用于治疗和预防癌症的药物组合物的制作方法

专利名称：用于治疗和预防癌症的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗CAPRIN-I抗体或其片段的新药物用途，例如，用于癌症的治疗剂和 /或预防剂。
背景技术：
癌症是导致死亡的主要原因。目前，对癌症进行的治疗主要是外科手术治疗，其可与放射治疗和化疗法联合。尽管近年来开发了新的手术方法和发现了新的抗癌剂，但是除了一些癌症之外，癌症治疗的结果仍未得到大的改善。随着近年来分子生物学和癌症免疫学的发展，已经鉴定了与癌症特异性反应的抗体、细胞毒T细胞所识别的癌抗原、以及编码癌抗原的基因，并且对靶向抗原的特异性免疫疗法的期望已经上升(Tsuyoshi AKIY0SHI, "Gan to Kagaku Ryouhou (癌症和化疗法)”，1997，第 M卷，第 551-519 页(日本)，(Cancer and Chemotherapy Publishers Inc.，El本))。为减轻副作用，在癌症治疗方法中需要被识别为靶抗原的肽、多肽或蛋白质不存在于几乎所有的正常细胞中，但特异性地存在于癌细胞中。在1991年，比利时路德维希研究所Boon等人通过cDNA表达克隆法，使用自身癌细胞系和癌症反应性T细胞，分离了 CD8阳性T细胞识别的人黑素瘤抗原MAGEl (Bruggen P.等人，Science, 254 :1643-1647, 1991)。此后，报道了 SEREX(通过重组表达克隆法对抗原的血清学鉴定)方法，其中可应用基因表达克隆技术鉴定肿瘤抗原，其中所述的肿瘤抗原可被通过应答于癌症患者身体中的自身癌症而产生的抗体所识别(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,92 :11810-11813,1995 ； 和美国专利号5，698，396)。通过SEREX方法，分离了一些基本上不在正常细胞中表达但在癌细胞中特异性表达的癌抗原(Int. J. Cancer, 72 =965-971 (1997) ；Cancer Res. ,58 1034-1041(1998) ；Int.J. Cancer,29 :652-658(1998) ；Int. J. Oncol.，14 :703-708(1999)； Cancer Res. ,56 :4766-4772(1996)；和Hum. Mol· Genet 6 :33_39，1997)。此外，已经进行了一些应用与癌抗原(其为一些分离的癌抗原)特异性反应的免疫细胞、以及使用了包含癌抗原的疫苗等的癌特异性免疫疗法的临床试验。同时，近年来，已开始存在靶向癌细胞上抗原蛋白质的用于癌症治疗的各种抗体药物。此类用作癌特异性治疗剂的药物展示出某些程度的药效，并且因此它们已得到了关注。然而，多数靶抗原蛋白也表达于正常细胞中。施与抗体后，不仅会损伤癌细胞，而且还会损伤已表达了靶抗原的正常细胞，由此会引起副作用(或反作用)，这成为了一个问题。 因此，人们预期，如果能够鉴定在癌细胞表面特异性表达的癌抗原，并且将靶向此类抗原的抗体用作药物，则利用更少副作用的抗体药物的治疗将能实现。胞质和增殖相关蛋白I(CAPRIN-I)是当静止期的正常细胞被活化或发生细胞分裂时表达的胞内蛋白。CAPRIN-I还是已知与细胞中的RNA形成胞内应激颗粒并与调节mRNA 运输和翻译有关的胞内蛋白。CAPRIN-I具有不同的名称，诸如GPI锚定的膜蛋白1和膜组分表面标记1蛋白(MllSl)，似乎这一蛋白被认为是膜蛋白。这些不同的名称源自这样的报告=CAPRIN-I基因序列最初具有GPI结合区并且CAPRIN-I是在大肠癌细胞中表达的膜蛋白(J. Biol. Chem.，270 :20717-20723,1995) 后来报导了该报告中描述的 CAPRIN-1 基因序列是不正确的，即，单个核苷酸从GenBank等中目前登记的CAPRIN-I基因序列中的缺失造成移码，因而导致80个氨基酸从羧基末端缺失，并且因而所得的人为产物(74个氨基酸)是前述报告中所提及的GPI结合区；并且在该序列的的5’侧也存在错误，由此导致53个氨基酸从氨基端缺失(J. Immunol.，172 =2389-2400,2004)。此外，已经报道了由 GenBank等中目前所登记CAPRIN-I基因序列编码的蛋白质不是细胞膜蛋白(J. Immunol.， 172 :2389-2400,2004)。此外，基于J. Biol. Chem.，270 :20717-20723,1995 对 CAPRIN-I 是细胞膜蛋白的报告，US 2008/0075722和WO 2005/100998公开了名为MllSl的CAPRIN-I作为癌症治疗抗体药物的靶可用于癌症治疗，并且将其作为一个细胞膜蛋白；然而，实施例中没有包含应用抗该蛋白的抗体治疗癌症的描述。然而，如J. Immunol.，172 =2389-2400,2004中所报道的那样，从US 2008/0075722申请以来直到现在，一般认为CAPRIN-I不表达在细胞表面，并且因此，显然仅基于不正确信息即CAPRIN-I是细胞膜蛋白的US 2008/0075722和WO 2005/100998的公开内容不应当理解为本领域技术人员的技术常识。发明概述发明所要解决的问题本发明的一个目标是鉴定在癌细胞表面特异性表达的癌抗原蛋白，以及提供靶向此类蛋白的抗体作为癌治疗剂和/或预防剂的用途。解决问题的手段通过深入的研究，通过SEREX方法，应用衍生自睾丸组织的cDNA文库和来自患乳腺癌的狗的血清，本发明人已经获得了编码与存在于荷瘤生物血清中的抗体相结合的蛋白质的cDNA。利用获得的犬基因和与其同源的人、牛、马、小鼠和鸡的基因，现已制备了具有 SEQ ID NO :2-30偶数编号(S卩，偶数编号的SEQ ID NO :2_30)所示氨基酸序列的CAPRIN-I 蛋白，以及抗CAPRIN-I蛋白的抗体。此外，本发明人已发现CAPRIN-I在乳腺癌、脑肿瘤、 白血病、淋巴癌、肺癌、食道癌、大肠癌、胃癌和肾癌细胞中特异性表达，并且CAPRIN-I蛋白的一部分在此类肿瘤细胞表面特异性表达。此外，本发明还发现抗表达于癌细胞表面的 CAPRIN-I部分的抗体能够损伤(损害)表达CAPRIN-I的癌细胞。这些发现使得完成了本发明。因此，本发明具有以下描述的特征。本发明提供了治疗和/或预防癌症的药物组合物，其包含作为活性成分的具有与 CAPRIN-I蛋白、或与包含7个或更多个连续氨基酸的CAPRIN-I蛋白片段的免疫学反应性的抗体或其片段，其中所述的CAPRIN-I蛋白具有偶数编号的SEQ ID NO :2_30任一项所示的氨基酸序列，或与偶数编号的SEQ ID NO :2-30任一项的氨基酸序列具有80%或更多、优选 85 %或更多、更优选90 %或更多、以及更优选95 %或更多序列同一性的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，所述癌症是乳腺癌、脑肿瘤、白血病、淋巴癌、肺癌、 食道癌、大肠癌、胃癌和肾癌。在本发明的另一实施方案中，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在本发明的另一实施方案中，所述抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或双特异性抗体。
在本发明的另一实施方案中，所述抗体是具有与下述多肽、或与该多肽的片段的免疫学反应性的抗体，其中所述的多肽具有SEQ ID N0:37或SEQ ID NO :136所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80 %或更多、优选85 %或更多、更优选90 %或更多、以及更优选95 %或更多序列同一性的氨基酸序列。在本发明的另一实施方案中，在包含作为活性成分的抗体的治疗和/或预防癌症的药物组合物中，上述抗体是下述抗体(a)至(k)任一项、且具有与CAPRIN-I蛋白的免疫学反应性的抗体(a)包含有包含SEQ ID NO :40,41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 44,45和46所示序列的轻链可变区的抗体；(b)包含有包含SEQ ID NO 40,41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO :50、51和52所示序列的轻链可变区的抗体；(c)包含有包含SEQ ID NO 40,41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 55,56和57所示序列的轻链可变区的抗体；(d)包含有包含SEQ ID NO :40,41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 60,61和62所示序列的轻链可变区的抗体；(e)包含有包含SEQ ID NO :40,41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 65,66和67所示序列的轻链可变区的抗体；(f)包含有包含SEQ ID NO :70、71和72所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 74,75和76所示序列的轻链可变区的抗体；(g)包含有包含SEQ ID NO 80,81和82所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 84,85和86所示序列的轻链可变区的抗体；(h)包含有包含SEQ ID NO :90,91和92所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 94,95和96所示序列的轻链可变区的抗体；(i)包含有包含SEQ ID NO 100、101和102所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 104、105和106所示序列的轻链可变区的抗体；(j)包含有包含SEQ ID NO :110、111和112所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 114、115和116所示序列的轻链可变区的抗体；(k)包含有包含SEQ ID NO :120、121和122所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO =124,125和1 所示序列的轻链可变区的抗体。发明效果本发明使用的抗CAPRIN-I抗体损伤(或损坏)癌细胞。因此，此类抗CAPRIN-I 抗体可用于治疗或预防癌症。附图简述

图1显示了编码CAPRIN-I蛋白的基因在正常组织和肿瘤细胞系中的表达模式。 在这一附图中，参考编号1代表每一编码CAPRIN-I蛋白的基因的表达模式，并且参考编号 2代表GAPDH基因的表达模式。图2显示了抗CAPRIN-I抗体(或抗-CAPRIN-I抗体)对表达CAPRIN-I基因的乳腺癌细胞系(T47D)的细胞毒活性。在这一附图中，参考编号3显示了添加抗-CAPRIN-I抗体后的活性，参考编号4显示了添加对照抗体后的活性，以及参考编号5显示了不存在任何抗体时的活性。图3显示了抗CAPRIN-I抗体(或抗-CAPRIN-I抗体)对表达CAPRIN-I基因的乳腺癌细胞系(MDA-MB-157)的细胞毒活性。在这一附图中，参考编号6显示了添加抗-CAPRIN-I 抗体后的活性，参考编号7显示了添加对照抗体后的活性，以及参考编号8显示了不存在任何抗体时的活性。图4显示了对表达CAPRIN-I基因的乳腺癌MDA_MB_157细胞系的细胞毒性，其中该细胞毒性由与癌细胞表面反应的抗CAPRIN-I单克隆抗体(即单克隆抗体#1至#11)所显示。具体地，这一附图显示了添加#1抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号9)、#2抗CAPRIN-I 单克隆抗体(参考编号10)、#3抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号11)、#4抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号12)、#5抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号13)、#6抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号14)、#7抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号15)、#8抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号16)、#9抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号17)、#10抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号18)、以及#11抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号19)后的活性水平，添加与CAPRIN-I蛋白本身反应但不与癌细胞表面反应的单克隆抗体后的活性水平(参考编号 20)，以及添加PBS代替每一抗体后的活性水平(参考编号21)。图fe至5c显示了与癌细胞表面反应的抗CAPRIN-I单克隆抗体(即单克隆抗体 #1至#11)对Balb/c小鼠的抗肿瘤活性，其中向该小鼠移植了表达CAPRIN-I的小鼠癌CD6 细胞系。这些附图显示了施与#1抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号22)、#2抗CAPRIN-I 单克隆抗体(参考编号23)、#3抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号24)、#4抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号25)、#5抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号26)、#6抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号27)、#7抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号28)、#8抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号29)、#9抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号30)、#10抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号31)、以及#11抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号32)后的小鼠肿瘤大小，施与和CAPRIN-I蛋白本身反应但不与癌细胞表面反应的单克隆抗体后的小鼠肿瘤大小(参考编号33)，以及施与PBS代替每一抗体后的小鼠肿瘤大小(参考编号34)。图6a至6c显示了与癌细胞表面反应的抗CAPRIN-I单克隆抗体(即单克隆抗体 #1至#11)对Balb/c小鼠的抗肿瘤活性，其中向该小鼠移植了表达CAPRIN-I的小鼠癌NlE 细胞系。这些附图显示了施与#1抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号35)、#2抗CAPRIN-I 单克隆抗体(参考编号36)、#3抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号37)、#4抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号38)、#5抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号39)、#6抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号40)、#7抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号41)、#8抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号42)、#9抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号43)、#10抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号44)、以及#11抗CAPRIN-I单克隆抗体(参考编号45)后的小鼠肿瘤大小，施与和CAPRIN-I蛋白本身反应但不与癌细胞表面反应的单克隆抗体后的小鼠肿瘤大小(参考编号46)，以及施与PBS代替每一抗体后的小鼠肿瘤大小(参考编号47)。实施本发明的实施方案如下所述，可通过体内检查荷瘤动物的肿瘤生长抑制，或通过体外检查是否展示了对表达下述多肽的肿瘤细胞的免疫细胞介导的或补体介导的细胞毒活性，从而评估本发明中使用的偶数编号的SEQ ID NO :2-30任一项所示多肽的抗体的抗肿瘤活性。
