐用于治疗下列疾病的用途风湿病、关 节炎、神经痛、肌痛、偏头痛、缺血性心脏病、卒中、心绞痛、心肌梗死、旁路手术、PTCA、支架 植入、用于刺激HIV患者的免疫系统、用于肿瘤预防、用于减缓因痴呆综合征引发的认知衰 退、用于抑制胆结石形成和/或治疗糖尿病。迄今已知的盐还已经以商品名Aspisol 用作 药物用于治疗哮喘、花粉病、鼻粘膜肿胀或慢性呼吸道感染，和除了口服给药之外，该已知 的盐还用于注射。所有这些疾病都不与由流行性感冒病毒引起的病毒感染直接关联。在动物模型中，纯乙酰水杨酸(其作为气溶胶吸入式给药到呼吸道或肺中)作为 抗病毒剂的用途原则上在动物模型中已经证实其自身是非常有利的。然而，对于人类，吸入 纯乙酰水杨酸会导致呼吸道的严重刺激。此外，在个别情况下，已经表明吸入乙酰水杨酸可 能导致某些敏感患者的哮喘发作。因此，在任何情况下，产气式地给药乙酰水杨酸作为抗流 行性感冒药物对于哮喘患者或具有哮喘风险的人员将是禁忌的。发明的技术目标因此，本发明的目标在于提供一种含有乙酰水杨酸的用于治疗病毒感染的配制 剂，其是特别好耐受的和特别是可靠地避免了引起哮喘发作的风险。本发明的基础和优选的实施方案为了实现该技术目标，本发明教导了包含生理学有效剂量的O-乙酰水杨酸和天 然或非天然碱性氨基酸的盐的组合物用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于预 防或治疗人类或动物(特别是哺乳动物和鸟类)的病毒感染。出于本发明的目的，特别是 被自然发生的野生型病毒感染，而不是被基因改性的病毒感染，被称为病毒感染。在鸟类，特别是禽类，例如鸡、鹅、鸭、肉用母鸡、火鸡、鹌鹑或鸽子，还有鸣禽被涉
3及用来预防或治疗。通过使用这样的盐，特别是在产气式地给药时，由于在给药的配制剂中活性物质 不是酸，避免了组织(例如呼吸道粘膜)的刺激。由此，可靠地防止了患者中由哮喘引起的 哮喘发作或者具有此风险的人员，并且在实践中对于作为治疗剂和预防剂广泛施加没有障 碍，其原因是不存在副作用风险，更多地是因为该配制剂甚至已经用作抗哮喘药物。此外， 正如本发明已经发现，抑制病毒复制没有因乙酰水杨酸的衍生化而受到影响，这是没有预 料到的；出乎意料的是，其甚至有时还略微增加了。优选的是，如果所述碱性氨基酸选自包括下列的组“赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、二 氨基丁酸和所述酸的混合物”，所述乙酰水杨酸盐优选是单乙酰水杨酸盐。氨基酸是α-氨 基羧酸，和在α-原子上，氢或任意残基可以作为侧链键合。碱性氨基酸可以在侧链包括一 个或者多个碱性基团，特别是氨基。所述碱性氨基酸可以特别为D-赖氨酸、L-赖氨酸或者 D-赖氨酸和L-赖氨酸的混合物。所述制剂可以另外包括ο-乙酰水杨酸与天然或非天然的带非碱性侧链的氨基酸 的盐，特别是与甘氨酸的盐。在组合物中赖氨酸对甘氨酸的重量比可以为100 1-1 1， 特别是100 1-10 1。优选的是氨基酸赖氨酸和甘氨酸的盐的混合物。特别优选的是盐
或盐的混合物，例如以商品名Aspisol 市售的组合物，比如以水溶液的形式。出于本发明目的，还可以使用这样的药物组合物，其包含在服用或给药后经由生 物体自然代谢成根据本发明所用的活性物质的前药。根据本发明，所用的组合物可以用于预防或治疗多种病毒感染。所述组合物特别 适合用于预防或治疗带负链RNA病毒的感染，例如流行性感冒病毒，优选流行性感冒A病 毒，特别是H5或H7型病毒。但是，还已经发现根据本发明所用的物质抑制病毒诱导的细胞因子的过表达(“细 胞因子风暴(cytokine storm)”)，其以NF-K B依赖性的方式调节。