专利名称：：治疗和预防柑橘青果病的方法及组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及杀虫剂组合物，尤其涉及包含新确定的挥发性化合物的杀虫剂组合物以及用这种挥发性组合物驱逐或杀死柑橘青果病传播介体的方法。
背景技术：
：黄龙病(HLB)或柑橘青果病于1919年首次在中国南方报道(Reinkinget等，1919)，但普遍认为其起源于非洲。目前大约在40个不同的亚洲、非洲、北美和南美国家发现有这种病，近些年来在佛罗里达州、加利福尼亚州、路易斯安那州、德克萨斯州和巴西等主要的柑橘产地威胁日益严重。柑橘青果病是由局限于韧皮部的难培养的Hit亥α-proteobacteriumCandidatusLiberibacterspp.,Ca.africanus(φyjfl型)和Ca.L.americanus(美洲型)引起的。两种木虱，亚洲柑橘木虱(DiaphorinacitriKuwayama)和非洲柑橘木虱(Triozaerytreaei)是已知的传播这种疾病的介体(Manjimath等，200。柑橘树感染了这种毁灭性的柑橘青果病后，会变得倾斜、畸形、果实腥异味，然后在几年内死去。每年佛罗里达州约14亿美元的柑橘产业(Ewing等，2006-2007)严重受到这种传播介体疾病系统的威胁。每年加利福尼亚州柑橘产业受这种病的威胁损失130万美元。目前，对这种病没有治疗方法，树木一旦感染严重通常就被销毁。而且，也没有已知的相关栽培品种可以抵抗柑橘青果病。自2005年以来，据估计，为了减缓这种病的传播，巴西已经销毁了约650000棵树木，佛罗里达州也有类似的数字。图1为番石榴整叶(下迹线)和番石榴碎叶(上迹线)的硫色谱对比图。图2为番石榴叶被粉碎后番石榴叶挥发物的峰面积变化图。图3为番石榴碎叶样本的总离子流(TIC)色谱图。图4显示了番石榴幼芽和柑橘幼芽的含硫挥发物的色谱对比图。色谱显示了番石榴整叶和碎叶分别产生的含硫挥发物，并与柑橘整叶和碎叶分别产生的含硫挥发物进行比较。为了获得这些色谱结果，分别收集番石榴或柑橘幼芽整叶的静态顶部空间挥发物，在收集之前先将样本在实验室环境条件下平衡约30分钟，或者经机械粉碎后每过一段时间(0、10、30或60分钟)收集一次样本的静态顶部空间挥发物。Y轴显示的是GC-PFPD响应(mV)，χ轴是保留时间(分钟)。图5显示了在4选择区嗅觉计中亚洲柑橘木虱(D.citri)对分别从柑橘整叶，柑橘碎叶与二甲基二硫(DMDQ组合，单独的二甲基二硫，番石榴碎叶与柑橘碎叶组合，番石榴整叶与柑橘整叶组合，番石榴碎叶与番石榴整叶组合，柑橘碎叶与柑橘整叶组合散发出的挥发物的响应对比。灰条代表受到吸引的亚洲柑橘木虱的百分数，而白条代表受到驱逐的亚洲柑橘木虱的百分数。白条或灰条后面跟着的字母相同就表示没有显著区别(Tukey'sHSD检验，P<0.05)。图6a_6b显示了当Y形管嗅觉计的两个臂提供从单独的柑橘整叶(柑橘)或从柑橘整叶与二甲基二硫组合(柑橘+二甲基二硫)散发出的挥发物时，亚洲柑橘木虱对挥发物的响应对比。灰条代表受到驱逐的亚洲柑橘木虱的百分数，而白条代表受到吸引的亚洲柑橘木虱的百分数(a)；和当嗅觉计的一个臂为实验室空气而另一个臂为从柑橘整叶(柑橘)或二甲基二硫的矿物油溶液(二甲基二硫)散发出的挥发物时，亚洲柑橘木虱的行为响应(b)。灰条代表受到驱逐的亚洲柑橘木虱的百分数，而白条代表受到吸引的亚洲柑橘木虱的百分数。