此外，编码由偶数编的SEQ ID NO :2至30(即，SEQ ID NO :2、4、6...沘和30)所示氨基酸序列组成的蛋白的多核苷酸序列分别显示于奇数编号的SEQ ID而1至四(即， SEQ ID NO :1,3,5...27 和 29)。本发明公开的序列表中SEQ ID NO :6、8、10、12和14所示的氨基酸序列是(PRIN-1 蛋白质的氨基酸序列，其是通过SEREX方法，应用衍生自犬睾丸组织的cDNA文库以及来自患乳腺癌的犬的血清，作为能与特异性地存在于来自荷瘤犬的血清中的抗体结合的多肽， 从而分离得到的；SEQ ID NO :2和4中显示的氨基酸序列是作为所述犬多肽的人同源物而分离的CPRIN-I蛋白质氨基酸序列；SEQ ID NO 16显示的氨基酸序列是作为所述犬多肽的牛同源物而分离的CPRIN-I蛋白质氨基酸序列；SEQ IDNO 18显示的氨基酸序列是作为所述犬多肽的马同源物而分离的CPRIN-I蛋白质氨基酸序列；SEQ ID而20至观(偶数编号)显示的氨基酸序列是作为所述犬多肽的鼠科动物同源物而分离的CPRIN-I蛋白质氨基酸序列；以及SEQ ID NO :30显示的氨基酸序列是作为所述犬多肽的鸡同源物而分离的 CPRIN-I蛋白质氨基酸序列(参见以下描述的实施例1)。已知当处于静止期的正常细胞发生活化或细胞分裂时表达CAPRIN-I。已知CAPRIN-I不在细胞表面表达。然而，作为与本发明相关的检查的结果，现已揭示CAPRIN-I的某些部分表达于多种癌细胞表面。根据本发明，优选使用与CAPRIN-I蛋白中在癌细胞表面表达的那部分结合的抗体。CAPRIN-I蛋白中在癌细胞表面表达的部分肽的实例包括由序列表中偶数编号的SEQ ID NO :2至30 (SEQ ID NO :6和18除外)任一项所示氨基酸序列的氨基酸残基No.(或氨基酸(aa) )50-98，或氨基酸残基No. (aa) =233-305 的区域中7个或更多个连续氨基酸组成的多肽。其具体的实例包括SEQ ID NO 37或136 所示氨基酸序列(优选地，SEQ ID NO 136所示氨基酸序列中SEQ ID NO :137或138所示的氨基酸序列区域)，或与所述氨基酸序列具有80 %或更多、优选85 %或更多、更优选90 % 或更多、以及更优选95%或更多序列同一性的氨基酸序列。本发明的抗体包括能与上述肽结合且具有抗肿瘤活性的所有抗体。如上所述的可用于本发明的抗CAPRIN-I抗体可以是任意类型的抗体，只要它们能够展示出抗肿瘤活性。其实例包括单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(scFV)、及其片段，诸如Fab和F(ab' )2。可通过本领域公知的方法制备这些抗体及其片段。在本发明中，能够与CAPRIN-I蛋白质特异结合的抗体是所期望的。此类抗体优选为单克隆抗体，然而，只要能稳定地产生同质抗体，也可使用多克隆抗体。此外，如果受试者是人，则人抗体或人源化抗体是所期望的，以避免或抑制免疫排斥。本文所使用的词语“与CAPRIN-I蛋白特异结合”是指目的抗体与CAPRIN-I蛋白特异性地结合并且基本上不与其他蛋白质结合。如下所述，可通过体内检查荷瘤动物的肿瘤生长抑制，或通过体外检查是否展示了对表达所述多肽的肿瘤细胞的免疫细胞介导的或补体介导的细胞毒活性，从而评估本发明所使用的抗体的抗肿瘤活性。此外，需要本发明的癌症治疗和/或预防的受试者是哺乳动物，诸如人、宠物、家畜或竞技动物。优选的受试者是人。以下将解释本发明相关的抗原的制备、抗体以及药物组合物的制备。
<用于制备抗体的抗原的制备>本发明中使用的用作敏化抗原以获得抗CAPRIN-I抗体的蛋白质或其片段不限于其来源，诸如动物，例如人、犬、牛、马、小鼠、大鼠和鸡。然而，优选根据与用于细胞融合的亲本细胞的相容性选择此类抗体或其片段。通常优选衍生自哺乳动物的蛋白质，尤其优选衍生自人的蛋白质。例如，如果CAPRIN-I是人CAPRIN-I，可使用人CAPRIN-I蛋白，其部分肽， 或能够表达人CAPRIN-I的细胞。 例如可通过登录GenBank (NCBI，USA)和应用BLAST或FASTA算法(Kar 1 in和 Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :5873-5877,1993 ；Altschul 等，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402,1997)获得人CAPRIN-I和其同源物的核苷酸序列和氨基酸序列。根据本发明，当将人CAPRIN-I的核苷酸序列(SEQ ID NO :1或3)或氨基酸序列 (SEQ ID NO :2或4)用作基础序列时，靶标是每一个由与该基础核苷酸序列或氨基酸序列的ORF或成熟部分的核苷酸序列或氨基酸序列具有70 % -100 %、优选80 % -100 %、更优选 90% -100%、以及更优选 95% -100% (例如，97% -100%,98% -100%,99% -100%或 99. 5% -100% )序列同一性的序列组成的核酸或蛋白质。本文所使用的术语“％序列同一性”是指，在引入或不引入缺口以比对两个序列从而达到最大相似度的情况下，同一的氨基酸(或核苷酸)数对氨基酸(或核苷酸)总数的百分比(％ )。CAPRIN-I蛋白的片段长度为由抗体识别的抗原最小单位的表位(或抗原决定簇) 氨基酸长度至小于该蛋白质的全长。所述表位是指在哺乳动物、优选在人中具有抗原性或免疫原性的多肽片段。该多肽片段的最小单位由约7至12个氨基酸组成，例如8至11个氨基酸。其具体的实例是SEQID NO :37、SEQ ID NO :137或SEQ ID NO :138所示氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80 %或更多、优选85 %或更多、更优选90 %或更多、以及更优选95 %或更多序列同一性的氨基酸序列。包含前述人CAPRIN-I蛋白及其部分肽的多肽可根据化学合成方法合成，诸如Fmoc法(芴甲氧羰基法)或tBoc法(叔丁氧羰基法)法(Japanese Biochemical Society (编著)，生物化学实验教程(Seikagaku Jikken Kouza) 1，蛋白质化学IV，化学修饰与肽合成，Kagaku-dojin Publishing Company，he.，日本，1981)。另外，可应用多种市售的肽合成仪根据常规技术来合成所述多肽。此外，可通过应用已知的基因工禾呈方法(Sambrook 等，Molecular Cloning，第 2 片反，Current Protocols in Molecular Biology(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press ;Ausubel 等，Short Protocols in Molecular Biology,第 3 版，A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995)，John Wiley & Sons，等)制备编码上述多肽的多核苷酸，将每一多核苷酸整合至表达载体中并将载体导入宿主细胞，由此允许该宿主细胞产生所述多肽，从而获得目标多肽。通过此类方法，可获得期望的多肽。通过已知的基因工程技术或使用市售核酸合成仪的常规技术，可以容易地制备编码上述多肽的多核苷酸。例如，可以通过PCR，使用人染色体DNA或cDNA文库作为模板和所设计的能够扩增SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的引物对制备包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA。PCR条件可以适当地确定。例如，此类条件可包括进行30次由以下组成的反应步骤(作为每一循环)循环94°C，30秒(变性)；55°C，30秒至1分钟(退火)；以及在72°C，2分钟(延伸)，使用热稳定性DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)和含Mg2+的PCR缓冲液，随后在完成30个循环后在72°C反应7分钟。然而，本发明不限于上述示范性PCR 条件。PCR 技术和条件在例如 Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology，第 3 版，Acompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,1995, John Wiley & Sons (特别是第15章)中得以描述。另外，可以基于本文描述的序列表中SEQ ID NO 1至30所示的核苷酸序列和氨基酸序列的信息制备适当的探针和引物，并且用此类探针合引物筛选人cDNA文库等，从而可分离目的DNA。此类cDNA文库优选地从表达偶数编号的SEQ ID NO :2至30中任一所示蛋白质的细胞、器官或组织制备。细胞或组织的实例包括来自睾丸和癌或肿瘤，诸如白血病、乳腺癌、淋巴瘤、脑肿瘤、肺癌和大肠癌的细胞或组织。上文所述的操作，诸如探针或引物的制备、cDNA文库的构建、cDNA文库的筛选和目的基因的克隆，均是本领域技术人员已知的，并且它们例如可以根据 Sambrook 等人，Molecular Cloning，第 2 版，Current Protocols in Molecular Biology, (1989)，Ausubel等人(同上)中所述的方法实施。编码人CAPRIN-1 蛋白及其部分肽的DNA可从由此获得的DNA中获得。上述宿主细胞可以是任意细胞，只要它们可表达上述多肽。原核宿主细胞的实例包括但不限于大肠杆菌。真核宿主细胞的实例包括但不限于哺乳动物细胞，诸如猴肾细胞(COS 1)、中国仓鼠卵巢细胞(CH0)、人胚肾细胞系(HEK293)和胎小鼠皮肤细胞系 (NIH3T3)；酵母细胞，诸如出芽酵母细胞和分裂酵母细胞；家蚕细胞和爪蟾卵细胞。当使用原核细胞作为宿主细胞时，可使用具有可在原核细胞中复制的起点、启动子、核糖体结合位点、多克隆位点、终止子、耐药基因和营养缺陷型互补基因等的表达载体。 大肠杆菌表达载体的实例可以是pUC载体、pBluescriptll、pET表达系统、pGEX表达系统等。可以将编码上述多肽的DNA整合至这种表达载体，用此种载体转化原核宿主细胞，并且然后培养由此得到的经转化的细胞，因此，可以在原核宿主细胞中表达由该DNA编码的多肽。在这种情况下，该多肽还可作为与另一种蛋白质的融合蛋白表达。当使用真核细胞作为宿主细胞时，使用具有启动子、剪接区和聚腺苷酸添加位点等的真核细胞表达载体。此类表达载体的实例包括pKAl、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、 pBK-CMV、pBK-RSV、EBV载体、pRS、pcDNA3和pYES2。通过与上述方法类似的方法，将编码上述多肽的DNA整合至这种表达载体，用该载体转化真核宿主细胞，并且随后培养由此获得的经转化的细胞，由此，可以在真核宿主细胞中表达由所述DNA编码的多肽。当使用pIND/ V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl等作为表达载体时，可作为与标签的融合蛋白表达上述多肽，所述标签诸如His标签(例如，(His)6至(His)ltl)、FLAG标签、myc标签、HA标签或GFP。为将表达载体引入宿主细胞中，可使用公知的方法，诸如电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、病毒感染、脂质转染法或与细胞膜透过性肽结合。可通过联合使用已知的分离技术从宿主细胞分离和纯化目的多肽。此类已知技术的实例包括但不限于用变性剂如脲或表面活性剂处理法、超声破碎法、酶消化法、盐析、溶剂分级沉淀法、透析法、离心法、超滤法、凝胶过滤法、SDS-PAGE、等电点聚焦电泳、离子交换层析法、疏水层析法、亲和层析法和反相层析法。<抗体结构>一般地，抗体是异多聚糖蛋白，其每一个包含至少两个重链和两个轻链。同时，除IgM之外的抗体均是每一个包含两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链的异四聚体糖蛋白 (约150kDa)。一般地，每一轻链通过单共价二硫键与重链相连。然而，重链之间的二硫键数在不同的免疫球蛋白同种型之间是不同的。每一个重链和轻链还具有链内二硫键。每一重链在其一端具有可变结构域(VH区)，一些恒定区与其顺序地相连。每一轻链在其一端具有可变结构域(VL区)，并且在其相反端具有单恒定区。轻链的恒定区与重链的第一恒定区对齐，并且轻链可变结构域与重链可变结构域对齐。抗体可变结构域的称为“互补决定区 (CDR)，，的特定区域展现出特定的变异性，由此赋予抗体的结合特异性。可变区中相对保守的部分称为“构架区(FR) ”。完整的重链或轻链可变结构域包含4个FR，它们通过3个CDR 彼此相连。此类⑶R以从重链N端开始的顺序分别称为“⑶RHl”、“⑶RH2”和“⑶RH3”。类似地，对于轻链，它们分别被称为“⑶RL1”、“⑶RL2”和“⑶RL3”。⑶RH3对抗体-抗原结合特异性而言起着最重要的作用。此外，每一链中的CDR通过FR区而保持它们彼此接近的状态，并且它们与相应链的CDR —起形成抗体-抗原结合位点。恒定区不直接对抗原-抗体结合起作用。然而，它们表现出不同的效应子作用，诸如与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)、通过结合Fc γ受体的吞噬作用，通过新生儿Fc受体(Fcfoi)的半寿期/清除速率、 以及通过补体级联中的Clq的补体依赖性细胞毒性(⑶C)。<抗体制备>本发明使用的术语“抗-CAPRIN-I抗体”是指具有与全长CAPRIN-I蛋白或其片段的免疫学反应性的抗体。本文所使用的术语“免疫学反应性，，表示抗体在体内结合CAPRIN-I抗原的性质。 损伤肿瘤的功能(例如，死亡、抑制或消退)可通过此类结合的结果而发挥出来。特别地， 任意类型的抗体均可用于本发明，只要该抗体可与CAPRIN-I蛋白结合从而损伤肿瘤或癌， 诸如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、脑肿瘤、肺癌、食道癌、胃癌、肾癌或大肠癌。此类抗体的实例包括单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、多特异性抗体、人抗体、 人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、以及抗体片段(例如，Fab和F(ab' )2)。此外，此类抗体任意的免疫球蛋白类型的实例包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD和IgY，并且任意的免疫球蛋白亚类的实例包括 IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2。除了糖基化之外，抗体还可通过乙酰化、甲酰化、酰胺化、磷酸化或聚乙二醇化 (PEG)而得以修饰。各种抗体的制备实例如下所述。在目标抗体是单克隆抗体的情况下，将表达CAPRIN-I的乳腺癌SK-BR-3细胞系等施与小鼠用于免疫，随后从该小鼠提取脾脏。从每一脾脏分离细胞，然后将其与小鼠骨髓瘤细胞融合。从所得到的融合细胞(杂交瘤)筛选能够产生具有癌细胞生长抑制作用的抗体的克隆。分离和培养产生具有癌细胞生长抑制作用的单克隆抗体的杂交瘤。可通过一般的亲和纯化方法从培养上清液中纯化制备目标抗体。此外，还可例如通过以下描述的方式制备产生单克隆抗体的杂交瘤。首先，通过已知方法用敏化抗原免疫动物。在一般的方法中，通过腹膜内或皮下注射敏化抗原至哺乳动物而实施免疫。具体地，将敏化抗原稀释或悬浮于PBS(磷酸盐缓冲盐水)、生理盐水等中至合适的结果量。如需要的话，在其中混合合适量的常规佐剂(例如，弗氏完全佐剂)。发生乳化后，每4至21天地将产物施与哺乳动物数次。此外，可与敏化抗原一起使用足够的载体用于免疫。如上所述，免疫哺乳动物并确定升高至期望的血清抗体水平之后，从该哺乳动物收集免疫细胞，并进行融合。免疫细胞的特别优选的实例是脾细胞。将哺乳动物骨髓瘤细胞用作相关的亲本细胞，进行与上述免疫细胞的融合。对于此类骨髓瘤细胞，优选使用已知细胞系的以下实例P3U1 (P3-X63Ag8Ul)、 P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Immunol. (1979) 123，1548-1550)、P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81，1-7)、NS-1 (Kohler. G.和 Milstein，C. Eur. J. Immunol. (1976) · 6，511-519)、MPC-Il (Margulies. D. H.等，Cell (1976)8,405-415)、 SP2/0(Shulman，M.等，Nature (1978) 276，269-270)、FO (de St. Groth, S. F.等，J. Immunol. Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I. S. J. Exp. Med. (1978) 148,313-323)和 R210 (Galfre, G.等，Nature (1979) 277，131-133)。基本上可根据已知的方法，诸如Kohler和Milstein等(Kohler，G.和Milstein， C. Methods Enzymo 1. (1981)73,3-46)的方法，进行免疫细胞和上述骨髓瘤细胞的细胞融
