专利名称：乙酰水杨酸作为酪氨酸酶抑制剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及乙酰水杨酸的用途，具体涉及乙酰水杨酸作为酪氨酸酶抑制剂在制备美白化妆品中的应用。
背景技术：
酪氨酸酶是引起蔬菜、水果褐变，动物表皮和眼睛中色素堆积的关键酶(I. Kuboj I. Kinst-Horij S. K. Chaudhurij Y. Kuboj Y. Sanchez, and T. Ogura. Bioorg MedChem 8(2000) : 1749-1755)。酪氨酸酶在结构上属于第三类铜蛋白家族(Μ· Sendovski，Μ.Kanteevj V. S. Ben-Yosef, N. Adirj and A. Fishman. J Mol Biol 405(2011):227-237 ；Y. Matobaj N. Bandoj K. Odaj M. Nodaj F. Higashikawaj T. Kumagaij and M. Sugiyama. J BiolChem286(2011) :30219-30231),在活性部位2个铜离子分别与3个组氨酸相连，并且这2个铜离子与不同的催化反应直接相关，如单酚羟基化为二酚(甲酚酶活性)和二酚 氧化为二醌(邻苯二酌·氧化酶活性)(H. Decker and F. Tuczek. Trends Biochem Sci25(2000) :392-397)0酪氨酸酶可以催化形成黑色素，在哺乳动物体内，其活性增高会导致黄褐斑等黑色素过度沉积疾病的发生(C. Olivares and F. Solano. Pigment Cell MelanomaRes22 (2009) : 750-760 ；K. Jimbow, J. S. Park, F. Katoj K. Hirosakij K. Toyofukuj C. Huaj andT. Yamashita. Pigment Cell Res 13 (2000) : 222-229 ；K. Ray, M. Chakij and M. Senqupta.Prog Retin Eye Res 26 (2007) : 323-358)。由于它在色素形成中的作用，酪氨酸酶常作为活性革巴子用于寻找各种脱色剂的研究(S. Brigantij E. Camera, and M. Picardo. Pigment CellResl6，101-110(2003) ；D. S. Kimj S. Y. Kimj S. H. Park, Y. G. Choi, S. B. Kwonj M. K. Kimj J.I.Na, S. W. Younj and K. C. Park. Biol Pharm Bull 28 (2005) : 2216-2219 ；S. Parvezj M.Kang, H. S. Chung, and H. Bae. Phytother Res 21 (2007) : 805-816 ；F. Solano, S.Brigantij M. Picardo, and G. Ghanem. Pigment Cell Res 19 (2006) :550-571)。乙酰水杨酸又名阿司匹林，具有解热镇痛功能，用于治疗感冒、发热、头疼、牙痛、关节痛、风湿病，还用于预防和治疗缺血性心脏病、心绞痛、心肺梗塞、脑血栓形成等(V.Limmrothj Z. Katsaravaj H. C. Dienerj Acetylsalicylic acid in thetreatment of headache, Cephalalgia 19 (1999) : 545-551 ；N. D. Yeomans, C. J. Hawkey, W.BrailsfordjJ.Naesdalj Gastroduodenal toxicity of low-dose acetylsalicylicacid:a comparison with non-steroidalanti-inflammatory drugs,Curr. Med. Res.Opin. 25(2009) :2785-2793 ；A. R. Redman, G. J. Ryan, Analysis of