发明内容本发明的发明人出乎意料的发现，由普通番石榴(PsidiumguajavaL.)释放出来的挥发性化合物对柑橘青果病的传播介体具有驱虫或杀虫效果。传播介体的典型例子如昆虫，它能携带柑橘青果病，包括但不限于木虱，亚洲柑橘木虱(DiaphorinacitriKuwayama)和非洲柑橘木虱(Triozaerytreaei)。木虱指韧皮部取食的昆虫类(木虱科，同翅目)，涉及蚜虫(aphids)蚧虫(coccids)和粉虱(whiteflies)。这里所使用的“有效量”或类似术语的意思是为了达到需要的结果如驱逐或杀死柑橘青果病的传播介体，通常是昆虫传播介体，所必需的剂量以及持续一段时间的有效数量。这里所使用的“驱逐”意思是在希望的区域内存在的柑橘青果病传播介体比没有采取措施时的传播介体有所减少。在希望的区域内传染柑橘青果病的传播介体是指在该希望的区域内至少有一种传播介体。驱逐也包括在没有害虫存在的希望区域内通过采取措施而预防传染，如果不采取措施就会有至少一种害虫存在。这里所使用的“杀死”意思是用一种方法或组合物杀死传播介体和/或抑制或减少传播介体生长。如果在一希望或预定的区域内传播介体的数量有了相对减少，那么传播介体的生长就受到了抑制。如果传播介体的正常生长方式被改变，从而对每个传播介体个体产生了负面影响，那么也可以说传播介体的生长已经得到抑制。如果在希望的区域内通过采取措施后传播介体比没有采取措施时少了，那么采取措施已经减少了传播介体的数量。根据本发明的一个方面，提供了一种杀死或驱逐柑橘青果病传播介体的方法，包括使传播介体暴露在有效量的表1和表2中(包括但不限于“未确认”的峰)所列的至少一种挥发性化合物中，以驱逐或杀死至少一种柑橘青果病传播介体。根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗感染了柑橘青果病传播介体的柑橘植物的方法，包括对柑橘植物或柑橘植物周围区域给药有效量的表1和表2中所列的至少一种挥发性化合物，以驱逐或杀死至少一种柑橘青果病的传播介体。根据本发明的另一个方面，提供了一种组合物，该组合物包括表1和表2中所列的至少一种挥发性化合物和农业上可接受的载体，其中挥发性化合物的量为能驱逐或杀死柑橘青果病至少一种传播介体的有效量。根据本发明的另一个方面，提供了一种给予、增加或提高用于驱逐或杀死柑橘青果病传播介体的组合物的驱虫或杀虫效果的方法，该方法是向该组合物中加入表ι和表2中所列的至少一种挥发性化合物，该挥发性化合物的加入量为能杀死或驱逐柑橘青果病至少一种传播介体的有效量。这里所描述的任何一个实施方案中，本发明的挥发性化合物(活性组分)可以用已知的方法合成制备或者可以从这里所述的普通番石榴(PsidiumguajavaL.)中获得。例如，合成的二甲基二硫可以作为挥发性化合物，很容易从合适的商业途径获得。另外，如下面实施例所述，本发明的发明人发现粉碎后的番石榴叶所产生的某些含硫和不含硫挥发性化合物的量更大(相对于没有粉碎的叶子)，而这些含硫和不含硫挥发性化合物被认为对柑橘青果病的传播介体具有驱虫或杀虫效果。因此，在本发明的一个实施方案中，普通番石榴叶经粉碎后提供一种或多种本发明使用的挥发性化合物。因此，本发明的另一个方面提供了一种驱逐或杀死柑橘青果病传播介体的方法。该方法包括使传播介体暴露在有效量的二甲基二硫组合物中，以驱逐或杀死至少一种柑橘青果病的传播介体。本发明的另一个方面提供了一种制造的产品。这种制造的产品包括能驱逐或杀死至少一种柑橘青果病传播介体的有效量的二甲基二硫和二甲基二硫的农业上可接受的载体。提供了一种容器，其包括了一定量的二甲基二硫和农业上可接受的载体。该容器具有整体或分离式的洒施机，用于将容器里的物质施加到希望的目标区域，如喷洒或类似的。该应用可以是本领域已知的任何合适的装置，如喷雾器，泵式喷雾器，喷雾嘴或类似物。如上所述，用于该组合物、制造的产品以及用于这里所述的方法的(“至少一种”)挥发性化合物可以包括表1和表2中所述的一种或多种化合物。