口 O更具体地，例如在含有常规营养物的培养溶液中、在细胞融合促进剂的存在下进行上述细胞融合。可使用的融合促进剂的实例包括聚乙二醇(PEG)和仙台病毒(HVJ 日本血凝病毒)。如需要的话，可进一步添加诸如二甲亚砜的佐剂，用于提高融合效率。可任意地确定所使用的免疫细胞和所使用的骨髓瘤细胞之间的比例。例如，免疫细胞对骨髓瘤细胞的比例优选为1 1至10 1。可用于上述细胞融合的培养液的实例包括可满足上述骨髓瘤细胞系生长的RPMI1640培养液和MEM培养液，以及用于这一细胞培养类型的其他常规培养液。此外，可与其联合使用血清替代物，诸如胎牛血清(FCS)。为进行细胞融合，将上述免疫细胞和骨髓瘤细胞以预定量在培养液中充分混合。 将之前加热至约37°C的PEG溶液(例如，平均分子量约1000至6000)以一般地30%至 60% (w/v)的浓度加入其中，随后混合。这使得形成了目标杂交瘤。随后，重复地进行相继地添加合适的培养基和通过离心移除上清液的操作步骤，从而移除不适于杂交瘤生长的细胞融合剂等。在常规的选择培养液诸如HAT培养液(包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液) 中培养如此获得的杂交瘤，用于选择。持续地进行在诸如HAT培养液中的培养，持续足以使目标杂交瘤之外的细胞(非融合细胞)死亡的时间(一般为数天至数周)。接下来，应用常规的有限稀释方法筛选产生目标抗体的杂交瘤，并得到单克隆。此外，还可能用以下方式获得产生具期望活性(例如，细胞生长抑制活性)的人抗体的杂交瘤，以及通过用抗原免疫非人动物获得上述杂交瘤。用蛋白质、表达蛋白的细胞或其溶胞产物在体外敏化人淋巴细胞(例如，用EB病毒感染的人淋巴细胞)，并将敏化的淋巴细胞与能永久分裂的人来源的骨髓瘤细胞(例如似66)(登录号TIB196)融合。可在常规培养液中传代培养如上产生的产单克隆抗体杂交瘤。此外，可将它们保存于液氮中一段时间。特别地，根据常规免疫方法使用期望的抗原或表达期望抗原的细胞作为敏化抗原进行免疫。通过常规细胞融合方法将得到的免疫细胞与公知的亲本细胞融合。然后，通过常规筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞(杂交瘤)。因此，可进行抗体制备。
可用于本发明的抗体的其他实例包括多克隆抗体。例如，可应用如下描述的方法获得多克隆抗体。通过用天然存在的CAPRIN-I蛋白、作为与GST等融合的蛋白在诸如大肠杆菌的微生物中表达的重组CAPRIN-I蛋白、或其部分肽免疫诸如小鼠、产生人抗体的小鼠、或兔的小动物，从而获得血清。通过硫酸铵沉淀、蛋白A/蛋白G柱层析、DEAE离子交换层析、亲和柱层析(使用偶联了 CAPRIN-I蛋白或合成肽的柱子)、或用于制备多克隆抗体的类似技术，纯化血清。在以下描述的实施例中，制备了兔多克隆抗体，并确认了其抗肿瘤效果，该抗体针对在癌细胞表面表达的CAPRIN-I蛋白质氨基酸序列的结构域的部分肽(具有SEQ ID NO 37所示序列)。本文所使用的已知产人抗体小鼠例如是KM小鼠(Kirin Pharma/Medarex)或 XenoMouse (Amgen)(例如 W002/43478 和 W002/092812)。当用 CAPRIN-I 蛋白或其片段免疫此类小鼠时，可从血液中获得完全的人多克隆抗体。此外，可通过将收集自经免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合的方法制备人单克隆抗体。可根据诸如应用动物细胞的方法(日本专利公开，特表2007-530068号)或应用杆状病毒的方法(例如，W098/46777)的方法制备抗原。如果抗原的免疫原性低的话，将抗原与具有免疫原性的大分子(诸如白蛋白)结合。然后，可将该抗原用于免疫。此外，可使用基因重组抗体，所述重组抗体通过从杂交瘤克隆抗体基因，将该克隆整合至适当的载体，将该载体引入宿主，并应用基因重组技术制备。(例如，参见， Carl, Α. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES,由 MACMILLANPUBLISHERS LTD在英国出版，1990)。具体地，应用逆转录酶从杂交瘤mRNA合成抗体的可变区(V区)cDNA。获得编码目标抗体V区的DNA后，将此类DNA与所期望的编码抗体恒定区(C区)的DNA连接。将得到的产物整合至表达载体。备选地，可将编码抗体V 区的DNA整合至包含抗体C区DNA的表达载体中。将此类DNA整合至表达载体中，以使得其在诸如增强子或启动子的表达控制区的控制下表达。之后，用此类表达载体转化宿主细胞，由此使得抗体表达。本发明的抗-CAPRIN-I抗体优选为单克隆抗体。然而，它们可以是多克隆抗体、基因修饰的抗体(诸如嵌合抗体和人源化抗体)等。单克隆抗体包括人单克隆抗体和非人动物单克隆抗体(例如，小鼠单克隆抗体、 大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体和鸡单克隆抗体)。可通过培养杂交瘤获得单克隆抗体，其中通过骨髓瘤细胞和来自用CAPRIN-I蛋白免疫的非人哺乳动物(例如，小鼠或产生人抗体的小鼠)的脾细胞的融合获得所述杂交瘤。在以下描述的实施例中，产生了小鼠单克隆抗体并证实了其抗肿瘤作用。此类单克隆抗体包含具有SEQ ID NO 43,SEQ ID NO 73、SEQ ID NO 83,SEQ ID NO 93、SEQ ID NO 103,SEQ ID NO :113 或 SEQ ID NO :123 所示氨基酸序列的重链可变(VH)区，和具有 SEQ ID NO 47,SEQ ID NO 53、SEQ ID NO 58、SEQ ID NO :63、 SEQ ID NO 68, SEQ ID NO 77, SEQ ID N0:87、SEQ ID NO 97, SEQ ID NO :107、SEQID N0: 117或SEQ ID NO :127所示氨基酸序列的轻链可变(VL)区。此处，该VH区包含由SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :80、SEQID NO :90、SEQ ID NO :100、SEQ ID NO :110 或 SEQ ID NO 120 的氨基酸序列表示的 CDRl ；由 SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO 81、SEQ ID N0:91、SEQ ID N0:101、SEQ ID NO :111 或 SEQ ID NO :121 的氨基酸序列表示的 CDR2 ；以及由 SEQ ID NO :42、SEQ ID NO 72, SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :92、SEQ ID NO 102、SEQ ID NO :112或SEQ ID NO : 122的氨基酸序列表示的CDR3。该VL区包含由SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :74、 SEQ ID NO :84、SEQ ID NO :94、SEQ ID NO :104、SEQID NO :114 或 SEQ ID NO :124 的氨基酸序列表示的 CDRl ；由 SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :51、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :75、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :95、SEQ ID NO :105、SEQID NO :115 或 SEQ ID NO :125 的氨基酸序列表示的 CDR2 ；以及由 SEQID NO 46、SEQ ID NO 52、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :76、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :96、SEQ ID NO :106, SEQ ID NO :116 或 SEQ ID NO 126 的氨基酸序列表示的 CDR3。嵌合抗体是通过组合来自不同动物的序列所产生的抗体。其实例是由小鼠抗体重链和轻链可变区，以及人抗体重链和轻链恒定区组成的抗体。可通过公知的方法制备此类嵌合抗体。例如，可通过连接编码抗体V区的DNA至编码人抗体C区的DNA，将产物整合至表达载体，并将该载体引入用于抗体制备的宿主细胞，从而产生此类嵌合抗体。多克隆抗体包括通过用CAPRIN-I抗体免疫产生人抗体的动物(例如小鼠)而获得的抗体。人源化抗体是经修饰的抗体，其有时也称为“重构人抗体”。公知通过将来自免疫动物的抗体的CDR移植至人抗体互补决定区从而构建人源化抗体。这种一般的基因重组技术也是公知的。具体地，通过PCR方法合成被设计以允许小鼠抗体⑶R与人抗体构架区(FR)连接的DNA序列，其中所述的PCR使用了若干个如下方式制备的寡核苷酸，即该寡核苷酸具有在其一端与彼此重叠的部分。可通过将上面得到的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接、将产物整合至表达载体、并将该载体引入用于产生抗体的宿主细胞中，从而获得人源化抗体 (参见EP-A-239400和W096/02576)。以下述假设选择通过CDR彼此相连的人抗体FR，即互补决定区能够形成良好的抗原结合位点。如果需要的话，也可以以下述方式替换抗体可变区的构架区中的氨基酸，即，使得重构人抗体中的互补决定区形成合适的抗原结合位点 (Sato K.等，Cancer Researchl993，53 :851-856)。此外，还可用来自不同人抗体的构架区替换该构架区(参见W099/51743)。以下述假设选择通过CDR彼此相连的人抗体构架区，即互补决定区能够形成良好的抗原结合位点。如果需要的话，也可以以下述方式替换抗体可变区的构架区中的氨基酸，即，使得重构人抗体中的互补决定区形成合适的抗原结合位点(Sato K.等，Cancer Research 1993,53:851-856)。产生了嵌合抗体或人源化抗体后，可替换可变区(例如，FR)或恒定区中的氨基酸，例如，用不同的氨基酸替换。本文中，所述的氨基酸替换是，例如，少于15、少于10、不超过8、不超过7、不超过 6、不超过5、不超过4、不超过3或不超过2个氨基酸，优选1至5个氨基酸，以及更优选1或 2个氨基酸的替换。经替换的抗体应当在功能上与未替换的抗体等价。替换优选是保守氨基酸替换，即在电荷、侧链、极性、芳香性等方面具有类似性质的氨基酸之间的替换。例如， 可将性质相似的氨基酸归类为以下类型碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)；酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)；不带电极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸)；非极性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸)；支链氨基酸(苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)；以及芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸)。抗体修饰物的一个实例是与诸如聚乙二醇(PEG)的分子连接的抗体。就本发明的抗体修饰物而言，与抗体结合的物质不受限制。可通过化学修饰所获得的抗体而得到此类抗体修饰物。在本发明相关的领域中已建立起此类修饰的方法。本文所使用的表达“功能上等价的”表示这样的情况，即其中目标抗体具有与本发明抗体类似的生物学或生物化学活性。特别地，此类抗体具有损坏肿瘤的功能，并且当施与人类时基本上不会引起排斥反应。此类活性的实例是细胞生长抑制活性或结合活性。本领域技术人员公知的用于制备与给定的多肽功能上等价的多肽的公知方法是包括将突变引入多肽的方法。例如，本领域技术人员可通过定点诱变方法 (Hashimoto-Gotoh, Τ.等，(1995)Gene 152,271-275 ；Zoller, MJ.，和 Smith, Μ. (1983) Methods Enzymo1. 100,468-500 ；Kramer,W.等，(1984)Nucleic Acids Res. 12,9441-9456 ； Kramer, W.禾口 Fritz, HJ.，(1987)Methods Enzymo1. 154,350-367 ；Kunke1, ΤΑ.，(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82，488-492 ；或Kunkel (1988)Methods Enzymo 1. 85，2763-2766) 或类似方法将突变适当地引入本发明的抗体。由此可制得与本发明的抗体功能上等价的抗体。前述能够识别由抗-CAPRIN-I抗体识别的CAI3RIN-I蛋白表位的抗体可通过本领域技术人员公知的方法获得。例如，其可通过以下方法获得包括通过一般的方法(例如， 表位作图)确定由抗-CAPRIN-I抗体识别的CAPRIN-I蛋白表位，并应用具有该表位所含氨基酸序列的多肽作为免疫原产生抗体的方法；或包括确定通过一般的方法产生的抗体的表位，以及筛选具有与抗-CAPRIN-I抗体同一的表位的抗体的方法。本文中，“表位”是指在哺乳动物尤其是人中具有抗原性或免疫原性的多肽片段。其最小的单位由约7至12个氨基酸组成，优选由8至11个氨基酸组成。本发明抗体的亲和常数Ka(k。n/k。ff)优选为至少107ΜΓ\至少ΙΟ 1、至少 5 X IO8IT1、至少 IO9IT1、至少 5 X IO9IT1、至少 IOiciIT1、至少 5 X IOiciIT1、至少 IO11ITi、至少 5 X IO11M-1、至少 IO12IT1、或至少 1013ΜΛ本发明的抗体可与抗肿瘤剂缀合。可通过间隔子实现抗体和抗肿瘤剂之间的结合，其中所述的间隔子具有与氨基、羧茎、羟基、硫醇基等反应的基团(例如，亚胺基琥珀酸酯基团、甲酰基、2-吡啶基二硫基、马来酰亚胺基、烷氧羰基或羟基)。