trials evaluatingcombinations of acetylsalicylic acid and dipyridamole in the secondaryprevention of stroke,Clin. Ther. 23(2001):1391-1408 ；Y.DaijJ. Ge，Clinical useof aspirin in treatment and prevention of cardiovascular disease, Thrombosis2012 (2012) : 245037 ；E. V. Paez Espinosa, J. P. Murad, F. T. Khasawnehj Aspirin: pharmacology and clinical applications, Thrombosis. 2012(2012) :173124 ；J.Cheung, J.Rajalaj D. Moroz, Q. Zhuj M. Stamm, G. S. Sandhaj Acetylsalicylic acid use in patientswith acute myocardial infarction and peptic ulcer bleeding, Can. J. Gastroenterol.23(2009) :619-623.)。目前对乙酰水杨酸的其他功能方面的研究非常少，对于其他功能与应用的研究尚未有其他相关的研究和报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乙酰水杨酸的新用途，即乙酰水杨酸作为酪氨酸酶抑制剂的应用，乙酰水杨酸可应用于生产美白化妆品。为实现上述目的，发明人对乙酰水杨酸对酪氨酸酶的抑制效果和抑制机理进行了研究，提出了乙酰水杨酸作为酪氨酸酶抑制剂的应用。该化合物的结构式为 T本发明提供的技术方案如下乙酰水杨酸作为酪氨酸酶抑制剂在制备美白化妆品中的应用。所述乙酰水杨酸的用量占所述化妆品总质量的O. 59Γ3. 6%。应用时，先将相应乙酰水杨酸溶解于磷酸缓冲液中；将O. 05%的对羟基苯甲酸甲酯溶于2%乙醇中，加入O. 01%精油和71. 24%上述乙酰水杨酸溶液，搅拌均匀；然后取3%的羧甲基纤维素边缓慢搅拌边加入15%的聚乙二醇和2%的聚乙烯吡咯烷酮，搅拌至黏液状，与上述混合液混合，再向其添加5%甘油、维生素E 1%混合，边搅拌边加入吐温-60 O. 7%，使之乳化成均匀膏状的美白霜。与现有技术相比，本发明具有以下优点本发明乙酰水杨酸作为酪氨酸酶抑制剂，通过抑制人体中酪氨酸酶活性从而减少黑色素的生成而起到美白的功能，经研究证明，乙酰水杨酸对酪氨酸酶活性具有较强的抑制活性，并且其化学性质稳定，对皮肤无刺激作用，安全可靠，在美白化妆品生产、黄褐斑等色素沉着病方面的治疗，具有很大的市场前景。
图I所示的是乙酰水杨酸对酪氨酸酶的抑制影响图；图2所示的是乙酰水杨酸对酪氨酸酶的抑制作用和酪氨酸酶浓度的关系图；图3所示的是乙酰水杨酸抑制酪氨酸酶的时间过程图；图4所示的是根据图3进行的时间过程半对数曲线分析图；图5所不的是Lineweaver-Burk双倒数图；图6所示的是根据图5求得的斜率Slope对乙酰水杨酸浓度作图；图7所示的是根据图6求得的截距Y-interc印t对乙酰水杨酸浓度作图；图8所示的是不同乙酰水杨酸浓度下ANS结合荧光强度变化图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，但实施例只是为了说明本发明，而不是对本发明的限制。为了更好的理解本发明的实质，下面就乙酰水杨酸抑制酪氨酸酶的测定，及抑制机理来说明其抑制活性。I.酪氨酸酶活性测定方法本发明通过测定酪氨酸酶的邻苯二酚氧化酶活性来计算酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶可催化底物L-DOPA形成多巴醌，而多巴醌在475nm波长处有最大吸收峰。因此通过测定酶催化反应体系的A475随时间的增长直线，该直线的斜率即为酪氨酸酶的活力，即以L-DOPA为底物通过分光光度法在波长475nm处测定多巴醌的产生速度来计算酪氨酸酶活力的大小。具体测定方法为ImL L-DOPA底物体系中加入15 μ L酪氨酸酶溶液，迅速混匀，通过岛津公司UV-1800紫外可见分光光度计检测475nm处每分钟吸光值变化来指示反应速度V值，从而表征酶活性的大小。所有动力学反应和检测的缓冲液均采用310mM磷酸缓冲液。2.乙酰水杨酸对酪氨酸酶抑制作用的测定