因此，借助根据本发明 的物质，许多病毒的致病性(pathogenity)通常会降低，其致病潜力尤其与细胞因子的过 度表达相关。因此，根据本发明所用的组合物还适合于治疗和预防由冠状病毒(SARS)、呼吸 道合胞体病毒(Respiratory Syncytial Virus) (RSV)、纤丝病毒例如马尔堡病毒(Marburg virus)或埃博拉病毒(Ebola virus)、沙状病毒(arena virus)例如拉沙病毒(Lassa virus)、阿根廷、玻利维亚或委内瑞拉出血热病毒，汉坦病毒、黄病毒例如登革热病毒或者 黄热病病毒，克里米亚_刚果出血热病毒，裂谷热病毒，副流行性感冒病毒(1、2和3型)、鼻 病毒、人类偏肺病毒(hMPV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus)引起的病毒感
染ο根据本发明使用的药物组合物的盖仑制剂(galenic pr印aration)可以以本技术 领域中常规的方式制备，并且原则上可以以任意给药类型实施，例如口服、注射或者产气式 地用于吸入给药。合适的固体或液体盖仑制剂形式例如是颗粒、粉末、锭剂、片剂、(微)胶 囊、栓剂、糖浆、果汁、悬浮液、乳液、滴剂或者可注射的溶液(i. v.，i. p.，i. m. , s. c.)或者 微细分散体(气溶胶)、经皮体系和延迟释放活性物质的制剂，为了制备它们使用了常规手 段，例如载体物质、爆炸剂(explosive)、粘合剂、包衣、溶胀剂、滑动剂或润滑剂、增味剂、甜 味剂和增溶剂(solution mediator)。作为辅助物质在此提到碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露 醇和其它糖类、滑石、乳蛋白、明胶、淀粉、纤维素及其衍生物、动物和植物油例如鳕鱼肝油、葵花籽油、花生油或芝麻油，聚乙二醇和溶剂例如灭菌水和一元或多元醇，例如甘油或这些 溶剂的混合物。根据本发明的药物组合物可以通过如下方式制备将至少一种根据本发明 的盐以界定剂量与药学上合适的和生理学上良好耐受的载体以及可能的额外的合适的活 性物质、添加物质或辅助物质混合，并以所需的给药形式准备。口服给药的制剂实例例如参 见于文件DE 10202019A1和其中所引述的文件中。但是，优选地，用于产气式地、鼻腔给药的盖仑制剂作为液体的含水组合物(溶 液)，或者作为粉末，如果可能的话在推进剂(propellant)中的悬浮液中，例如将在室温下 液化的推进剂，例如CFCs，氢氟代烷烃，例如1，1，1，2-四氟乙烷或者1，1，1，2，3，3，3-七氟 丙烷、丙烷、丁烷、异丁烷或者其它在医用气溶胶配制剂领域中常用的推进剂。作为所提到 的推进剂的补充或者替代，还可以使用空气、氧气、氮气、二氧化碳或者一氧化二氮。所述组 合物可以包括医用气溶胶配制剂的常见添加物质和辅助物质，例如比如生理学上良好耐受 的表面活性物质和/或常规的分散剂。此外，所述含水组合物优选是所述盐或者所述盐的混合物的0. OlmM-3. 0M、优选 0. 5-3. 0M,或者0. Ol-IOOmM,特别是0. I-IOmM的含水溶液。优选的是，所述气溶胶的颗粒尺寸(如果其为溶液，如果其为固体材料形式的盐 或者其为悬浮液形式的盐)具有小于10微米，优选小于5微米的MMAD值(质量中值气体 动力学直径(mass median aerodynamic diameter))。为了测定气体动力学颗粒尺寸分布 FPD(微细颗粒剂量)或者FPF(微细颗粒级分)，冲击器(impactor)是合适的，例如比如 5_段式的多段式液体碰撞取样器(MSLI)或者8段式的Andersen级联冲击器(ACI)，其记载 在美国药典(USP)的第601章或者欧洲药典(Ph. Eur.)