抗肿瘤剂的实例包括以下在参考文献中公知的抗肿瘤剂等紫杉醇、阿霉素、柔红霉素、环磷酰胺、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、硫替派、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、benzodopa, 卡波醌、美妥替哌、uredopa、六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide)、三轻甲蜜胺(trimethyIoIomelamine)、布拉他辛(bullatacin)、布拉它辛酮(bullatacinone)、喜树碱、苔藓抑素、callystatin、 cryptophycin 1、cryptophycin 8、多拉司他汀、duocarmycin、eleutherobin、/K鬼蕉喊 (pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海绵抑制素(spongistatin)、苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氢氯化氧氮芥、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、胆留醇对苯乙酸氮芥、松龙苯芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥、亚硝脲氮芥、吡葡亚硝脲、福替目丁、环己亚硝脲、嘧啶亚硝脲、雷诺氮芥、calicheamicirudynemicin、氯膦酸盐、esperamicin、阿克拉霉素、放线菌素、authramycin、重氮乙酰丝氨酸、争光霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素、detorbicin、6_重氮基_5_氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、去甲氧正定霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素C、 霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、 链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星、二甲叶酸、蝶罗呤、曲美沙特、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、2-氨基嘌呤-6-硫醇、环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、5-氟脱氧尿苷、雄激素诸如二甲睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯、氨基苯乙哌啶酮、米托坦、曲洛司坦、 frolinic acid、醋葡内酯、醛磷酰胺苷、氨基硐戊酸、恩尿嘧啶、安吖啶、bestrabucil、比山群、依达曲沙、defofamine、脱羰秋水仙碱、亚胺醌氨酯、elfornithine、依利醋铵、环氧聚微管素、乙环氧啶、蘑菇多糖、氯尼达明、美登素、安丝菌素(ansamitocine)、丙脒腙、米托蒽醌、mopidanmol, nitraerine、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基酰胼、甲基苄胼、丙亚胺、根霉素、裂裥菌素、锗螺胺、细格孢氮杂酸、三亚胺醌、杆孢菌素A、蛇形菌素(anguidine)、氨基甲酸乙酯、去乙酰长春酰胺、氮烯唑胺、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、 二溴卫矛醇、哌泊溴烷、加环利定、紫杉萜、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6-硫代鸟嘌呤、巯基嘌呤、顺氯氨钼、奥克赛钼、卡波钼、长春花碱、依托泊苷、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、诺消灵、替尼泊苷、依达曲沙、道诺霉素、氨基蝶呤、希罗达、伊班膦酸盐、依立替康、 拓扑异构酶抑制剂、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、视黄酸、卡培他滨，及其可药用盐或衍生物。备选地，还可将放射性同位素与本发明的抗体相连接，所述的放射性同位素诸如在参考文献中已知的 211At、131I、125I、9V、186Re、U53Sm、212Bi、32P、175LU 或 176Lu 等。期望此类放射性同位素对肿瘤治疗或诊断有效。本发明的抗体是具有与CAPRIN-I的免疫反应性的抗体，或能够特异性地识别 CAPRIN-I的抗体。此类抗体应当是具有这样的结构的抗体，即允许施与所述抗体的受试动物完全或几乎完全避免排斥反应。如果该受试动物是人，上述抗体的实例包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体(例如，人-小鼠嵌合抗体)、单链抗体以及双特异性抗体。这样的抗体是具有人抗体来源重链和轻链可变区的重组抗体、具有由非人动物抗体来源互补决定区 (⑶R1、⑶R2和⑶R3)和人抗体来源构架区组成的重链和轻链可变区(每一个均如此)的重组抗体、或具有非人动物抗体来源重链和轻链可变区以及人抗体来源重链和轻链恒定区的重组抗体。前两种抗体是优选的。可通过如下描述的方法产生上述重组抗体。从诸如杂交瘤的产抗体细胞中克隆编码抗人CAPRIN-I单克隆抗体(例如，人单克隆抗体、小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、或鸡单克隆抗体)的DNA。应用得到的克隆作为模板通过RT-PCR方法等产生编码该抗体的轻链可变区和重链可变区的DNA。然后，通过Kabat EU编码系统(Kabat等， Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版·Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991))确定轻链可变区和重链可变区的序列，或CDRl、CDR2以及CDR3的序列。进一步地，通过基因重组技术(Sambrook等，Molecular Cloning ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))或 DNA 合成仪产生编码可变区的DNA或编码⑶R的DNA。在这里，上述产生人单克隆抗体的杂交瘤可通过用人CAPRIN-I免疫产生人抗体的动物(例如，小鼠)，并使来自该动物的脾的脾细胞与骨髓瘤细胞融合而产生。除上述之外，需要的话，通过基因重组技术或DNA合成仪产生编码人抗体来源轻链或重链可变区及恒定区的DNA。在人源化抗体的情况下，产生了这样的DNA，即其中编码人抗体来源轻链或重链可变区的DNA中的CDR编码序列已由非人动物(例如，小鼠、大鼠或鸡)来源的抗体中相应的 CDR编码序列替换。将如上述那样获得的DNA与编码人抗体来源轻链或重链恒定区的DNA 连接。由此，可产生编码人源化抗体的DNA。在嵌合抗体的情况下，将编码非人动物(例如，小鼠、大鼠或鸡)来源抗体重链或轻链可变区的DNA与编码人抗体来源的轻链或重链恒定区的DNA连接。由此，可产生编码嵌合抗体的DNA。单链抗体是其中重链可变区和轻链可变区通过接头彼此线性连接的抗体。可通过结合编码重链可变区的DNA、编码接头的DNA和编码轻链可变区的DNA从而产生编码单链抗体的DNA。在这里，重链可变区和轻链可变区是来自人抗体的那些，或来自于人抗体的、 其中仅有CDR已由非人动物(例如，小鼠、大鼠或鸡)来源的抗体CDR替换的那些。此外， 该接头由12至19个氨基酸组成。它的实例是由15个氨基酸组成的(G4S) 3 (G.B.Kim等， Protein Engineering Design and Selection 2007,20(9) :425-432)。双特性抗体(diabody)是能特异性地结合两种不同表位的抗体，其中，例如，编码重链可变区A的DNA、编码轻链可变区B的DNA、编码重链可变区B的DNA、以及编码轻链可变区A的DNA以这样的顺序彼此相连(条件是编码轻链可变区B的DNA和编码重链可变区 B的DNA通过编码上述接头的DNA彼此连接)。由此可产生编码双特异性抗体的DNA。在这里，重链可变区和轻链可变区两者均是来自人抗体的那些，或来自于人抗体、其中仅有CDR 已由非人动物(例如，小鼠、大鼠或鸡)来源的抗体CDR替换的那些。将如上产生的重组DNA整合至一个或多个合适的载体中。将每一此种载体引入宿主细胞(例如，哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞)用于(共)表达。由此可产生重组抗体(P. J. Delves.，ANTIBODY PRODUCTIONESSENTIAL TECHNIQUES.，1997WILEY, P. Shepherd 禾口 C.Dean. ，Monoclonal Antibodies. ,20000XF0RD UNIVERSITY PRESS ;J.W.Goding, Monoclonal Antibodies =Principles and Practice. ，1993ACADEMIC PRE SS)。通过上述方法产生的本发明抗体的实例包括以下抗体(a)至(k)。(a)包含有包含SEQ ID NO :40、41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 44,45和46所示序列的轻链可变区的抗体(以及优选为包含SEQ ID NO 43的重链可变区和SEQ ID NO 47的轻链可变区的抗体)。(b)包含有包含SEQ ID NO :40、41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 50,51和52所示序列的轻链可变区的抗体(以及优选为包含SEQ ID NO 43的重链可变区和SEQ ID NO 53的轻链可变区的抗体)。(c)包含有包含SEQ ID NO :40、41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 55,56和57所示序列的轻链可变区的抗体(以及优选为包含SEQ ID NO 43的重链可变区和SEQ ID NO 58的轻链可变区的抗体)。(d)包含有包含SEQ ID NO :40、41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ IDNO =60,61和62所示序列的轻链可变区的抗体(以及优选为包含SEQ ID NO 43的重链可变区和SEQ ID NO 63的轻链可变区的抗体)。(e)包含有包含SEQ ID NO :40、41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 65,66和67所示序列的轻链可变区的抗体(以及优选为包含SEQ ID NO 43的重链可变区和SEQ ID NO 68的轻链可变区的抗体)。(f)包含有包含SEQ ID NO :70、71和72所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 74,75和76所示序列的轻链可变区的抗体(以及优选为包含SEQ ID NO 73的重链可变区和SEQ ID NO 77的轻链可变区的抗体)。(g)包含有包含SEQ ID NO :80、81和82所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 84,85和86所示序列的轻链可变区的抗体(以及优选为包含SEQ ID NO 83的重链可变区和SEQ ID NO 87的轻链可变区的抗体)。(h)包含有包含SEQ ID NO 90,91和92所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 94,95和96所示序列的轻链可变区的抗体(以及优选为包含SEQ ID NO 93的重链可变区和SEQ ID NO 97的轻链可变区的抗体)。(i)包含有包含SEQ ID NO :100、101和102所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 104、105和106所示序列的轻链可变区的抗体(以及优选为包含SEQ ID NO :103的重链可变区和SEQ ID NO 107的轻链可变区的抗体)。(j)包含有包含SEQ ID NO :110、111和112所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 114、115和116所示序列的轻链可变区的抗体(以及优选为包含SEQ ID NO :113的重链可变区和SEQ ID NO 117的轻链可变区的抗体)。(k)包含有包含SEQ ID NO :120、121和122所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO =124,125和126所示序列的轻链可变区的抗体(以及优选为包含SEQ ID NO :123的重链可变区和SEQ ID NO 127的轻链可变区的抗体)。在这里，SEQ ID NO :40、41禾口 42所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :70、71禾口 72所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :80、81禾口 82所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :90、91禾口 92所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :100,101 ^P 102所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :110、111和112所示的氨基酸序列、或SEQ ID N0:120、121和122所示的氨基酸序列分别相应于小鼠抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。此外，SEQ ID NO :44、45和46所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :50、51和52所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :55、56和57所示的氨基酸序列、SEQ ID NO: 60、61和62所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :65、66和67所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :74、 75和76所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :84、85和86所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :94、95 和96所示的氨基酸序列、SEQ ID NO 104、105和106所示的氨基酸序列、SEQ ID NO :114、 115和116所示的氨基酸序列、或SEQ ID NO =124,125和126所示的氨基酸序列分别相应于小鼠抗体轻链可变区的⑶R1、⑶R2和⑶R3。此外，本发明的人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或双特异性抗体例如是以下抗体 ⑴或(ii)(以下描述了抗体(a)的实例)。(i)包含以下的抗体包含SEQ ID NO :40,41和42的氨基酸序列和人抗体来源构架区氨基酸序列的重链可变区；以及包含SEQ ID NO :44、45和46的氨基酸序列和人抗体来源构架区氨基酸序列的轻链可变区(以及优选是在重链可变区中包含SEQ ID N0:43的氨基酸序列、并且在轻链可变区中包含SEQ ID N0:47的氨基酸序列的抗体)。(ii)包含以下的抗体包含SEQ ID NO :40,41和42的氨基酸序列和人抗体来源构架区氨基酸序列的重链可变区；包含人抗体来源氨基酸序列的重链恒定区；包含SEQ ID NO :44,45和46的氨基酸序列和人抗体来源构架区氨基酸序列的轻链可变区；以及包含人抗体来源氨基酸序列的轻链恒定区(以及优选是包含如下的抗体包含SEQ ID N0:43的氨基酸序列的重链可变区；包含人抗体来源氨基酸序列的重链恒定区；包含SEQ IDNO 47的氨基酸序列的轻链可变区；以及包含人抗体来源氨基酸序列的轻链恒定区)。此外，例如可从NCBI (U. S. A =GenBank, UniGene,等)中获得人抗体重链和轻链恒定区和可变区的序列。例如，以下序列可用作相应区域的参考序列用于人IgGl重链恒定区的具有登录号J002^的序列；用于人IgG2重链恒定区的具有登录号J00230的序列；用于人IgG3重链恒定区的具有登录号X03604的序列；用于人IgG4重链恒定区的具有登录号 K01316的序列；用于人轻链κ恒定区的具有登录号V00557、X64135或)(64133的序列；以及用于人轻链λ恒定区的具有登录号)(64132或)(64134的序列。上述抗体优选具有细胞毒活性，由此展现出抗肿瘤活性。此外，上述抗体重链和轻链可变区以及⑶R的特定序列仅仅是例证性地描述。本发明显而易见地不限于特定的序列。产生了能够产生不同的抗人CAPRIN-I的人抗体或非人动物抗体(例如，小鼠抗体)的杂交瘤。收集产自该杂交瘤的单克隆抗体。