本发明采用测定酪氨酸酶活性的方法来计算乙酰水杨酸对酪氨酸酶活性的抑制能力。配制400mM乙酰水杨酸，用缓冲液逐级稀释成不同浓度。将不同浓度的乙酰水杨酸30 μ L与等体积的酪氨酸酶液混合，25°C保温2hr后测定酶活力。测定时酪氨酸酶终浓度为2. 0μ g/mL，底物L-DOPA浓度为2mM，底物中含相应浓度抑制剂乙酰水杨酸。乙酰水杨酸浓度与酪氨酸酶活力的关系如图I所示。由图I可知酪氨酸酶活力被乙酰水杨酸以浓度依赖的方式显著地抑制，酪氨酸酶活力下降一半时乙酰水杨酸的浓度(IC50)为
28.35±1· 42mM0酪氨酸酶抑制剂是通过抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色素生成。在乙酰水杨酸存在下进行酪氨酸酶的活性测定，测得的多巴醌V值在475nm波长处每分钟吸光值的变化即V值显著减小，说明酪氨酸酶被乙酰水杨酸抑制，这种抑制作用可导致黑色素生成的抑制从而起到美白等作用。由图I可知，当乙酰水杨酸浓度高于200mM时酪氨酸酶活性被完全抑制，该浓度可作为酪氨酸酶抑制剂使用时的最低浓度。3.乙酰水杨酸对酪氨酸酶的抑制为可逆的抑制作用为了判断乙酰水杨酸介导的抑制作用是否为可逆反应，我们在反应体系中，加入不同浓度的乙酰水杨酸，当底物L-DOPA浓度不变时，改变酪氨酸酶的加入量，测定酪氨酸酶催化底物氧化的活力随酶量的关系。结果如图2所示v值代表在475nm波长处每分钟吸光值的变化，[E]代表酪氨酸酶的浓度，图2中乙酰水杨酸的浓度分别为0mM( □)，I. 562mM (^),6. 25mM( ▲ ) ,25mM( ·)和 100mM( ■)，体系中 L-DOPA 的终浓度为 2mM。图中直线均经过坐标轴原点，直线的斜率随着加入乙酰水杨酸浓度的增大而下降，证实乙酰水杨酸对酪氨酸酶的抑制作用是一个可逆过程。4.失活动力学和速率常数测定在不同浓度乙酰水杨酸作用下酪氨酸酶的动力学时间过程，以确定失活速率常数。即分别采用5种不同浓度乙酰水杨酸测定对酪氨酸酶的抑制过程时间曲线，结果见图3 :酪氨酸酶分别与不同浓度乙酰水杨酸混合，酶液中乙酰水杨酸的终浓度分别为O. 78125mM (B), 6. 25mM (·), 25mM (A), 100mM(T),和200mM(4),按照图中的时间间隔测定酶活力。测定时酪氨酸酶终浓度为2. O μ g/mL，底物L-DOPA浓度为2mM。图4是根据图3进行的的半对数曲线分析曲线斜率代表速率常数。乙酰水杨酸浓度分别为 O. 78125mM(A) ,6. 25mM(B), 25mM(C)，IOOmM(D)和 200mM(E)。
抑制速率常数从图4的半对数曲线中计算而来。k为单相速率常数。吉布斯自由能变化值的计算式如下Λ Λ G° =-RTlnk0其中R为热力学气体常数，T为绝对温度，k值为抑制反应中主要相的速率常数。不同浓度下的微观失活速率常数计算值见下表。这些速率常数都在同一个数量级上。通过半对数曲线进行的动力学分析计算表明所有的这些失活过程均为一级反应动力学过程。表I乙酰水杨酸作用下酪氨酸酶的失活速率常数
权利要求
1.乙酰水杨酸作为酪氨酸酶抑制剂在制备美白化妆品中的应用。
2.根据权利要求I所述的乙酰水杨酸作为酪氨酸酶抑制剂在制备美白化妆品中的应用，其特征在于所述乙酰水杨酸的添加量占所述化妆品总质量的O. 59Γ3. 6%。
全文摘要
本发明涉及乙酰水杨酸作为酪氨酸酶抑制剂在制备美白化妆品中的应用。所述乙酰水杨酸的添加量占所述化妆品总质量的0.5%~3.6%。酪氨酸酶活力被乙酰水杨酸以浓度依赖的方式显著地抑制，酪氨酸酶活力下降一半时乙酰水杨酸的浓度(IC50)为28.35±1.42mM。
文档编号A61K8/37GK102871851SQ20121032842
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者钱国英, 王志江, 尹尚军, 斯越秀, 朴龙斗 申请人:浙江万里学院