的Inhalanda Monograph中。基于 气体动力学颗粒分布，气溶胶制剂的MMAD值可以通过“log-概率点”进行计算。通过优选 的MMAD值，获得了可呼吸性的气溶胶颗粒，其达到肺的深处(de印part)，使得在常规的给 药期间在整个肺部获得足够的浓度。为了防止小颗粒被再次呼出，可以为MMAD值设定0. 1 微米，优选0. 5微米，非常优选1微米的下限。根据本发明使用的盐可以被减小成小片或者以常规方式微粉化以获得合意 的MMAD值，例如通过圆锥磨机(pinned disk mill)、球磨机或者空气射流磨机(air separation mill)。根据本发明的气溶胶的给药可以借助所有带气溶胶产生器(例如蒸发器或喷 雾器)的吸入装置进行，正如在医学领域中常用的那些。实例是粉末气溶胶蒸发器或者 DPI (干粉吸入器)、喷嘴、超声或者振动膜喷雾器。此外，可以使用利用电流体动力学原理 的气溶胶产生器或者来自液体配制剂的凝聚式气溶胶。合适的吸入装置的实例记载在文件 EP1741460A, EP 1700614A, EP 1258264A 和 EP 1163921A 中。就所用的气溶胶产生器的通过率而言，组合物中的盐浓度经选择使得至少10毫 克、优选至少50毫克，非常优选至少100毫克的盐转变成气溶胶并在低于5分钟、优选2分 钟，非常优选1分钟的时间内给药至患者。此外，有用于最优化肺部淀积的是，呼吸流或者呼吸体积经检查和调节。在吸气 流太快的情况下，气溶胶颗粒会已经冲击到喉咙后壁(pharyngeal background)或者在声 门处分离。如果呼吸过于平缓，气溶胶颗粒会仅仅接触到上呼吸道而不是肺的深处(deep part)。因此，所用的吸入系统应当保证患者深入、缓慢的吸入。对于儿童，吸入体积应当
5为至少200毫升，优选至少500毫升。对于成人，吸入体积应当为至少300毫升，优选至少 500毫升。合适地，这种气溶胶体积的吸入应当在至少Is、更好地至少3s、优选地至少5s 的时间内完成。吸气流应当有利地调节为低于1000ml/S，特别是低于500ml/s，特别是低于 300ml/s，和将呼吸体积调节为相对于患者的吸气量的至少20%、特别是至少30%，优选至 少50%，至多95%。后者确保了患者一方面缓慢而另一方面深入的吸入。对于本发明目的，可以使用吸入体系，其利用传感器测量上述参数并借助电学、声 学和/或光学信号提供关于适当或不适当的吸入的信息。就以此方式工作的吸入装置而 言，参见上述文件。在简单吸入体系的情况下，还可以设想将带有上述测量的患者信息表添 加到药物组合物中。因此，本发明还涉及这样的气溶胶配制剂，其包括O-乙酰水杨酸与天然或非天 然的碱性氨基酸的盐、推进剂和任选的辅助物质和/或载体物质。所述盐的含量可以为 0. 001-50重量％。0. 001-10重量％，特别是0. 1-10重量％或者10-50重量％，特别是30-50 重量％的量，相对于整个配制剂而言。如果所述盐以颗粒形式存在，那么其可以具有低于10 微米、特别是低于5微米的MMAD值。特别是在使用上述的高浓度的情况下，出人意料的是，由这样的溶液产生的气溶 胶颗粒能够以上述小颗粒尺寸制备。此外，本发明还涉及根据本发明的气溶胶配制剂用于预防或治疗人类或动物的病 毒感染的用途，其中向处于病毒感染风险或者被病毒感染的人类或者这样的动物产气式地 给药生理学有效量的气溶胶配制剂，以经鼻或口吸入。最后，本发明涉及具有供料罐(supply tank)和连接到该供料罐的气溶胶产生器 的吸入装置，其中所述供料罐含有根据本发明的气溶胶配制剂。在气溶胶发生器的出口处 通常连接有喷口(mouthpiece)。