在一种实施方案中，挥发性化合物可以选自硫化氢、甲硫醇、二氧化硫、二甲基硫醚(DMS)、二甲基二硫(DMDS)、3-甲硫基丙醛和二甲基三硫(DTS)以及它们的组合。在一个特殊的实施方案中，挥发性化合物包括二甲基二硫。在一个可替代的实施方案中，挥发性化合物可以替换为或者可以额外包括表4中所述的一种或多种组分。在另一个可替代的实施方案中，挥发性化合物可以替换为或者可以额外包括选自二甲基二硫、乙基甲基二硫、二乙基二硫、甲基丙基二硫、乙基丙基二硫、二丙基二硫、丙烯基丙基二硫和甲基2-丙烯基二硫其中之一的二硫化物。在这里所述的组合物中，一种或多种挥发性化合物可以以能获得希望的效果如驱逐或杀死柑橘青果病的传播介体通常是昆虫传播介体的有效量提供。例如，当挥发性化合物是二甲基二硫时，二甲基二硫可以以其合适的农业上可接受的载体如矿物油形式提供，浓度为2μg/ml(重量/体积)到8μg/ml，在一种实施方案中，浓度为4μg/ml(重量/体积)到5μg/ml。本发明的另一个方面，本发明的挥发性含硫或不含硫化合物可以按需要配制并放入任何合适的装置应用于目标作物附近。例如，可以在一定压力下将挥发性含硫或不含硫化合物置于计量设备中。本发明的另一个方面，向目标植物施加杀虫剂组合物可以通过向植物喷洒该组合物，而在一个实施方案中，可以控制性的释放该组合物。作为替代，也可以使用任何其他施加组合物的方法。通常，理想的是将组合物施加到植物顶部和下部的叶子上以及植物的干和根部系统周围的区域。给目标植物施加的组合物以能预防或实质上能减少昆虫数量所必需的量为宜。在任何特定地点所施加的组合物的量根据许多因素如作物的种类、虫害的程度等而变化。另外，组合物可以单独使用或与本领域已知的其他杀虫剂联合使用。当与本领域已知的其他杀虫剂联合使用时，本发明的组合物能改善其他杀虫剂的性能，因此起了佐剂的作用。还可以降低使用费用和频率并治疗柑橘青果病感染。这里所描述的方法、组合物和制造的产品适合应用在任何感染了或可能感染柑橘青果病的树木和植物上。典型的植物包括柑橘属的任何栽培品种，包括但不限于甜橙(Citrussinensis)、梓檬(C.limon)、青梓(C.latifolia)、葡萄柚(C.paradisi)、酸橙(C.aurantium)禾口区瓦相(C.reticulata)。另外，本发明的杀虫剂组合物通常制成适合于按照常规方法配制农业/园艺杀虫剂的配方。即，表1或表2中的化合物可以与适合的农业上可接受的载体混合，如果需要，可以与助剂以合适的比例混合，合成的混合物受到溶解、分离、悬浮、混合、浸渍、吸附或黏着处理并且可以配制成实际应用中的任何希望的形式，如可溶液剂、乳油、可湿性粉剂、水溶性粉剂、水分散性粒剂、水溶性粒剂、悬浮剂、浓乳剂、悬乳剂、微乳剂、粉剂、颗粒剂、片剂和乳胶剂。“农业上可接受的载体”意思是对这里所描述的活性成分(挥发性化合物)的活性以及目标作物没有实质性有害效果的药剂。农业上可接受的载体可以是固体、液体或气体。可用作固体载体的材料的例子包括豆粉，谷粉，木粉，树皮粉，锯木粉，烟草茎粉，胡桃壳粉，麸皮，纤维素粉末，植物提取后的残渣，合成聚合物如合成树脂粉末，黏土(如高岭土、膨润土或酸性白黏土)，滑石粉(如滑石粉或叶蜡石)，硅石(例如硅藻土、硅石粉末)，云母，活性碳，硫粉末，浮石，焙烧硅藻土，砖粉末，飞尘，沙子，无机矿物粉末如碳酸钙和磷酸钙，化学肥料如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素和氯化铵，以及混合肥料。适合的液体载体可以是有溶解能力的或是没有溶解能力但能帮助活性成分化合物分散的材料。