然后，应用就人CAPRIN-I而言的免疫结合活性及细胞毒活性作为指示，确定获得的抗体是否为目的抗体。由此鉴定产生单克隆抗体的目的杂交瘤。此后，如上述那样，从该杂交瘤产生编码目的抗体重链和轻链可变区的DNA，用于序列确定。将该DNA用于产生不同的抗体。此外，本发明的上述抗体可以是具有一个或多个(优选1或幻氨基酸替换、缺失或添加(尤其是在构架区序列和/或恒定区序列中)的上述抗体(i)至(iv)的任一个，只要其具有特异性识别CAPRIN-I的特定性质。在这里，术语“几个氨基酸”表示2至5个，优选2或3个氨基酸。此外，根据本发明，还提供了编码本发明的上述抗体的DNA、编码该抗体重链或轻链的DNA、或编码该抗体的重链或轻链可变区的DNA。例如，在抗体(a)的情况下，此类DNA 的实例包括包含编码SEQ ID NO :40、41和42的氨基酸序列的核苷酸序列的重链可变区编码DNA ；以及包含编码SEQ ID NO :44,45和46的氨基酸序列的核苷酸序列的轻链可变区编码 DNA。由上述序列的DNA编码的互补决定区(CDR)是确定抗体特异性的区域。因此，编码抗体中其他区域(即，恒定区和构架区)的序列可以是来自不同抗体的序列。在这里，不同的抗体包括来自非人生物的抗体。然而，考虑到减少副作用，优选为人来源的抗体。也就是说，在上述情况下，编码重链和轻链构架区及恒定区的DNA序列优选包含编码来自人抗体的相关氨基酸序列的核苷酸序列。此外，编码本发明抗体(诸如抗体(a))的DNA的不同实例包括包含编码SEQ ID NO 43的氨基酸序列的核苷酸序列的编码重链可变区的DNA，以及其中编码轻链可变区的区域包含编码SEQ ID NO :47的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA。在这里，编码SEQ ID NO 43的氨基酸序列的核苷酸序列实例是SEQ ID NO :48的核苷酸序列。此外，编码SEQ ID NO 47的氨基酸序列的核苷酸序列实例是SEQ ID NO :49的核苷酸序列。此外，上述编码重链和轻链恒定区的DNA优选包含编码相应的人抗体来源氨基酸序列的核苷酸序列。本发明的DNA可例如通过前述方法或以下方法获得。首先，应用可商购的RNA提取试剂盒从本发明抗体的杂交瘤中制备总RNA。然后，应用随机引物等通过逆转录酶合成 cDNA。接下来，应用具有已知小鼠抗体重链和轻链基因可变区中保守序列的寡核苷酸作为引物，通过PCR方法扩增编码抗体的cDNA。可通过PCR方法扩增已知序列获得编码恒定区的序列。可通过一般的方法确定该DNA的核苷酸序列，其中所述的方法例如包括整合至用于序列确定的质粒或噬菌体。我们认为本发明使用的抗-CAPRIN-I抗体对表达CAPRIN-I的癌细胞的抗肿瘤活性是通过如下描述的细胞毒性机制而得以显示的。该细胞毒性是针对表达CAPRIN-I细胞的、效应细胞介导的抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)，以及针对表达CAPRIN-I细胞的、补体依赖性细胞毒性(⑶C)。因此，可通过先体外后体内(ex vivo)确定针对表达CAPRIN-I的癌细胞的ADCC 活性或CDC活性评估本发明使用的抗-CAPRIN-I抗体的活性，如在以下实施例中具体描述的那样。本发明使用的抗-CAPRIN-I抗体与癌细胞上的CAPRIN-I蛋白结合，并且基于上述活性展示出抗肿瘤效果。因此，相信此类抗体可用于癌症治疗或预防。特别地，根据本发明， 提供了包含抗-CAPRIN-I抗体作为活性组成的用于治疗和/或预防癌症的药物组合物。当将抗-CAPRIN-I抗体用于施与抗体给人类的目的(抗体治疗)时，优选以人抗体或人源化抗体的形式使用，以降低免疫原性。此外，抗-CAPRIN-I抗体与癌细胞表面的CAPRIN-I蛋白之间的结合亲和力变得越高，则抗-CAPRIN-I抗体可展示出越强的抗肿瘤活性。因此，如能获得具有与CAPRIN-I蛋白的高结合亲和力的抗-CAPRIN-I抗体，可以预期能展示出更强的抗肿瘤活性。因此，应用此类抗体作为肿瘤治疗和/或预防的药物组合物就变得可能。如上所述，对于高结合亲和力，亲和常数Ka(k。n/k。ff)优选为至少愈1、至少愈1、至少5X KAf1、至少愈1、至少 5 X IO9IT1、至少 IOkT1、至少 5 X IO10M-1、至少 IO11ITi、至少 5 X IO11ITi、至少 IO12IT1、或至少 IO13M-1O<与表达抗原的细胞结合>可通过应用例如实施例中描述的ELISA、蛋白印迹方法、免疫荧光或流式细胞分析的结合测试法确定抗体与CAPRIN-I结合的能力。<免疫组织化学染色>可应用用多聚甲醛或丙酮固定的冰冻组织切片或用多聚甲醛固定的石蜡包埋组织切片，通过本领域技术人员公知的免疫组织化学方法，根据与CAPRIN-I的反应性测试识别CAPRIN-I的抗体。此类切片在手术期间从患者获得、或从携带有异种移植组织的动物中获得的组织制备，其中所述的动物接种有表达CAPRIN-I的天然细胞或转化细胞系。为了进行免疫组织化学染色，可通过各种方法染色与CAPRIN-I反应的抗体。例如，可通过与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠抗体或山羊抗兔抗体反应而显现该抗体。〈药物组合物〉本发明治疗和/或预防癌症的药物组合物的靶没有特别的限制，只要该靶是表达 CAPRIN-I基因的癌(细胞)即可。
本文使用的术语“肿瘤”和“癌”两者均指恶性赘生物，并且因此它们可互换使用。在本发明中可作为靶的癌是表达编码包含偶数编号的SEQ ID NO 2至30的任一项的氨基酸序列、或由所述氨基酸序列的7个或更多个连续氨基酸组成的部分序列的多肽的基因。其优选实例包括乳腺癌、脑肿瘤、白血病、肺癌、淋巴瘤、肥大细胞瘤、食道癌和大肠癌。这些特定肿瘤的实施例包括，但不限于，乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合肿瘤、乳管内乳头状腺癌、肺腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞癌、神经胶质瘤(即，神经上皮组织肿瘤)、室管膜瘤、神经细胞性肿瘤、胚胎性神经外胚层瘤、神经鞘瘤、纤维神经瘤、脑膜瘤、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、胃肠道淋巴瘤、消化性淋巴瘤、小细胞至中细胞淋巴瘤、盲肠癌、上行结肠癌、下行结肠癌、横结肠癌、乙状结肠癌以及直肠癌。此外，本发明的受试动物是哺乳动物。其实例包括诸如灵长类、宠物动物、家畜以及竞技动物的哺乳动物。特别优选的是人、狗和猫。当本发明中使用的抗体作为药物组合物使用时，可通过本领域技术人员公知的方法对其进行配制。例如，其可作为肠胃外注射液的形式肠胃外使用包含水或可药用非水溶液的无菌溶液；或悬浮液。例如，在一种可能情况中，可以通过适当的方法联合使用可药用载体或介质，具体为无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬混剂、表面活性剂、稳定剂、矫味剂、赋形剂、载体(vehicle)、防腐剂、结合剂，通过以通常可接受的药物组合物所需的单位剂型混合从而进行配制。确定制剂中的活性组分量以使得可达到在指示范围内的合适剂
Mo用于注射的无菌组合物可应用诸如注射用蒸馏水的载体根据一般的配制方法配制。注射用水溶液的实例包括生理盐水以及包含葡萄糖和其它佐剂的等渗溶液，其中所述的其它佐剂诸如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠。此类溶液可与合适的溶解助剂一起使用。此类溶解助剂的实例包括醇，诸如乙醇和多元醇、丙二醇、聚乙二醇，以及非离子表面活性剂，诸如聚山梨酸酯80( )和HC0-60。油性流体的实例包括芝麻油和大豆油。此类油性流体可与诸如苯甲酸苄酯或苯甲醇的溶解助剂联合使用。此外，其还可与缓冲剂(诸如磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液)、 无痛剂(诸如盐酸普鲁卡因)、稳定剂(诸如苯甲醇、苯酚)或抗氧化剂混合。一般地，将配制的注射溶液引入适当的安瓿中。上述药物组合物经口或肠胃外施与。优选为肠胃外施与。剂型的特定实例包括可注射剂、经鼻施与剂、经肺施与剂、以及经皮施与剂。例如，可注射剂可通过静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射或皮下注射全身性或局部施与。此外，可根据患者年龄、体重、性别和症状适当地确定施与方法。可在例如 0. OOOlmg至1000mg/kg体重的范围内选择包含抗体或编码抗体的多核苷酸的药物组合物的单剂量。备选地，可在例如每位患者0. 001至IOOOOOmg的范围内选择剂量，然而，其不必限于此。剂量和施与方法依据患者年龄、体重、性别和症状而改变。然而，本领域技术人员能够适当地选择剂量和方法。〈多肽和DNA>根据本发明，还提供了上述抗体(a)至(k)的以下多肽和DNA。
(i)包含 SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :73、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :93、SEQ ID NO :103, SEQ ID NO :113和SEQ ID NO :123的氨基酸序列的多肽，以及编码该多肽的DNA。(ii)包含 SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :63、SEQ ID NO 68, SEQ ID NO 77、SEQ ID N0:87、SEQ ID NO :97、SEQ ID N0:107、SEQ ID NO :117 和 SEQ ID NO 127的氨基酸序列的多肽，以及编码该多肽的DNA。(iii)包含 SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :88、SEQ IDNO :98、SEQ ID NO :108, SEQ ID NO :118 和 SEQ ID NO 128 的核苷酸序列的 DNA。(iv)包含 SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :59、SEQ IDNO :64、SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 79、SEQ ID N0:89、SEQ ID NO :99、SEQ ID N0:109、SEQ ID NO :119 和 SEQ ID NO 129的核苷酸序列的DNA。(ν)包含选自 SEQ ID NO :40,41 和 42 的氨基酸序列；SEQ ID NO :70、71 和 72 的氨基酸序列；SEQ ID NO 80,81和82的氨基酸序列；SEQ IDNO :90、91和92的氨基酸序列； SEQ ID NO 100、101和102的氨基酸序列；SEQ ID NO 110、111和112的氨基酸序列；以及 SEQ ID NO 120、121和122的氨基酸序列的重链⑶R多肽，以及编码该多肽的DNA。(vi)包含选自 SEQ ID NO 44,45 和 46 的氨基酸序列；SEQ ID NO :50、51 和 52 的氨基酸序列；SEQ ID NO 55,56和57的氨基酸序列；SEQ IDNO :60、61和62的氨基酸序列； SEQ ID NO :65、66和67的氨基酸序列；SEQ ID NO :74、75和76的氨基酸序列；SEQ ID NO 84,85和86的氨基酸序歹Ij ；SEQ ID NO :94、95和96的氨基酸序列；SEQ ID NO 104、105和 106的氨基酸序列；SEQ ID NO :114、115和116的氨基酸序列；SEQ ID N0:124、125和126 的氨基酸序列的轻链CDR多肽；以及编码该多肽的DNA。这些多肽和DNA可通过上述基因重组技术产生。
实施例下文参考以下实施例来更详细地描述本发明，不过本发明的范围不限于此。实施例1 通过SEREX方法鉴定新的癌抗原蛋白(l)cDNA文库的构建通过酸胍-酚-氯仿方法从健康犬的睾丸组织提取总RNA,并且使用 01igotex-dT30mRNA纯化试剂盒(Takara Shuzo Co. , Ltd.)，根据其中包括的说明书纯化 poIyA RNA。使用如此获得的mRNA(5 μ g)合成犬睾丸cDNA噬菌体文库。使用cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA合成试剂盒和 ZAP-cDNA GigapackIIIGold Cloning试剂盒(STRATAGENE), U 据各试剂盒中所包含的备份说明书构建cDNA噬菌体文库。由此构建的cDNA噬菌体文库的大小是 7. 73X 105pfu/ml。(2)使用血清筛选cDNA文库使用上述构建的犬睾丸cDNA噬菌体文库实施免疫筛选。具体地，在NZY琼脂糖平板(Φ90χ 15mm)上用噬菌体感染宿主大肠杆菌(XLl_BlueMRF’ )，由此获得2210个克隆。 在42°C培养大肠杆菌细胞3至4小时以形成噬斑。平板以IPTG(异丙基-β -D-硫代半乳糖苷)浸透的硝化纤维素膜(Hybond C Extra =GE Healthcare Bio-Science)在 37°C覆盖 4小时，从而诱导并表达蛋白质，然后将蛋白质转移到该膜上。随后，将该膜回收，浸泡在含有0.5%粉末脱脂乳的TBS (IOmM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7. 5)中并在4°C振摇过夜以抑制非特异性反应。使该滤膜与500倍稀释的患病犬血清在室温反应2至3小时。就上述患病犬的血清而言，使用从患有乳腺癌的犬中收集的血清。这些血清贮藏在-80°C并在即将使用前预处理。预处理血清样品的方法如下。具体而言，宿主大肠杆菌 (XLl-BLue MRF’)用其中未插入外来基因的λ ZAP表达噬菌体感染，并且随后在NZY平板培养基上于37°C培养过夜。随后，添加含有0. 5M NaCl的缓冲液(0. 2M NaHCO3, pH 8. 3)至该平板，使该平板在4°C静置15小时，然后收集上清液作为大肠杆菌/噬菌体提取物。随后，使由此收集的大肠杆菌/噬菌体提取物流经NHS-柱(GEHealthcare Bio-Science)，因而将衍生自大肠杆菌/噬菌体的蛋白质固定在该柱上。使患病犬的血清流经固定有蛋白质的柱以与其反应，并且从血清中除去已经吸附至大肠杆菌和噬菌体的抗体。将已经流过该柱的血清级分用含有0. 5%粉末脱脂乳的TBS稀释500倍。将所得物用作免疫筛选材料。膜上已经印迹了经处理的血清和上述融合蛋白的膜用TBS-T (0. 05 %吐温20/ TBS)洗涤4次，然后使已经用含有0. 5%粉末脱脂乳的TBS稀释5000倍作为第二抗体的山羊抗犬IgG(山羊抗犬IgG-h+I HRP缀合的(BETHYL Laboratories))与该膜在室温反应 1小时。检测通过使用NBT/BCIP反应溶液(Roche)的酶显色反应实施。从NZY琼脂糖平板(Φ90χ15πιπι)收集与显色反应阳性的位点相对应的菌落，并将其裂解于500 μ ISM缓冲液 (IOOmM NaCl，IOmM MgClSO4, 50mM Tris-HCl，0. 01 % 明胶，pH 7.5)。以与上文所述相似的方法重复第二和第三筛选，从而筛选30，940个与血清IgG反应的噬菌体克隆，直至显色反应阳性菌落单一化。由此分离了 5个阳性克隆。(3)分离的抗原基因的同源性搜索为了对通过上述方法分离的5个阳性克隆进行核苷酸序列分析，实施将噬菌体载体转变成质粒载体的操作。具体地，制备200 μ 1吸光度0D_为1. 0的含宿主大肠杆菌 (XLl-Blue MRF’ )溶液。将其与250 μ 1纯化的噬菌体溶液混合，并随后和1 μ 1 ExAssist 辅助噬菌体(STRATAGENE)混合，随后在37 °C反应15分钟。添加:3ml LB培养基，在37 °C培养 2. 5至3小时。培养后，立即通过水浴将溶液温度保持在70°C，持续20分钟，4°C和IOOOXg 离心15分钟，并且然后收集上清液作为噬菌粒溶液。随后，制备200 μ 1吸光度OD6tltl为1. 0 的含噬菌粒宿主大肠杆菌(SOLR)溶液。将该溶液与10 μ 1纯化的噬菌体溶液混合，随后在 37°C反应15分钟。将溶液(50 μ 1)接种于含有氨苄青霉素(终浓度50 μ g/ml)的LB琼脂培养基，并且在37°C培养过夜。收集转化的SOLR单菌落并且在含有氨苄青霉素(终浓度 50 μ g/ml)的LB培养基中在37°C培养。应用QIAGEN质粒小量制备试剂盒OiIAGEN)纯化含有目的插入物的质粒DNA。使用SEQ ID NO :31的T3引物和SEQ ID NO :32的T7引物，通过引物步行法，对纯化的质粒进行插入物全长序列的分析。通过序列分析，获得SEQ ID N0:5、7、9、ll和13的基因序列。