此外，可以配备有空气泵，藉此在控制装置的控制下，吸气 流和/或吸入体积受到控制。可以配备用于控制和/或调节吸气流和呼吸体积的控制和/ 或调节机构，且所述控制和/或调节机构优选经调节为上述值。针对本发明的药物组合物的上述阐述也以类比的方式适用于根据本发明的气溶 胶配制剂，其用途和吸入装置。在下面，本发明将参照实施例进行更详细地解释。实施例1 抗性现象的研究因为特别是将要讨论乙酰水杨酸作为细胞因子的抗病毒作用抑制剂的抗性问题， 将形成抗性变种的趋势与直接作用于病毒的药物金刚烷胺和奥塞米韦进行比较。A549肺部 上皮细胞由高致病性禽流感A病毒隔离群(isolate) A/FPV/Bratislava/79(H7N7) (FPV，禽 瘟病毒(fowl plague virus))感染，其MOI = 0. 01 (感染复制数)，并在存在或不存在乙酰 水杨酸(5mM)、金刚烷胺(5μΜ)和奥塞米韦(2μΜ)的情况下再孵育24小时。在分开的批 次中，Α549肺部上皮细胞由A/FPV/Bratislava/79(H7N7)感染，其MOI = 0.001，并在存在 或不存在赖氨酸_甘氨酸_乙酰水杨酸盐(5mM)和奥塞米韦(2 μ Μ)的情况下再孵育24小 时。然后，针对两个批次收集每个样品的细胞上清液，并在MDCK细胞上测定噬菌斑测定中 的病毒滴度。所述上清液随后经规格化和再次用于在相同的条件下用各自相同数量的病毒 感染第二个经处理或者未经处理的细胞通过。这种工序重复总共至多到第五次或第八次通 过。
在图IA中，用乙酰水杨酸或金刚烷胺或奥塞米韦处理过的细胞的病毒滴度与未 经处理的细胞的上清液的滴度进行比较。在第三次通过中已经可以看出，经金刚烷胺处理 的细胞的病毒滴度再次显著增加，这是因为形成了抗性的变种。出人意料地，在此处选择的 实验条件下，还发现奥塞米韦处于可比较的程度。与此明确不同的是，发现乙酰水杨酸甚 至在第5次通过中仍然具有与第一次通过中不变的相同抗病毒活性。在图IB中，用赖氨 酸_甘氨酸_乙酰水杨酸盐或者奥赛米韦进行处理的细胞的病毒滴度与未经处理的细胞的 上清液的滴度进行比较。对于赖氨酸-甘氨酸-乙酰水杨酸盐，同样获得了在图IA中所述 的结果，并且在用赖氨酸_甘氨酸乙酰水杨酸盐处理后甚至在8次通过后仍然不能检测到 病毒抗性形成。所得的结果充分地适合于说明，乙酰水杨酸和赖氨酸_甘氨酸_乙酰水杨 酸盐完全不具有在细胞培养中形成抗性变种的趋势。实施例2 :赖氨酸_甘氨酸_乙酰水杨酸盐配制剂的抗高致病性流行性感冒A病 毒的抗病毒活性研究。所研究的组合物是lys-gly-乙酰水杨酸盐(在下文中也被称为LG-乙酰水杨酸 盐)，其对应于产品Aspisol (可由Bayer AG获得)的分子组成。该配制剂经受抗流行性感冒病毒的抗病毒活性的研究。A549肺部上皮细胞经由 A/FPV/Brat is lava/79 (H7N7) (MOI = 0. 01)感染并在存在或不存在乙酰水杨酸(5mM)或 LG-乙酰水杨酸盐(5mM)的情况下孵育8小时、24小时和36小时。随后收集各样品的细胞 上清液，并由此在MDCK细胞上测定噬菌斑测定中的病毒滴度。图2显示出病毒滴度对时间 的图。结果为LG-乙酰水杨酸盐和乙酰水杨酸一样等同有效地抑制高致病性鸟类H7N7隔 离群的病毒增殖。在用H5W亚种的高致病性隔离群进行感染后，同样是这种情形，正如图3所示。 A549肺部上皮细胞经由人类H5m隔离群A/Thai land/KAN-1/2004 (MOI = 0.001)感染，并 在存在或不存在上述浓度的乙酰水杨酸或LG乙酰水杨酸的情况下孵育。研究所述细胞上 清液，以测定在MDCK细胞上的噬菌斑测定中的病毒滴度。