液体载体的例子包括水，醇(如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇和乙二醇)；酮(如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基甲酮、二异丁基甲酮和环己酮)；醚(如二乙醚、二氧六环、溶纤剂、二异丙醚和四氢呋喃)；脂肪烃(如煤油和矿物油)；芳烃(如苯、甲苯、二甲苯、石脑油溶剂和烷基萘)；卤代烃(如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳和氯苯)；酯(如乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二辛酯)；酰胺(如二甲基甲酰胺、二乙基甲酰胺和二甲基乙酰胺)；以及腈(如乙腈)。在一个特殊的实施方案中，农业上可接受的载体包括农业上可接受的载体油，包括但不限于矿物油或植物油如芥花籽油、葵花籽油、棉花籽油、棕榈油、豆油以及类似物。在另一个特殊的实施方案中，矿物油为农业上可接受的载体。当组合物作为气雾剂使用时，可以添加推进剂如丙烷、丁烷、异丁烷、二甲醚、二氧化碳、一氧化二氮、氮气以及它们的组合。另外，应当理解的是本发明的组合物还可以额外包括任何合适的表面活性剂、渗透剂、扩散剂、增稠剂、防冻剂、粘合剂、防结块剂、崩解剂、防沫剂、防腐剂、稳定剂和类似物。实施例1(叶子样本)采摘番石榴(PsidiumguajavaL.；桃金娘科)，甜橙(CitrussinensisL.芸香科)的两个栽培品种(哈姆林和瓦伦西亚)，RayRuby葡萄柚(C.paradisiMacf.)和粗柠檬(C.IimonBurm.)的叶幼芽，在MettlerAE160电子天平(瑞士Greifensee)上称重并立即放入隔膜密封的玻璃小瓶里。放入小瓶内的每种植物的叶子大约3.5克，并在室温平衡约30分钟。番石榴(Psidiumguajava)和粗柠檬(C.Iimon)于2007年分别从佛罗里达州湖泊地区CeeJay养殖场和佛罗里达州LakeAlfred的柑橘研究和教育中心(CREC)处获得，并且从那时起它们的树苗一直在屏幕房内。甜橙(C.sinensis)和葡萄柚(C.paradisi)的树苗于2007年从佛罗里达州Dundee的南方柑橘养殖公司获得。之所以选择这些柑橘栽培品种进行分析是因为哈姆林橙和瓦伦西亚橙以及RayRuby葡萄柚在佛罗里达州的柑橘品种中种植量最高00)。实施例2(SPME顶部空间取样)手动将50/30μm二乙烯基苯/Carboxen/聚二甲基硅氧烷(DVB/Carboxen/PDMS)StableFlex固相微萃取(SPME)纤维头(Supelco公司，宾西法尼亚州Bellefonte)插入用隔膜密封的40mL玻璃小瓶里约1分钟(GC-PFPD)或15分钟(GC-MS)，收集从未粉碎的番石榴或柑橘叶幼芽散发出的静态顶部空间挥发物，其中在收集之前番石榴或柑橘叶幼芽已经平衡达到室温环境条件。之后，打开小瓶，将叶子样本粉碎并快速封闭小瓶从而使挥发物损失最小化。随后，小瓶被封闭(O分钟)后立即将固相微萃取纤维头再次暴露于小瓶内的静态挥发物中。经过10分钟、30分钟和60分钟后对小瓶取样，以研究粉碎后的叶子产生的挥发物的动力学。挥发物收集后，将饱含挥发物的纤维头导入GC-PFPD或GC-MS的注射器并在200°C(对于观-5柱)和240°C(对于DB-wax柱)脱附约5分钟(见下面实施例3对使用的色谱柱的讨论)。实施例3(气相色谱GC-脉冲火焰光度检测器，PFPD)用脉冲火焰光度检测器(PFPD)(型号5380，德克萨斯州Mation大学OIAnalytical公司)设置为硫模式并与HP-5890SeriesII气相色谱分离联机，对含硫化合物进行分析。