使用所述基因的核苷酸序列以及相应的氨基酸序列(SEQ ID N0:6、8、10、12和 14)来实施同源性搜索程序BLAST搜索(http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)。作为这个用已知基因进行的同源性检索的结果，发现获得的5个基因均编码CAraiN-Ι。就待翻译为蛋白质的区域而言，这五个基因之间的序列同一性为100%的核苷酸序列同一性和99% 的氨基酸序列同一性。此外，就待翻译为蛋白质的区域而言，所述基因与编码人同源物的基因的序列同一性为94%的核苷酸序列同一性和98%的氨基酸序列同一性。人同源物的核苷酸序列显示于SEQ ID NO :1和3，并且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO :2和4。此外，就待翻译为蛋白质的区域而言，由此获得的犬基因与编码牛同源物的基因的序列同一性为 94%的核苷酸序列同一性和97%的氨基酸序列同一性。牛同源物的核苷酸序列显示于SEQ ID NO: 15，并且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO :16。此外，就待翻译为蛋白质的区域而言， 编码人同源物的基因与编码牛同源物的基因之间的序列同一性为94%的核苷酸序列同一性，以及93%至97%的氨基酸序列同一性。此外，就待翻译为蛋白质的区域而言，所获得的犬基因与编码马同源物的基因的序列同一性为93 %的核苷酸序列同一性和97 %的氨基酸序列同一性。马同源物的核苷酸序列显示于SEQ ID NO :17，并且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO :18。此外，就待翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源物的基因与编码马同源物的基因之间的序列同一性为93%的核苷酸序列同一性和96%的氨基酸序列同一性。此外，就待翻译为蛋白质的区域而言，所获得的犬基因与编码小鼠同源物的基因的序列同一性为 87%至89%的核苷酸序列同一性和95%至97%的氨基酸序列同一性。小鼠同源物的核苷酸序列如SEQID NO :19、21、23、25和27所示并且其氨基酸序列如SEQ ID NO :20,22,24,26 和观所示。此外，就待翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源物的基因与编码小鼠同源物的基因之间的序列同一性为89 %至91 %的核苷酸序列同一性和95 %至96 %的氨基酸序列同一性。此外，就待翻译为蛋白质的区域而言，所获得的犬基因与编码鸡同源物的基因的序列同一性为82%的核苷酸序列同一性和87%的氨基酸序列同一性。鸡同源物的核苷酸序列显示于SEQ ID NO :29，并且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO :30。此外，就待翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源物的基因与编码鸡同源物的基因之间的序列同一性为81% 至82%的核苷酸序列同一性和86%的氨基酸序列同一性。(4)每一组织中的基因表达分析通过RT-PCR方法检验通过上述方法在犬和人正常组织及多种细胞系中获得的基因的表达。逆转录按照以下方式实施。具体地，使用TRIZOL试剂anvitrogen)，按照其中包含的方案从每一组织(50mg至IOOmg)和各细胞株(5至IOxlO6个细胞)中提取总RNA。 使用用于RT-PCR的Superscript第一链合成系统(Invitrogen)按照其中包含的方案，利用提取的总RNA合成cDNA。使用对所获得基因特异的引物(SEQ ID NO :33和34)，按照以下方式实施PCR。具体地，使用通过添加诸试剂(0. 25 μ 1通过逆转录反应制备的样品，上述引物(每种 2 μ Μ)，dNTP (每种 0. 2mM)和 0. 65UExTaq 聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)) 和附带的缓冲液以调节至25 μ 1总体积的反应溶液，以及Thermal Cycler (BIO RAD)，进行以下30个循环反应94°C 30秒，60°C 30秒和72°C 30秒。此外，上述基因特异性引物用来扩增SEQ ID NO 5的核苷酸序列(犬CAPRIN-I基因)第206至632位核苷酸之间的区域和SEQ ID NO 1的核苷酸序列(人CAPRIN-I基因)第698至IlM位核苷酸的区域。作为比较对照，同时使用GAPDH特异性引物(SEQ ID NO :35和36)。作为结果，如图1中显示，在健康犬的睾丸组织中观察到强表达，同时在犬乳腺癌及腺癌组织中观察到表达。此外，还证实了与所获得基因同源的人同源物的表达。作为结果，类似犬CAPRIN-I基因的情况那样， 在正常组织的情况下，仅在睾丸中证实了其表达。然而，在癌细胞的情况下，在许多类型的癌细胞系诸如乳腺癌、脑肿瘤、白血病、肺癌和食道癌细胞系中检测到表达。尤其在许多乳腺癌细胞系中证实了其表达。基于这些结果，证实了在除睾丸组织之外的正常组织中观察不到CAPRIN-I表达，然而，CAPRIN-I在许多癌细胞中并且尤其在乳腺癌细胞系中表达。
此外，在图1中，纵轴上的参考编号1显示上文所鉴定的每一基因的表达模式并且相同轴上的参考编号2显示用于比较对照的GAPDH基因的表达模式。(5)制备抗CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗体为获得与CAPRIN-I 结合的抗体，合成了 CAPRIN-1 衍生肽(Arg-Asn-Leu-Glu-Lys -Lys-Lys-Gly-Lys-Leu-Asp-Asp-Tyr-Gln(SEQ IDNO :37))。将作为抗原的所述肽(Img)和与肽等量的不完全弗氏佐剂(IFA)溶液混合。每两周一次地将该混合物皮下施与兔4次。随后，收集血液，由此获得含有多克隆抗体的抗血清。此外，应用蛋白G支持物(GEHealthcare Bio-Sciences)纯化该抗血清，并且获得抗CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗体。此外，选定了以上述相同的方式应用蛋白G支持物纯化没有施与抗原的兔的血清获得的抗体，作为对照抗体。(6)抗原蛋白在癌细胞上的表达分析接下来，检查CAPRIN-I蛋白是否在7种类型的乳腺癌细胞系(MDA_MB_157、T47D、 MRK-nu-1、MDA-MB-231V、BT20、SK-BR-3、和 MDA-MB-231T)的细胞表面表达，其中已强烈确认CAPRIN-I基因在这些细胞系中表达。将如上所述那样已确认了基因在其中表达的每种人乳腺癌细胞系(IO6个细胞)在1.5ml微离心管中离心。向其中添加上述(5)中制备的抗CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗体Qyg)(5yl)。使产物再悬浮于含有0.1%胎牛血清 (95 μ 1)的PBS中，然后在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，使产物悬浮于含有FITC-标记的山羊抗-兔 IgG 抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc. ) (5 μ 1)和 0. 胎牛血清 (FBS) (95 μ 1)的PBS中，并在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，应用FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company)测定荧光强度。同时，应用(5)中制备的对照抗体替代抗 CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗体，进行上述类似的步骤，由此制备对照。结果，发现在所有添加了抗人CAPRIN-I抗体的细胞中的荧光强度比对照细胞中的强度强至少30%。具体地，证实了以下荧光强度的增强:MDA-MB-157 =184%, T47D =221%, MRK-nu-1 =115%, MDA-MB-231V :82%、BT20 :32%、SK-BR-3 :279% 以及 MDA-MB-231T :80%。基于上述结果， 确认了 CAPRIN-I蛋白在上述人癌细胞系的细胞表面上表达。此外，荧光强度的增加率由细胞中平均荧光强度(MFI值)的增加率来表示。其通过以下等式计算。平均荧光强度的增加率(荧光强度增加率)(％)=((与抗人CAPRIN-I抗体反应的细胞的MFI值)-(对照MFI值))/ (对照MFI值)X 100(7)免疫组织化学染色(7)-1 正常小鼠和犬组织中的CAPRIN-I表达小鼠(Balb/c，雌性)和犬(比格犬，雌性)在乙醚麻醉下和在氯胺酮/异氟烷麻醉下放血。剖腹手术后，将器官(胃、肝、眼球、胸腺、肌肉、骨髓、子宫、小肠、食道、心脏、肾、 唾液腺、大肠(结肠)、乳腺、脑、肺、皮肤、肾上腺、卵巢、胰腺、脾脏和膀胱)分别转移至盛有PBS的10-cm平皿中。在PBS中切开每一器官并用含有4%多聚甲醛(PFA)的0. IM磷酸盐缓冲液(PH 7.4)回流固定过夜。弃去回流液，用PBS漂洗每一器官的组织表面，将含有 10%蔗糖的PBS溶液加入50-ml微离心管。然后将每一组织置于每一管中，然后使用转子在4°C振摇2小时。用含有20%蔗糖的PBS溶液更换每一溶液，然后使其在4°C静置直至组织沉降。用含有30%蔗糖的PBS溶液更换每一溶液，并使其在4°C静置直至组织沉降。取出每一组织并使用手术刀切下所需的区域。随后，将OCT化合物(Tissue Tek)施加至每一组织表面并铺展开，并随后将组织置于Cryomold上。将Cryomold置于干冰上以迅速冷冻。 使用冷冻切片机(LEICA)将组织切成厚度10 μ m至20 μ m，并且用电吹风对载玻片上的组织切片风干30分钟，由此制备其上置有组织切片的载玻片。随后，将每一载玻片置于充满 PBS-T (含有0. 05%吐温20的生理盐水)的染色瓶，每隔5分钟更换PBS-T，更换3次。使用Kimwipes纸巾擦掉每一样品周围的多余水分，用DAKOPEN(DAKO)圈定切片。将MOM小鼠 Ig封闭试剂(VECTASTAIN)置于小鼠组织上作为封闭液，并将含有10%胎牛血清的PBS-T 溶液置于犬组织上作为封闭液。使这些产物置于保湿室中在室温静置1小时。随后，制备含有抗CAPRIN-I的单克隆抗体(单克隆抗体#6)的溶液，其中所述的抗体是实施例4制备的具有SEQ ID NO :73的重链可变区和SEQ ID NO :77的轻链可变区，并与癌细胞表面反应， 将该抗体在封闭液中调节为10μ g/ml的浓度。将该溶液施加于每一载玻片，并且然后在保湿室中于4°C静置过夜。在用PBS-T洗涤3次，每次10分钟后，向每一载玻片中施加用封闭液稀释250倍的MOM生物素标记的抗IgG抗体(VECTASTAIN)，随后使之在保湿室中于室温静置1小时。用PBS-T洗涤3次，每次10分钟后，向载玻片上施加抗生物素蛋白-生物素 ABC试剂(VECTASTAIN)，并随后使之在保湿室中于室温静置5分钟。用PBS-T洗涤3次，每次10分钟后，向载玻片上施加DAB染色溶液(IOmg DAB+10 μ 1 30% Η202/0· 05Μ Tris-HCl, PH 7. 6，50ml)，并随后使之在保湿室中于室温静置30分钟。载玻片用蒸馏水淋洗，然后施加苏木精试剂(DAKO)。使载玻片在保湿室中于室温静置1分钟后，用蒸馏水淋洗。载玻片依次地浸在70%、80%、90%、95%和100%乙醇溶液中，每次1分钟，并随后使其在二甲苯中静置过夜。取出载玻片，用Glycergel封片介质(DAKO)封片，并且随后观察。作为结果， 在所有唾液腺、肾、结肠和胃组织的细胞内观察到微弱程度的CAPRIN-I表达；然而在细胞的表面上没有观察到CAPRIN-I表达。此外，在来自其它器官的组织中完全没有观察到表达。此外，当使用具有SEQ ID NO 103的重链可变区和SEQ ID NO :107的轻链可变区的抗 CAPRIN-I单克隆抗体(单克隆抗体#9)时，也得到了类似的结果。(7)-2 犬乳腺癌组织中的CAPRIN-I表达使用通过病理诊断法诊断为患有恶性乳腺癌的犬的108份冷冻犬乳腺癌组织样品，通过与上述类似的方法制备冷冻切片载玻片，并且用实施例4制备的单克隆抗体#6进行免疫组织化学染色。作为结果，在108份样品的100份(92. 5% )中证实了 CAPRIN-I表达。CAPRIN-I在异型度高的癌细胞表面上是特别强烈地表达。此外，当使用实施例4产生的单克隆抗体#9时，也获得了类似的结果。(7)-3 人乳腺癌组织中的CAPRIN-I表达应用石蜡包埋的人乳腺癌组织阵列(BIOMAX)的188份乳腺癌组织样品实施免疫组织化学染色。在60°C处理3小时后，将该人乳腺癌组织阵列加入到充满二甲苯的染色瓶中，然后每5分钟更换二甲苯，更换3次。随后，使用乙醇和PBS-T替代二甲苯重复相似流程。将人乳腺癌组织阵列加入到充满含有0. 05%吐温20的IOmM柠檬酸缓冲液(pH 6. 0) 的染色瓶中，在125°C处理5分钟，并且在室温静置40分钟或更长时间。使用Kimwipes纸巾擦掉每一样品周围的多余水分，用DAK0PEN圈定每一切片，并且向其逐滴添加足够量的过氧化物酶阻断剂(DAKO)。使所得物在室温静置5分钟后，然后加入到充满PBS-T的染色瓶。每5分钟更换PBS-T，更换3次。将含有10% FBS的PBS-T溶液施加在该阵列上作为封闭液，并且使该阵列置于保湿室中在室温持续1小时。随后，制备含有实施例4制备的、与癌细胞表面反应的单克隆抗体#6的溶液，应用含有5% FBS的PBS-T溶液将该抗体调节为10μ g/ml的浓度。施与该溶液，并且然后在保湿室中于4°C静置过夜。在用PBS-T洗涤3 次，每次 10分钟后，逐滴添加合适量的Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAKO), 并且随后使载玻片在保湿室中于室温静置30分钟。在用PBS-T洗涤3次，每次10分钟后， 施加DAB染色液(DAKO)，并且在室温静置约10分钟。弃去DAB染色液，然后用PBS-T洗涤3 次，每次10分钟。用蒸馏水淋洗载玻片，然后依次地浸在70%、80%、90%、95%和100%乙醇溶液中，每次1分钟，并随后使其在二甲苯中静置过夜。取出载玻片，用Glycergel封片介质(DAKO)封片，并且随后观察。作为结果，在全部188份乳腺癌组织样品的138份(73% ) 中观察到强烈的CAPRIN-I表达。此外，当使用实施例4制备的单克隆抗体#9时，也获得了类似的结果。(7)-4 人恶性脑肿瘤中的CAPRIN-I表达用实施例4中制备的单克隆抗体#6如上文(7)-3中类似的方式对石蜡包埋的人恶性脑肿瘤组织阵列(BIOMAX)的247份恶性脑肿瘤组织样品实施免疫组织化学染色。作为结果，在全部247份恶性脑肿瘤组织样品的227份(92% )中观察到强烈的CAPRIN-I表达。此外，当使用实施例4制备的单克隆抗体#9时，也获得了类似的结果。(7)-5 人乳腺癌转移的淋巴结中的CAPRIN-I表达用实施例4中制备的单克隆抗体#6以如上文(7)-3中类似的方式对石蜡包埋的人乳腺癌转移的淋巴结组织阵列(BIOMAX)的150份人乳腺癌转移的淋巴结组织样品实施免疫组织化学染色。作为结果，在全部150份人乳腺癌转移的淋巴结组织样品的136份 (90%)中观察到强烈的CAPRIN-I表达。特别地，揭示了 CAPRIN-I在转移自乳腺癌的癌组织中也强烈地表达。此外，当使用实施例4制备的单克隆抗体#9时，也获得了类似的结果。实施例2 抗CAPRIN-I抗体对癌细胞的抗肿瘤效果(ADCC活性)接下来，我们检查了抗CAPRIN-I抗体是否能够损伤表达CAPRIN-I的肿瘤细胞。 应用实施例1中制备的抗人CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗体实施评估。分别将已证实表达 CAPRIN-I的两类人乳腺癌细胞系(T47D和MDA-MB-157)(每种细胞IO6个细胞)收集至 50ml离心管中。往其中加入铬51 (100 μ Ci)，随后在37°C温育2小时。之后，用含有10% 胎牛血清的RPMI1640培养基洗涤细胞3次，并将细胞加入到96孔V-底培养板的孔中(每孔IO3个细胞)。往其中加入上述抗人CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗体(每孔Iyg)。之后， 往其中加入从兔外周血分离的淋巴细胞(每孔2 X IO5个细胞)，随后在37°C和5% CO2中培养4小时。培养后，确定每一培养上清液中从受损肿瘤细胞中释放的铬(Cr)51的水平。 