图3A示出了 20小时的时间值， 在图3B中以生长动力学图示出了病毒滴度。在两种情况下，都可以看出H5W菌株的病毒 滴度的有效抑制，抑制程度为十的几次幂(several decimal power) 0因为在体外的高抗病毒潜力，可以假定LG-乙酰水杨酸盐配制剂适合作为可吸入 给药用的抗流行性感冒活性物质。实施例3 在细胞培养体系中，LG-乙酰水杨酸盐对高致病性禽流感病毒的影响。MDCKII 细胞在 MEM-介质(MEM ；Gibco (Invitrogen)德国 21430-079，批次 32034) 中通过添加10%的热灭活的胎牛血清(FCS，PAA Laboratories/A04305-0346)，盘尼西林 (Grunenthal/616G03)和链霉素(Sanavita/03056440111)进行培养。为了进行感染，将 所述细胞播洒在24孔板(8xl04细胞/孔；Greiner，德国，No. 662160，批次05210151)中 和在37°C孵育过夜。在感染之前，所述细胞用PBS洗涤，将相应的病毒(FPV，SNl, MBl) 在 PBS/BA(补充有 0. 6% BA 的 PBS(MP Biomedicals), ImM MgCl2,0. 9mM CaCl2，盘尼西林 (Grunenthal/616G03)和链霉素)稀释，并在细胞菌苔(cell lawn)上用0. 001的MOI滴 定。在于37°C孵育30分钟后，去除病毒接种物，向所述细胞添加Iml MEM介质或者含有5mM LG-乙酰水杨酸盐的MEM介质。在感染8、24、32和48小时后，取出各个上清液。在“噬菌 斑测定”中验证到感染病毒颗粒的存在。
对于“噬菌斑测定”而言，将MDCKII细胞播撒到96孔板中，使得细胞菌苔在第 二天融合。所述细胞用PBS洗涤并用上清液的稀释液感染(于37°C将所述上清液的稀 释液布置在PBS/ΒΑ中达60分钟)。在孵育后，所述细胞用Avicel介质混合物(Avicel RC-581 (FMC/B624C))涂覆。为此，将2. 5 %的Avicel溶液与相同量的2x MEM-介质混 合。在20小时的孵育时间后，去除Avicel介质混合物，所述细胞用在PBS中的4%Roti -Histofix (Roth/32789170)溶液在4°C固定30分钟，随后用PBS进行洗涤。对于染色所必 需的后续加工步骤在室温实施。通过用在PBS中的0. 3% Triton-X-100 (Serva/30043)进 行孵育，对所述细胞进行透化。病毒感染的细胞用免疫组织学方法染色。为此，将细胞用单 克隆抗体(Serotec/250107)(其为针对流行性感冒A病毒核蛋白特异性的)孵育1小时。 经感染的细胞的检测通过用过氧化物酶结合的抗小鼠抗体(DIAN0VA/75790)的另一次孵 育(30分钟)和添加True Blue 过氧化物酶底物(KPL/070490)进行。所述抗体的稀释在 含10% FCS和0. 1% Tween-20(Serva/16211)的PBS中实施。在用第一和第二抗体孵育后， 所述细胞用PBS/0. 1% Tween-20洗涤5分钟达三次。为了终止反应，所述板用自来水洗涤 并经干燥。经干燥的板经扫描并借助Corel DRAW 9. 0软件评估。为了测定上清液的病毒 滴度，经感染的细胞(病灶)在96孔板的每个孔中的累积经计数。计数的病灶的数目与各 自的稀释因子相乘。从所计算出的值，测定对于每个样品的平均值。病毒滴度作为平均值 的IoglO值记录。所述结果在图4中示出。可以看出，在用LG-乙酰水杨酸盐处理后，H7W病毒 (FPV)和H5m病毒(MBl)的复制在细胞培养体系中有时降低了超过99%。