用三种不同的毛细管柱来完成实验性的鉴定(a)^_5(30mX0.32mm.i.d.XO.5μπι,(ZebronΖΒ-5,Phenomenex公司，加利福尼亚州托兰斯市)；(b)DB-wax(30mX0.32mm.i.d.XO.5ym,J&W科学公司；加利福尼亚州福尔松市)；和(c)GasProPLOT毛细管柱(30mX0.32mm.i.d.，Agilent技术公司，加利福尼亚州PaloAlto)。ΖΒ-5毛细管柱炉温程序升温从40°C到265°C，DB-wax毛细管柱炉温程序升温从40°C到240°C，升温速度为7°C/min,并在最大温度保持5分钟。用氦气作为载气，流速1.5mL/min。注射器和检测器的温度分别为200°C和250°C。使用0.75mm注射器衬里以改善峰的形状和色谱能效。进样方式为不分流进样。含硫挥发物的定性通过用极性柱和非极性柱上的线性保留指数(LRI)值与权威标准进行匹配来确定。线性保留指数值是基于与感兴趣化学物相同的色谱柱上测量的正构烷烃标准的保留时间。线性保留指数值仅取决于所用的固定相的类型(如聚甲基硅氧烷，wax等)，而与色谱柱的维度无关。实施例4(气相色谱-质谱GC-MS)用装有TurboMass软件的PerkinElmerClarus500四极质谱仪(PerkinElmerLas公司，康涅狄格州Shelton市)和RTX-5毛细管柱(Restek公司，宾西法尼亚州Bellafonte)(60mXO.25mm.i.d.XO.50μm)进行分析。用氦气作载气，流量恒定在2mL/min模式。源温度保持在20(TC，接口传输线温度和注射器温度保持在沈01。炉温程序以7°C/min的线性变化率从40°C升高到^0°C。使用正离子模式下的电子轰击离子化(70eV)，或者对质量范围25-300m/z进行扫描或者获得选定离子模式下的数据。通过比对OTST20052.0版标准谱(NIST，马里兰州feiithersburg)进行质谱匹配。只有谱匹配值等于或大于800且LRI值合适的那些化合物才可以被认为是正确定性。如果可能，使用权威标准进行确认。实施例5(对含硫挥发物进行鉴定)如下面表1所示，七种确定的番石榴叶含硫挥发物的初步定性是基于对三种不同色谱柱的标准化的保留指数值与权威标准进行比对。这些数值用仅对检测含硫挥发物有高选择性的脉冲火焰光度检测器获得。对于一些色谱柱类型，含硫挥发物产生的区别不足以提供明确的定性。而当使用所有三种色谱柱的线性保留指数时，这些值结果唯一则被认为是明确的定性。即便对于一些色谱柱相对洗脱顺序不相同，例如3-甲硫基丙醛和二甲基三硫用观-5柱和DB-wax柱分离。这就对于按照峰进行定性提供了额外的唯一信息。另一方面，在所有三种色谱系统中第一个峰都是硫化氢。虽然在观_5柱上硫化氢的保留时间与甲硫醇非常接近，但它在wax柱和PLOT柱上都能很好的溶解。另外，甲硫醇在PLOT柱上不溶解，不能与二氧化硫分离，在观_5柱上仅微溶，但它在wax柱上能很好的溶解。3-甲硫基丙醛和二甲基三硫在PLOT柱上得不到数值，因为它们滞留太高，它们也达不到观_5柱的要求，而wax柱上的线性保留指数值足以提供令人满意的定性结果。表1-番石榴的含硫挥发物在三种不同柱上的线性保留指数(LRI)值。用星号(*)表示的含硫挥发物是只在番石榴碎叶中观察到的。表权利要求1.一种驱逐或杀死柑橘青果病传播介体的方法，包括使传播介体暴露在有效量的表ι和表2中所列的至少一种挥发性化合物中，以驱逐或杀死柑橘青果病的至少一种传播介体。2.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种挥发性化合物选自硫化氢、甲硫醇、二氧化硫、二甲基硫醚(DMS)、二甲基二硫(DMDS)、3_甲硫基丙醛和二甲基三硫(DMTS)以及它们的组合。3.