然后，计算抗人CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗体对癌细胞的ADCC活性。结果，证实了针对 T47D(15. 4% )和MDA-MB-157(17. 3% )的ADCC活性(参见图2和3)。同时，当应用从未用抗原免疫的兔外围血中制备的对照抗体(实施例1(5))实施上述类似的方法时，或没有添加抗体时，基本上没有观察到活性(参见图2和3)。因此，这揭示了通过使用抗CAPRIN-I 抗体诱导的ADCC活性可损伤表达CAPRIN-I的肿瘤细胞。此外，对于细胞毒活性，将本发明使用的抗CAPRIN-I抗体、小鼠淋巴细胞和掺有铬51的IO3个来自白血病细胞系的细胞混合在一起，并培养4小时。之后，确定释放至培养基的铬51水平。然后，通过以下等式*计算对白血病细胞系的细胞毒活性。*等式细胞毒活性(％ )=[(从向其中添加了抗CAPRIN-I抗体和小鼠淋巴瘤的T47D或MDA-MB-157中释放的铬51水平)/(从向其中添加了 IN盐酸的靶细胞中释放的铬51水平)]XlOO实施例3 制备新的人癌抗原蛋白(1)重组蛋白的制备基于实施例1中获得的SEQ ID NO 1的基因通过下述方法制备人同源物基因的重组蛋白。使用Thermal Cycler (BIO RAD)，以及通过添加试剂及附带的缓冲液(1 μ 1 cDNA (其来自实施例1制备的衍生自各组织/细胞的cDNA，并通过RT-PCR观察其表达)、 含有SacI和XhoI限制性酶切位点序列的两种类型的引物(每种0. 4 μ M，SEQ ID NO :38 和 39)、0. 2mMdNTP 和 1. 25U PrimeSTAR HS 聚合酶(Takara Shuzo))以调节至达到总体积 50 μ 1的反应溶液进行PCR，所述PCR进行30个98°C /10秒和68°C /2. 5分钟的循环。使用上述两种引物来扩增编码SEQ ID NO :2的全长氨基酸序列的区域。在PCR后，将扩增的 DNA在琼脂糖凝胶上电泳，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒OiIAGEN)纯化约2. Ikbp 的DNA片段。将纯化的DNA片段连接入pCR-Blunt克隆载体(Invitrogen)。将所得物转化到大肠杆菌中，并回收质粒。基于测序证实扩增的基因片段匹配目的序列。用McI和B10I限制性酶处理匹配于目的序列的质粒，然后用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化所得物。然后将目的基因序列插入用Mel和BioI限制性酶处理的大肠杆菌pET30b表达载体(Novagen)。使用这种载体能够产生融合有His标签的重组蛋白。将所述质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 中用于表达，并且然后用ImM IPTG诱导表达，由此在大肠杆菌中表达靶蛋白。(2)重组蛋白的纯化在含有30μ g/ml卡那霉素的LB培养基中在37°C培养每一种上文所获得的表达SEQ ID NO :1的重组大肠杆菌，直至在600nm的吸光度达到大约0.7。然后添加异丙基-β-D-I-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度ImM，随后在37°C培养4小时。此后，通过以 4800rpm离心10分钟收集细胞。将细胞沉淀悬浮在磷酸盐缓冲的生理盐水中，并以4800rpm 离心10分钟，以洗涤细胞。将细胞悬浮在磷酸盐缓冲的生理盐水中，然后在冰上超声破碎。超声破碎的大肠杆菌的溶胞产物以6000rpm离心20分钟。将由此得到的上清液用作可溶级分，并将由此获得的沉淀用作不溶级分。将可溶级分添加至根据常规技术制备的镍螯合柱(载体=Chelateing kpharose (商标)Fast Flow (GE Health Care)；柱体积5ml ；50mM盐酸缓冲液(pH 8. 0)作为平衡缓冲液)。用约10倍柱体积的50mM盐酸缓冲液(pH 8. 0)和含有20mM咪唑的20mM 磷酸盐缓冲液(pH 8.0)洗去未吸附的级分。洗涤之后，立即用含有IOOmM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液(PH8. 0)洗脱6个床。将含有IOOmM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液(pH 8. 0)的洗脱级分(已通过考马斯染色法证实了目的蛋白的洗脱)添加至强阴离子交换柱(载体Q kpharose (商标)Fast Flow (GE Health Care)；柱体积5ml ；20mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0) 作为平衡缓冲液)。用10倍柱体积的20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和含有200mM氯化钠的 20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗去未吸附的级分。洗涤后，立即用含有400mM氯化钠的20mM 磷酸盐缓冲液(PH 7.0)洗脱5个床。由此，获得了各个具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的蛋白质的纯化级分。
将200 μ 1通过上述方法获得的每一纯化制备物分散到Iml的反应缓冲液(20mM Tris-HCl,50mM NaCl,2mM CaCl2,pH 7.4)中，然后添加 2μ1 肠激酶(Novagen)。使制备物在室温静置过夜进行反应，切除His标签，并且然后使用肠激酶切割捕获试剂盒(Novagen) 根据随附的说明书进行纯化。随后，使用超滤法NANOSEP IOK OMEGA (PALL)，用生理磷酸盐缓冲液(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.)置换1. 2ml由上述方法获得的每一纯化制备物。通过0. 22μπι HT Tuffryn Acrodisc(PALL)实施无菌过滤，并且所得物用于以下实验。实施例4 抗CAPRIN-I单克隆抗体的制备将实施例3中制备的SEQ ID NO :2所示抗原蛋白(人CAPRIN-1) (100 μ g)与等量的MPL+TDM佐剂(Sigma)混合。将该混合物用作每只小鼠的抗原溶液。将该抗原液腹膜内地施用至6周龄的Balb/c小鼠(Japan SLCInc.)，并且以每周为间隔再施用该溶液3次或M次，以完成免疫。最后免疫3日后取出脾脏，然后将其在两片无菌的载玻片之间研磨。 用PBS(-) (Nissui)洗涤每一所得物，然后以1500rpm离心10分钟，并因此重复3次移除上清液的程序。由此，获得脾脏细胞。将由此获得的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(购自 ATCC)以10 1的比例混合。添加PEG溶液至细胞，其中所述的PEG溶液通过使在37°C加热的 200 μ 1 含有 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基与 800 μ 1 PEG1500 (Boehringer)混合而制得。使溶液静置5分钟以进行细胞融合。所得物以1700rpm离心5分钟，以移除上清液。 将细胞悬浮于150ml已经添加2%等价HAT溶液(Gibco)的含有15% FBS的RPMI 1640培养基(HAT选择培养基)中，并且以每孔100 μ 1铺种于15块96孔平板(Nunc)中。在37°C 和5% CO2的条件下培养细胞7天，由此获得因脾脏细胞与骨髓瘤细胞的融合而产生的杂交瘤。使用由这样制备的杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-I蛋白的结合亲和力作为指标， 选择杂交瘤。将实施例3中制备的CAPRIN-I蛋白溶液(1 μ g/ml)以每孔100 μ 1的量添加至96孔平板，并使该平板在4°C静置18小时。各孔用PBS-T洗涤3次，以每孔400 μ 1的量添加0.5%牛血清白蛋白(BSA)溶液(Sigma)，并且然后使该平板在室温静置3小时。移除该溶液，用400μ1的PBS-T洗涤各孔3次。以每孔100 μ 1的量添加上文获得的每个杂交瘤的培养上清液，并且使该平板在室温静置2小时。用PBS-T洗涤备孔3次，以每孔100 μ 1 的量添加用PBS稀释5000倍的HRP标记的抗小鼠IgG (H+L)抗体(Invitrogen)，并且在室温静置1小时。用PBS-T洗涤各孔3次，以每孔100 μ 1的量添加TMB底物溶液(Thermo)， 并且静置15至30分钟，由此进行显色反应。在颜色显现后，以每孔100 μ 1的量添加IN硫酸以终止该反应。使用吸光度计测定在450nm的吸光度和在595nm的吸光度。结果，选出了具有高吸光度值的产生抗体的多株杂交瘤。将由此选出的杂交瘤以每孔0.5个杂交瘤细胞的量添加至96孔平板并培养。1周后，观察到在孔中形成单个集落杂交瘤。进一步培养这些孔中的细胞。使用(从克隆的杂交瘤产生的抗体)对CAPRIN-I蛋白的结合亲和力作为指标，选择杂交瘤。将实施例3中制备的CAPRIN-I蛋白溶液(1 μ g/ml)以每孔100 μ 1的量添加至96孔平板，并使该平板在4°C静置18小时。各孔用PBS-T洗涤3次，以每孔400 μ 1的量添加0. 5% BSA溶液，并且然后使该平板在室温静置3小时。移除该溶液，用400 μ 1的PBS-T洗涤各孔3次。以每孔100 μ 1 的量添加上文获得的每个杂交瘤的培养上清液，并且使该平板在室温静置2小时。用PBS-T 洗涤各孔3次，以每孔100 μ 1的量添加用PBS稀释5000倍的HRP标记的抗小鼠IgG (H+L)抗体(Invitrogen)，并且在室温静置1小时。用PBS-T洗涤各孔3次，以每孔100 μ 1的量添加TMB底物溶液(Thermo)，并且静置15至30分钟，由此进行显色反应。在颜色显现后， 以每孔100 μ 1的量添加IN硫酸以终止该反应。使用吸光度计测定在450nm的吸光度和在 595nm的吸光度。结果，获得了 150个杂交瘤细胞系，这些细胞系产生显示出与CAPRIN-I蛋白的反应性的单克隆抗体。接下来，在这些单克隆抗体当中选出显示了与表达CAPRIN-I的乳腺癌细胞的表面的反应性的单克隆抗体。具体地，在1. 5ml微量离心管中离心IO6个MDA-MB-231V人乳腺癌细胞系细胞。添加上文制备的每一杂交瘤上清液(100 μ 1)，并且在冰上静置1小时。 在用PBS洗涤后，添加用含有0. 1% FBS的PBS稀释500倍的FITC标记的山羊抗小鼠IgG 抗体(Invitrogen)，并在冰上静置1小时。在用PBS洗涤后，使用FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company)测量荧光强度。同时，应用用杂交瘤培养基稀释500倍的未受处理的6周龄Balb/c小鼠血清代替抗体实施类似程序，由此制备对照。结果，选出了 11个 (#1至#11)具有比对照更强的荧光强度的单克隆抗体；即，选出了与乳腺癌细胞表面反应的单克隆抗体实施例5 所选择的抗体的表征(1)抗CAPRIN-I单克隆抗体可变区基因的克隆从产生实施例4所选择的11个单克隆抗体的杂交瘤细胞系中提取mRNA。应用对衍生自小鼠FRl的序列和衍生自小鼠FR4的序列特异的引物，通过RT-PCR获得每一抗 CAPRIN-I单克隆抗体的重链可变(VH)区基因和轻链可变(VL)区基因。为了测序，将这些基因分别克隆至PCR2. 1载体(Invitrogen)。(I)-IRT-PCR应用mRNA微量纯化试剂盒(GE Healthcare)从每一杂交瘤细胞系(IO6个细胞) 制备mRNA。应用Supei^criptII第一链合成试剂盒(Invitrogen)对每一获得的mRNA进行逆转录，用于cDNA合成。根据该试剂盒所附方案进行上述程序。 对每一获得的cDNA通过PCR进行抗体基因扩增。为获得VH区基因，应用了对小鼠重链FRl序列特异的引物(SEQ IDNO :130)和对小鼠重链FR4序列特异的引物(SEQ ID N0:131)。此外，为获得VL区基因，应用了对小鼠轻链FRl序列特异的引物(SEQ ID N0:132)和对小鼠轻链FR4序列特异的引物(SEQ ID NO :133)。参照 Jones，S. T. ^P Bending, Μ. Μ. Bio/Technology 9，88-89 (1991)设计这些引物。为了进行 PCR，使用了 Ex-taq (Takara Bio he.)。将每一 cDNA 样本与 IOxEX Taq 缓冲液(5 μ 1)、dNTP 混合物(2. 5mM) (4 μ 1)、引物(1. 0 μ Μ)(每种 2 μ 1)禾口 ExTaq (5U/μ 1) (0.25 μ D混合。应用无菌水将总体积调节至50 μ 1。在包括以下条件的条件下进行PCR: 在94°C处理2分钟后，进行30个以下循环94°C变性1分钟、58°C退火30秒、以及在72°C 延伸1分钟。(1)-2 克隆将上述获得的每一 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后切取VH区和VL区的DNA 带。应用QIAquick凝胶纯化试剂盒01IAGEN)根据该试剂盒所附说明书纯化DNA。应用TA 克隆试剂盒(Invitrogen)将每一纯化的DNA克隆至pCR2. 1载体中。将每一 DNA连接的载体根据常规方法转化至Dffia感受态细胞(Τ0Υ0Β0)中。在37°C在培养基(100 μ g/ml氨苄
30青霉素)中培养每一转化子(10个克隆)过夜。应用Qiaspin小量制备试剂盒OiIAGEN) 纯化所获得的质粒DNA。(1)-3 测序应用荧光测序仪(ABI ；DNA测序仪3130XL)和BigDye终止子Ver. 3. 1循环测序试剂盒(ABI)，根据试剂盒所附说明，应用M13正向引物(SEQ IDNO 134)和M13反向引物 (SEQ ID NO :135)对上述获得的每一质粒的VH区和VL区进行基因序列分析。结果，确定了每一基因序列(在10个克隆中是同一的)。所得到的单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO 43、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO 83,SEQ ID NO93,SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO :113和 SEQ ID NO :123 ；所得到的单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 58,SEQID NO :63、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO :77、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO :97、SEQ ID NO :107,SEQ ID NO :117 和 SEQ ID N0:127。具体地，单克隆抗体#1包含SEQ ID NO 43的重链可变区和SEQ IDNO 47的轻链可变区。单克隆抗体#2包含SEQ ID NO :43的重链可变区和SEQ ID NO :53的轻链可变区。 单克隆抗体#3包含SEQ ID NO 43的重链可变区和SEQ ID NO 58的轻链可变区。单克隆抗体#4包含SEQ IDNO :43的重链可变区和SEQ ID NO :63的轻链可变区。单克隆抗体#5 包含SEQ ID NO :43的重链可变区和SEQ ID NO :68的轻链可变区。单克隆抗体#6包含SEQ ID NO 73的重链可变区和SEQ ID NO 77的轻链可变区。单克隆抗体#7包含SEQ ID NO 83的重链可变区和SEQ ID NO 87的轻链可变区。单克隆抗体#8包含SEQ ID NO 93的重链可变区和SEQ IDNO 97的轻链可变区。单克隆抗体#9包含SEQ ID NO :103的重链可变区和SEQ ID NO :107的轻链可变区。单克隆抗体#10包含SEQ ID NO :113的重链可变区和 SEQ ID NO 117的轻链可变区。单克隆抗体#11包含SEQID NO :123的重链可变区和SEQ ID NO 127的轻链可变区。