实施例4 =LG-乙酰水杨酸盐的抗病毒活性所基于的分子作用机制研究。此外，研究了 LG-乙酰水杨酸盐的分子作用曲线是否能和纯乙酰水杨酸物质相比 较。LG-乙酰水杨酸盐应当充当NF-κ B抑制剂和相应地不具有任何在其它病毒诱导信号 通路上的副作用。重要的信号介体类型(其在流行性感冒病毒感染后也被活化)是人们所 说的丝裂原(mitogen)激活的蛋白质激酶(MAPK)。其包括激酶JNK、p38和ERK。对于纯物 质乙酰水杨酸而言，已经示出这些激酶的病毒诱导活化不受乙酰水杨酸的抑制。如图5所 示，在LG-乙酰水杨酸盐的情况下也是如此JNK、p38和ERK(图5，径迹5)的病毒诱导活 性(其可以借助磷光体特异性抗体对抗这些激酶在免疫印迹(Western blot)中的活性形 式进行检测)没有通过添加5mM(径迹7)或者7mM乙酰水杨酸(径迹9)而阻断。乙酰水 杨酸以通过抑制促凋亡因子表达的抗病毒方式起作用，其最终将导致在细胞中降低的半胱 天冬酶活性。基于免疫印迹，图6针对LG-乙酰水杨酸盐也显示了这一点，通过半胱天冬酶 底物聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)的裂解显示了半胱天冬酶活性。在30小时后清楚可见的 裂解PARP带(径迹6)在用LG-乙酰水杨酸盐处理的样品(径迹7)中有效降低。在病毒复制中NF- κ B依赖性的步骤是病毒核糖核蛋白络合物(RNP)的半胱天冬 酶依赖性输出到细胞质中，其可以随后在细胞膜中在新的病毒颗粒中形成。乙酰水杨酸 特异性地阻断这一步骤，而不对增殖周期更早的阶段中的病毒蛋白质积累起作用。对于 LG-乙酰水杨酸盐而言，相同的作用机制适用图7在免疫印迹中示出了病毒蛋白质M1、NP、 NSl和PBl的积累没有受LG-乙酰水杨酸盐的抑制。但是，与在前文中针对纯物质乙酰水杨 酸已经描述的相同，已经发现病毒RNP络合物的有效保留，正如将在图8中由免疫荧光分析 中变得清楚的那样。
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由此能够得出结论LG_乙酰水杨酸具有和乙酰水杨酸一样的抗病毒潜力，并以 在病毒增殖上的抑制方式中相同的分子机制起作用。实施例5 在LG-乙酰水杨酸盐处理之后，IPlO和干扰素-Y m-RNA表达水平的降 低。已知过度的细胞因子产生(所谓的细胞因子风暴)是H5m流行性感冒病毒感染 的重要致病性因素。因为这些细胞因子中的大部分以NF-K B依赖性的方式调节，证实了 LG-ASA是否能够抑制病毒诱导的细胞因子的表达和因此是否能够额外间接影响这些病毒 的致病性。从我们的准备工作中，已知在小鼠肺部被H5m (MBl)感染后，IPlO和IFN-Y被 调节为高。这些趋化因子或者细胞因子的表达由转录因子NF-κ B诱导。基于更早的发现， 能够表明阿司匹林充当NF-K B抑制剂。本实验的目标在于发现LG-乙酰水杨酸盐是否在H5W感染后在小鼠肺部中充 当NF-K B抑制剂。为此，研究了在MBI感染之前或者期间用LG-乙酰水杨酸盐处理小鼠 是否在两种趋化因子或细胞因子的表达率上有影响。对于该实验，在感染(感染剂量 lxl03pfu/50y l)i. v. (100 μ 1)和 i. p. (200 μ 1))前一小时，五只 Balb/c 小鼠均用 50mM LG-乙酰水杨酸盐处理。进一步的处理在感染后17、24和42小时实施。在48小时p. i.后， 取出肺部并分离出RNA。将用LG-乙酰水杨酸盐处理的小鼠的小鼠肺部中的IPlO和IFN- γ 表达与对比动物的比较借助定量的RT-PCR验证。数据示出在图9中。未处理小鼠的IPlO和IFN-Y的表达被设定为100%，以能够更清楚地进行比较。 