根据权利要求2所述的方法，其中至少一种挥发性化合物包括二甲基二硫。4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括从番石榴(PsidiumguajavaL.)粉碎的叶子中获取至少一种挥发性化合物。5.一种治疗感染了柑橘青果病传播介体的柑橘植物的方法，包括对柑橘植物或柑橘植物周围区域给药有效量的表1和表2中所列的至少一种挥发性化合物，以驱逐或杀死柑橘青果病的至少一种传播介体。6.根据权利要求5所述的方法，其中至少一种挥发性化合物选自硫化氢、甲硫醇、二氧化硫、二甲基硫醚(DMS)、二甲基二硫(DMDS)、3_甲硫基丙醛和二甲基三硫(DMTS)以及它们的组合。7.根据权利要求6所述的方法，其中至少一种挥发性化合物包括二甲基二硫。8.根据权利要求5所述的方法，进一步包括从番石榴(PsidiumguajavaL.)粉碎的叶子中获取至少一种挥发性化合物。9.一种给予、增加或提高用于驱逐携带柑橘青果病的传播介体的组合物的驱虫效果的方法，包括向组合物中加入表1和表2中所列的至少一种挥发性化合物，所述挥发性化合物的加入量为能驱逐或杀死携带柑橘青果病的至少一种传播介体的有效量。10.根据权利要求9所述的方法，其中至少一种挥发性化合物选自硫化氢、甲硫醇、二氧化硫、二甲基硫醚(DMS)、二甲基二硫(DMDS)、3_甲硫基丙醛和二甲基三硫(DMTS)以及它们的组合。11.根据权利要求10所述的方法，其中至少一种化合物包括二甲基二硫。12.根据权利要求10所述的方法，进一步包括从番石榴(PsidiumguajavaL.)粉碎的叶子中获取至少一种挥发性的含硫或不含硫的组分。13.一种杀虫剂组合物，包括表1和表2中所列的至少一种挥发性化合物，所述挥发性化合物的量为能驱逐或杀死柑橘青果病的至少一种传播介体的有效量；和农业上可接受的载体。14.根据权利要求13所述的组合物，其中至少一种挥发性化合物选自硫化氢、甲硫醇、二氧化硫、二甲基硫醚(DMS)、二甲基二硫(DMDS)、3_甲硫基丙醛和二甲基三硫(DMTS)以及它们的组合。15.根据权利要求14所述的组合物，其中至少一种挥发性化合物包括二甲基二硫，其中农业上可接受的载体是矿物油。16.根据权利要求14所述的组合物，其中二甲基二硫在农业上可接受的载体中的浓度为2μg/ml-8μg/ml(重量/体积)。17.—种驱逐或杀死柑橘青果病传播介体的方法，包括使传播介体暴露在有效量的二甲基二硫组合物中，以驱逐或杀死柑橘青果病的至少一种传播介体。18.根据权利要求16所述的方法，其中二甲基二硫组合物进一步包括农业上可接受的载体油，其中二甲基二硫在农业上可接受的载体油中的浓度为2μg/ml-8μg/ml(重量/体积)。19.一种制造的产品，包括能驱逐或杀死柑橘青果病至少一种传播介体的有效量的二甲基二硫；二甲基二硫农业上可接受的载体；一种容器，其包括一定量的二甲基二硫和农业上可接受的载体；以及将容器里的二甲基二硫和农业上可接受的载体施加到目标区域的装置。20.根据权利要求19所述的制造的产品，其中二甲基二硫组合物进一步包括农业上可接受的载体油，其中二甲基二硫在农业上可接受的载体油中的浓度为2μg/ml-8μg/ml。全文摘要本发明涉及预防柑橘青果病的方法和组合物。在一种实施方案中，提供了一种驱逐或杀死柑橘青果病昆虫传播介体的方法，包括使传播介体暴露在有效量的表1和表2中所列的至少一种挥发性化合物中。在一种实施方案中，挥发性化合物是二甲基二硫。文档编号A61K31/105GK102196725SQ200980142205公开日2011年9月21日申请日期2009年8月25日优先权日2008年8月25日发明者卢卡兹·L·斯特林斯基,拉瑟尔·L·鲁塞夫申请人:佛罗里达大学研究基金会有限公司