(2)应用所获得的单克隆抗体的CAPRIN-I在不同细胞的细胞表面上的表达接下来，我们检查了 CAPRIN-I蛋白是否在7种已证实在其中表达CAPRIN-I 基因的乳腺癌细胞系(MDA-MB-157、T47D、MRK-nu-l、MDA-MB-231V、BT20、SK-BR-3 和 DA-MB-231T)、3种其他乳腺癌细胞系(MDA-MB-231C、MCF-7和ZR75-1)、6种神经胶质瘤细胞系(T98G、SNB19、U251和U87G)、3种肾癌细胞系(Caki-1、Caki2和A498)、1种胃癌细胞系(MKN45)、1种大肠癌细胞系(Caco2)、3种肺癌细胞系(A549, QG56和PC8)、以及3种白血病细胞系(Namalwa、BDCM和RPI1788)的细胞表面表达。在1. 5ml微离心管中离心每一细胞系(IO6个细胞)。分别将实施例4中制备的与癌细胞表面反应的含有抗CAPRIN-I单克隆抗体#1至#10的杂交瘤上清液(每一种100 μ 1)添加至其中，并在冰上静置1小时。 在用PBS洗涤后，将每一所得物悬浮于用含有0. 1 % FBS的PBS稀释500倍的FITC-标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Invitrogen Corporation)中，然后在冰上静置1小时。在用PBS洗涤后，应用FACSCalibur (Becton，Dickinson and Company)测量荧光强度。同时，应用上述 (5)中制备的对照抗体作为对照代替含有抗CAPRIN-I的单克隆抗体#1至#11的杂交瘤上清液，实施与上述相同的程序，由此制得对照。结果，发现加入了单克隆抗体#1至#11的所有细胞均比对照细胞的荧光强度强至少30%。具体地，例如当使用单克隆抗体#9时，证实了荧光强度的以下增强:MDA-MB-157 :211% ；T47D 145% ；MRK-nu-l :123% ；MDA—MB—231V 251% ；BT20 :168%以及MDA-MB-231T 94% .基于此，证实了 CAPRIN-I蛋白在上述人癌细胞系的细胞表面表达。此外，荧光强度的增强率由细胞中平均荧光强度(MFI值)的增强率来表示。其通过以下等式计算。平均荧光强度的增强率(荧光强度增强率)(％)=((与抗人CAPRIN-I抗体反应的细胞的MFI值)-(对照MFI值))/ (对照MFI值)X 100(3)抗CAPRIN-I抗体对癌细胞的抗肿瘤效果(ADCC活性)根据对癌细胞的细胞毒活性(ADCC活性)评估了上面选择的抗CAPRIN-I单克隆抗体#1至#11。应用杂交瘤SFM培养基(Invitrogen)培养产生单克隆抗体#1至#11的杂交瘤。应用Hitrap蛋白A琼脂糖FF(GEHealthcare)纯化每一获得的上清液，随后用PBS(-) 置换，并用0.22-μ m滤器(Millipore)纯化。将每一所得物用作活性确定的抗体。将人乳腺癌MDA-MB-157细胞系(IO6个细胞)收集至50ml离心管中。往其中加入铬51 (100 μ Ci)， 随后在37°C温育2小时。之后，用含有10% 83的1 ^11640培养基洗涤细胞3次。将细胞加入到96孔V-底培养板的孔中(每孔103个细胞)。这样制得靶细胞。往其中加入上述纯化的抗体(每孔Iyg)。之后，往其中加入从小鼠脾脏中分离的小鼠淋巴细胞(每孔 2X IO5个细胞)，随后在37°C和5% CO2中培养4小时。培养后，确定每一培养上清液中从受损肿瘤细胞中释放的铬(Cr)51的水平。然后，计算每一抗人CAPRIN-I衍生肽的多克隆抗体对癌细胞的ADCC活性。结果，所有单克隆抗体#1至#11显示出针对MDA-MB-157的 ADCC活性(20%或更多)。具体地，例如，得到了以下细胞毒活性#1 22. 1% ；#2 :29. 1% ； #6 30. 2% ；和#9 32. 4% (参见图4)。同时，当应用实施例4中制备的与CAPRIN-I蛋白质本身反应但不与癌细胞表面反应的单克隆抗体实施上述类似的方法时，证实了没有细胞毒活性(参见图4)。上述结果显示了所获得的抗CAPRIN-I单克隆抗体(#1至#11)通过展示出ADCC活性损伤表达CAPRIN-I的癌细胞。(4)抗CAPRIN-I抗体对癌细胞的抗肿瘤效果(⑶C活性)根据对癌细胞的细胞毒活性(CDC活性)评估了上面选择的抗CAPRIN-I单克隆抗体#1至#11。将通过血液采样从兔中收集的血液加入到Eppendorf管中，在室温下静置 60分钟，随后以3000rpm离心5分钟。由此，制得用于⑶C活性确定的血清。将人乳腺癌 MDA-MB-231V细胞系(IO5个细胞)收集至50ml离心管中。往其中加入铬51 (100 μ Ci)，随后在37°C温育2小时。之后，用含有10% FBS的RPMI培养基洗涤细胞3次，然后将其悬浮于含有50%上述制备的兔血清的RPMI中。将细胞加入到96孔ν-底培养板的孔中(每孔IO3个细胞)。分别将上面(3)中获得的抗体#1至#11加入到孔中(每孔1 μ g)，随后在37°C和5% CO2中培养4小时。培养后，确定每一培养上清液中从受损肿瘤细胞中释放的铬(Cr) 51的水平。然后，计算每一杂交瘤上清液中抗CAPRIN-I单克隆抗体展示出的针对MDA-MB-231V的⑶C活性。结果，所有单克隆抗体#1至#11展示出⑶C活性(30%或更多)。同时，当应用实施例4中制备的与CAPRIN-I蛋白质本身反应但不与癌细胞表面反应的单克隆抗体实施上述类似的方法时，证实了没有细胞毒活性(参见图4)。因此，揭示了抗 CAPRIN-I单克隆抗体(#1至#11)还可通过展示出⑶C活性损伤表达CAPRIN-I的癌细胞。实施例6 抗CAPRIN-I单克隆抗体对小鼠的体内抗肿瘤效果接下来，评估了所得抗CAPRIN-I单克隆抗体#1至#11对带瘤小鼠的体内抗肿瘤效果。通过以上述方法对每一杂交瘤上清液进行柱纯化得到这一实施例中使用的抗体。
应用带瘤小鼠检查抗CAPRIN-I单克隆抗体#1至#11的抗肿瘤效果，其中向所述带瘤小鼠中移植了表达CAPRIN-I的衍生自小鼠的癌细胞系。将CD6细胞(购自ATCC)皮下移植至70只Balb/c小鼠(Japan SLC, Inc.)的背部(每只小鼠IO6个细胞)。使每一肿瘤生长，直至其直径变为约7mm。对该带瘤小鼠(70只中的60只)腹膜内施与抗CAPRIN-I 单克隆抗体#1至#11，以及实施例4中制备的一类单克隆抗体(与CAPRIN-I蛋白质本身反应，但不与癌细胞表面反应)(每种抗体5只小鼠)，剂量为每只小鼠300 μ g (300 μ 1)。之后，在总共2天期间以相同的剂量腹膜内施与每一抗体至相关带瘤小鼠3次。每天测量肿瘤尺寸，用于观察抗肿瘤效果。给10只剩余的带瘤小鼠施与PBS(-)代替抗体。这组小鼠设计作为对照组。作为抗肿瘤效果的观察结果，在施与了抗CAPRIN-I单克隆抗体#1至#11 的测试组的情况下，所发生的肿瘤消退达到了这样的程度，即开始施与抗体时的肿瘤体积 (100% )在第4天下降至50%，第6天下降至约10%，并且在第8天为百分之几。在第11 至14天发生了基本上完全的肿瘤消退(见图幻。另一方面，在对照组中，在第4、6、8和11 天，肿瘤体积分别增长至原始体积的260 %、350 %、550 %和800 % (参见图幻。另外在施与了单克隆抗体(与CAPRIN-I蛋白质本身反应，但不与癌细胞表面反应)的小鼠组中，没有展现出抗肿瘤效果，并且如对照组那样发生肿瘤生长。该结果表明所获得的抗CAPRIN-I单克隆抗体#1至#11展示出强烈的针对表达CAPRIN-I的癌细胞的体内抗肿瘤效果。此外， 通过以下公式计算肿瘤体积从而获得肿瘤尺寸长直径X短直径X短直径X0. 5。此外，以上述相同的方式将抗CAPRIN-I单克隆抗体#1至#11施与带瘤小鼠 (Balb/c)，其中向该小鼠移植了小鼠NlE癌细胞(购自ATCC)。这导致在施与抗体后第15 天肿瘤完全消退。另一方面，在对照组中，肿瘤体积升高至高达原始体积的约950% (参见图6)。实施例7 鉴定CAPRIN-I蛋白中的肽，其中与癌细胞表面反应的抗CAPRIN-I抗体结合所述肽应用与癌细胞表面反应的抗CAPRIN-I单克隆抗体#1至#11 (上面获得)，鉴定了由这些单克隆抗体识别的CAPRIN-I蛋白中的部分序列。首先，通过将重组CAPRIN-I蛋白用PBS溶解为1 μ g/μ 1浓度制备溶液，将 DTT(Fluka)添加到100 μ 1该溶液中至IOmM终浓度，随后在95 °C反应5分钟，由此使 CAPRIN-I蛋白内的二硫键还原。接下来，以20mM的终浓度加入碘乙酰胺(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)，然后在遮光条件下在37°C对硫醇基进行烷基化反应30分钟。将50 μ g每一种抗CAPRIN-I单克隆抗体#1至#11加入到40 μ g如此获得的还原的烷基化的CAPRIN-I蛋白中，将混合物体积调节至ImL 20mM的磷酸盐缓冲液(pH7. 0)，然后在搅拌混合每一混合物的同时使该混合物在4°C反应过夜。然后，添加胰蛋白酶(ftOmega)至0. 2 μ g的终浓度。在37°C反应1小时、2小时、4 小时和12小时后，将所得物与在ImM碳酸钙及NP-40缓冲液QOmM磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)、 5mM EDTA、150mM NaCl和NP-40)中的蛋白A-玻璃珠(GE)混合，然后反应30分钟，其中所述的蛋白A-玻璃珠在此之前用含BSA(Sigma)的PBS进行封闭并然后用PBS洗涤。用25mM碳酸铵缓冲液(pH 8. 0)洗涤每一反应混合物，然后用100 μ 10. 1 %甲酸洗脱抗原-抗体复合物。应用Q-TOF Premier(Waters-MicroMass)根据该仪器所附说明对洗脱物进行LC-MS分析。
结果，鉴定出了 SEQ ID NO :136的多肽作为CAPRIN-I的部分序列，其被所有抗 CAPRIN-I单克隆抗体#1至#11识别。此外，鉴定了 SEQ ID NO :137的肽，其作为上述SEQ ID NO :136多肽中的部分序列，被单克隆抗体#2至#5、#6至#8和#10识别。还揭示了单克隆抗体#2至#5识别SEQ ID NO :138的肽，其为SEQ ID NO :137肽中的部分序列肽。工业实用性本发明的抗体可用于治疗和/或预防癌。本说明书包括日本专利申请号2009-087285的说明书和/或附图的全部或部分公开内容，其中本申请对所述的日本专利申请号要求优先权。此外，本文中引用的全部出版物、专利和专利申请也通过引用的方式完整并入本文中。序列表独立文本引物SEQ ID NO :31 至 39 及 130 至 13权利要求
1.用于治疗和/或预防癌症的药物组合物，其包含作为活性成分的具有与CAPRIN-I蛋白、或与包含7个或更多个连续氨基酸的CAPRIN-I蛋白片段的免疫学反应性的抗体或其片段，其中所述的CAPRIN-I蛋白具有偶数编号的SEQ ID NO :2_30任一项所示的氨基酸序列， 或与所述氨基酸序列具有80%或更多序列同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的药物组合物，其包含作为活性成分的具有与CAPRIN-I蛋白片段的免疫学反应性的抗体或其片段，其中所述的CAPRIN-I蛋白片段是由除了 SEQ ID N0:6和18 之外的偶数编号的SEQID NO :2-30任一项所示氨基酸序列中的氨基酸残基编号50-98或氨基酸残基编号233-305区域内的7个或更多个连续氨基酸组成的多肽，或包含所述多肽作为部分序列的多肽。
3.根据权利要求1的药物组合物，其包含作为活性成分的具有与CAPRIN-I的部分多肽、或与包含7个或更多个连续氨基酸的所述部分多肽的片段的免疫学反应性的抗体或其片段，其中所述的CAPRIN-I部分多肽具有SEQ ID NO 37或SEQ ID NO :136所示的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80%或更多序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项的药物组合物，其中所述癌症是乳腺癌、脑肿瘤、白血病、 淋巴癌、肺癌、食道癌或大肠癌。
5.根据权利要求1-4任一项的药物组合物，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求1-4任一项的药物组合物，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或双特异性抗体。
7.具有与下述多肽的免疫学反应性的抗体，其中所述的多肽具有SEQIDN0:37或SEQ ID NO 136所示的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有80%或更多序列同一性的氨基酸序列。
8.抗体，其包含有包含SEQID NO :40、41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 44,45和46所示序列的轻链可变区，并且具有与CAPRIN-I蛋白的免疫学反应性。
9.抗体，其包含有包含SEQID NO :40、41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO :50、51和52所示序列的轻链可变区，并且具有与CAPRIN-I蛋白的免疫学反应性。
10.抗体，其包含有包含SEQID NO :40、41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 55,56和57所示序列的轻链可变区，并且具有与CAPRIN-I蛋白的免疫学反应性。
11.抗体，其包含有包含SEQID NO :40、41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 60,61和62所示序列的轻链可变区，并且具有与CAPRIN-I蛋白的免疫学反应性。
12.抗体，其包含有包含SEQID NO :40、41和42所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 65,66和67所示序列的轻链可变区，并且具有与CAPRIN-I蛋白的免疫学反应性。
13.抗体，其包含有包含SEQID NO :70、71和72所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 74,75和76所示序列的轻链可变区，并且具有与CAI3RIN-I蛋白的免疫学反应性。
14.抗体，其包含有包含SEQID NO :80、81和82所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 84,85和86所示序列的轻链可变区，并且具有与CAPRIN-I蛋白的免疫学反应性。
15.抗体，其包含有包含SEQID NO :90、91和92所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO 94,95和96所示序列的轻链可变区，并且具有与CAPRIN-I蛋白的免疫学反应性。
16.抗体，其包含有包含SEQID N0:100、101和102所示序列的重链可变区，以及包含SEQ ID N0:104、105和106所示序列的轻链可变区，并且具有与CAPRIN-I蛋白的免疫学反应性。，17.抗体，其包含有包含SEQ ID N0:110、lll和112所示序列的重链可变区，以及包含 SEQ ID NO: 114、115和116所示序列的轻链可变区，并且具有与CAPRIN-I蛋白的免疫学反应性。
17.抗体，其包含有包含SEQID N0:120、121和122所示序列的重链可变区，以及包含 SEQ ID NO :1M、125和1 所示序列的轻链可变区，并且具有与CAPRIN-I蛋白的免疫学反应性。
18.根据权利要求7至17任一项的抗体，其是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或双特异性抗体。
19.用于治疗和/或预防癌症的药物组合物，其包含作为活性成分的根据权利要求 7-18任一项的抗体或其片段。
20.用于治疗和/或预防癌症的方法，其应用具有与CAPRIN-I蛋白、或与包含7个或更多个连续氨基酸的CAPRIN-I蛋白片段的免疫学反应性的抗体或其片段，其中所述的 CAPRIN-I蛋白具有偶数编号的SEQ ID NO :2_30任一项所示的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80%或更多序列同一性的氨基酸序列。
21.用于治疗和/或预防癌症的方法，其特征在于应用根据权利要求7-18任一项的抗体或其片段。
全文摘要
本发明涉及治疗和/或预防癌症的药物组合物，其包含作为活性成分的抗体或其片段，具有与CAPRIN-1蛋白或包含7个或更多个连续氨基酸的所述蛋白片段的免疫学反应性。
文档编号A61P35/00GK102170907SQ200980138959
公开日2011年8月31日 申请日期2009年8月5日 优先权日2008年8月5日
发明者井户隆喜, 冈野文义, 小林真一, 斋藤孝则 申请人:东丽株式会社