在经静脉和腹膜内处理途径用LG-乙酰水杨酸盐处理4次后，对于趋化因子和细胞因子 两者均能检测到m-RNA表达的下降。静脉内处理途径显示出62%的IPlO下降和68%的 IFN-Y下降，其效果高于腹膜内处理途径中26%的IPlO下降和50%的IFN-γ下降。所述结果表明H5W病毒诱导的NF- κ B依赖性基因表达在用LG-乙酰水杨酸盐处 理的感染小鼠肺部中强烈下降。这是重要的，因为在H5m病毒感染后观察到细胞因子的过 度产生(“细胞因子风暴”)，该细胞因子在很大程度上以NF-K B依赖性的方式调节，非常 有助于这些病毒的致病性。因此，LG-ASA不仅能直接影响病毒复制，而且还能通过降低过 度的细胞因子产生以积极方式间接影响疾病过程。实施例6 相容性研究。在下面实验中，测试了在气溶胶处理小鼠后LG-乙酰水杨酸盐的相容性。为了尽 可能精确地监测处理的影响，所述实验借助小鼠监测系统进行。这允许实时测量温度。每 5分钟测定和绘制一个温度值(

图10A-F)。此外，所述动物每天称重。在处理结束后，杀死 小鼠，并测定肝脏和脾脏的器官重量。在肝毒性的第一迹象中，已经导致肝脏的尺寸增大。 另一方面，脾脏的尺寸增大是发炎过程的迹象。对于相容性研究，在处理前3天，将小鼠监测发射机植入总共12只雌性Balb/c 小鼠中。在3天内监测到成功的介入。然后，6只小鼠各通过Pari喷雾器每天用2ml的 50mM LG-乙酰水杨酸盐溶液处理三次。6只小鼠充当对照，其用2ml PBS处理。所述溶液 在1. 5bar的压力下雾化，使得所述处理花了大约10分钟。所述处理每天于9:00点；12:00 点和15:00点实施，持续5天。LG-乙酰水杨酸盐在重量变化上的影响经调查。从被处理的那一天起并在第一次 治疗前(9:00点)，对所有小鼠进行称重。治疗第一天的重量被设定为100%，在随后的日子中测得的体重以此为参照。两组处理的对比导致在图11中示出的图。可以发现在LG-乙 酰水杨酸盐组和PBS处理组之间没有显著的体重变化区别。此外，研究了 LG-乙酰水杨酸盐对体温的影响。正如已经提到的，小鼠监测体系 允许实时测定小鼠的体温。因为小鼠具有高的新陈代谢，健康的极小变化已经导致体温的 变化。在图10中，示出了从处理前1天开始(图10A)到处理结束(第4天(day+4))(图 10F)的温度曲线。可以看出，当与对照动物进行比较时，LG-乙酰水杨酸盐处理的小鼠就体 温而言没有区别。最后，研究了 LG-乙酰水杨酸盐对肝脏和脾脏重量的影响。在最后一次处理15分 钟后，杀死所有动物，并进行尸体解剖。在经腔静脉完全放血后，检查内脏器官。肺部首先 以未塌缩的状态经隔膜检查。肝脏和脾脏经称重。结果在图13中示出。因为小鼠的体重 在处理期间没有显著变化，器官重量的规格化可以省去。对于脾脏(图12A)和肝脏(图 12B)，在经LG-乙酰水杨酸盐处理的动物和对照动物的器官重量上未能发现显著变化。因 此，在小鼠的吸入性处理后，没有观察到肝脏毒性(其通常伴有器官肿胀)的迹象。此外， 没有观察到系统性炎症反应，通常伴随着脾脏尺寸的增大。从上下文研究总结得出，在5天的时间内吸入性给药2ml浓度为50mM的LG-乙酰 水杨酸盐对于小鼠是良好相容的。实施例7:患者试验。在治疗尝试中，向4位支气管感染的患者给药溶液，该溶液含有至多2M的 LG-ASA(50 50)并被蒸发到小于5微米的颗粒尺寸。LG-ASA的总量为至多350毫克。将 吸气流调节为低于500ml/s，在大多数情况下低于300ml/s。呼吸体积为患者吸气量的至少 30%，在大多数情况下为至少50%。对于这些患者中的三位，在给药后的第一天已经检测到症状的显著改善。对于所 有其它患者，在给药后的第3天发生了症状的改善。这些在溶液中的高浓度的主观感知相 容性是优异的。没有患者报道有味道刺激。此外，没有检测到极端的咳嗽冲动。
权利要求
含有o 乙酰水杨酸与天然或非天然碱性氨基酸的盐的组合物用于制备用以预防或治疗人类或动物的病毒感染的药物组合物的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述碱性氨基酸选自由下列组成的组“赖氨酸、精氨酸、鸟 氨酸、二氨基丁酸和这些氨基酸的混合物”，优选单-乙酰水杨酸盐，且其中任选地可以含有 额外的ο-乙酰水杨酸与带非碱性侧链的天然或非天然氨基酸的盐，特别是与甘氨酸的盐。
3.权利要求2的用途，其中所述碱性氨基酸是D-赖氨酸、L-赖氨酸或D-赖氨酸和 L-赖氨酸的混合物。
4.权利要求1-3之一的用途，用于预防或治疗负链RNA病毒，优选流行性感冒A病毒、 特别是H5或H7型病毒的感染。
5.权利要求1-4之一的用途，在作为液体、含水的组合物的盖仑制剂中，特别是用于产 气式地给药，例如经鼻给药。
6.权利要求5的用途，其中所述含水组合物是所述盐的0.1-5M，特别地0. 1-3M，优选 1-3M的含水溶液。
7.权利要求5的用途，其中所述含水组合物是所述盐的0.Ol-lOOmM，特别是0. I-IOmM 的含水溶液。
8.权利要求1-7之一的用途，其中所述组合物设置在带有蒸发器或喷雾器的药学相容 的罐中。
9.权利要求8的用途，其中所述罐经制备以将吸气流调节为低于1000ml/S，优选低于 500ml/s，特别是低于300ml/s，并将呼吸体积调节为相对于患者的吸气量至少10%，特别 是至少30%，优选至少50%，至多95%。
10.含有ο-乙酰水杨酸与天然或非天然的碱性氨基酸的盐、推进剂和任选的辅助物质 和/或载体物质的气溶胶配制剂。
11.权利要求10的气溶胶配制剂，其中所述盐的含量为0.001-50重量％，0. 001-10重 量％，特别是0. 1-10重量％，或者特别是10-50重量％，相对于总的配制剂计。
12.权利要求10或11的气溶胶配制剂，其中含有颗粒形式或者溶液形式的MMAD值低 于10微米、特别是低于5微米的盐。
13.权利要求10-12之一的气溶胶配制剂用于预防或治疗人类或者动物的病毒感染的 用途，其中向处于病毒感染风险或者被病毒感染的人类或者这样的动物产气式地给药生理 学有效量的气溶胶配制剂，以经鼻或口吸入。
14.权利要求13的用途，其中产气式地给药至少10毫克、优选至少50毫克、非常优选 至少100毫克，直至超过200毫克的气溶胶配制剂，并优选在低于5分钟、优选低于2分钟、 非常优选低于1分钟的时间内进行。
15.权利要求13或14的用途，其中将所述吸气流调节为低于1000ml/S，特别是低 于500ml/s，特别是低于300ml/s，且其中将呼吸体积调节为相对于患者的吸气量的至少 20%，特别是至少30%，优选至少50%，至多95%。
16.带有供料罐和连接到该供料罐的气溶胶产生器的吸入装置，其中所述供料罐含有 根据权利要求10-12之一的气溶胶配制剂。
17.权利要求16的吸入装置，带有用于控制和/或调节吸气流和呼吸体积的控制和/ 或调节机构，其中所述控制和/或调节机构优选经调节到根据权利要求13的值。
全文摘要
本发明涉及含有o-乙酰水杨酸与碱性氨基酸的盐的组合物用于制备用以预防或治疗人类或动物(特别是哺乳动物和鸟类)的病毒感染的药物组合物的用途。
文档编号A61P31/16GK101909650SQ200980102181
公开日2010年12月8日 申请日期2009年1月14日 优先权日2008年1月14日
发明者G·朔伊希, O·普兰兹, S·路德维希 申请人:艾克蒂维罗有限责任公司