专利名称：用于测定组合物中的TGF-β的生物活性的方法
背景技术：
(1)发明领域 本发明一般涉及测定组合物中的转化生长因子-β (TGF-β)的生物活性的方法。
发明内容
简言之，本发明涉及用于测定粉末状营养组合物或粉末状粗蛋白质(raw protein)来源的样品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括 a.让样品复溶为约140mg/mL-约150mg/mL的浓度； b.让复溶的样品以约10，OOOrpm离心约10分钟，保留上清液层； c.使上清液层酸化到pH为约2-约3 ； d.让上清液层于室温孵育约15分钟； e.让上清液层以约10，OOOrpm离心约10分钟，保留上清液层； f.将来自步骤(e)的上清液层中和到pH约7-约7. 5 ； g.让步骤(f)的上清液层以约10，OOOrpm离心约10分钟，保留上清液层； h.让上清液层与HT-2细胞接触；和 i.测定抑制50%的HT-2细胞的生物活性的浓度。
在实施方案中，本发明亦涉及用于测定液态奶样品中的TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括 a.让样品以约13，OOOrpm离心约15分钟； b.收集样品的上清液层，并用该上清液重复步骤(a)； c.收集来自步骤(b)的样品的上清液层，并用步骤(b)的上清液重复步骤(a)； d.使上清液层酸化到pH约2-约3 ； e.让上清液层于室温孵育约3小、时； f.将上清液层中和到pH约7-约7. 5 ； g.让步骤(f)的上清液层以约10，OOOrpm离心约10分钟，保留上清液层； h.让该上清液层与HT-2细胞接触；和 i.测定抑制50%的HT-2细胞的生物活性的浓度。
在另一实施方案中，本发明涉及用于测定液态奶样品中的TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括 a.使样品酸化到pH约2-约3 ； b.让样品于室温孵育约3小时； c.将样品中和到pH约7-约7. 5 ； d.让样品以约10，OOOrpm离心约5分钟，保留上清液层； e.让上清液层以约10，OOOrpm离心约5分钟，保留上清液层； f.让来自步骤(e)的上清液层与HT-2细胞接触；和
4 g.测定抑制50%的HT-2细胞的生物活性的浓度。
在又一实施方案中，本发明涉及用于测定粉末状营养组合物或粉末状粗蛋白质来源的样品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括 a.让样品复溶为约140mg/mL-约150mg/mL的浓度； b.使复溶的样品酸化到pH约2-约3 ； c.让上清液层于室温孵育约15分钟； d.让上清液层以约10，OOOrpm离心约10分钟，保留上清液层； e.中和来自步骤(d)的上清液层到pH约7-约7. 5 ； f.在1 %血清存在下让样品与MDA-MB-468细胞接触；和 g.基于GFP标记的Smad2从细胞质转运到细胞核来分析TGF- β反应。
在再一实施方案中，本发明涉及用于测定液态奶样品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括 a.使样品酸化到pH约2-约3 ； b.让样品于室温孵育约15分钟； c.让样品以约10，OOOrpm离心约10分钟，保留上清液层； d.将步骤(c)的上清液层中和到pH约7-约7. 5 ； e.在1 %血清存在下让样品与MDA-MB-468细胞接触；和 f.基于GFP标记的Smad2从细胞质转运到细胞核来分析TGF- β反应。
附图简述
图1 显示具有 TGF- β 2 活性为 7175. 3pg/mL 及 ED50 为 0. 118ng/mL 的 rhTGF- β 2 的样品的TGF-β生物活性相当量(equivalency)计算值。
图2A-D为相当量图和数据。
图3显示通过激活方法处理的Enfamil Lipil+相对于人乳的TGF-β功效。
图4A-C阐明eelIomics研究结果。
发明最佳实施方式 现在将详细谈及本发明实施方案，以下给出了其一个或多个实施例。提供每一个实施例是为了说明本发明而不是限制本发明。事实上，本领域技术人员显然明白，可对本发明实施不偏离本发明范围或精神的各种修改及改变。例如，作为一个实施方案的部分来阐明或阐述的特征可用于另一个实施方案，以产生又一个实施方案。
因此，本发明意欲涵盖所述落在所附权利要求范围内的这类修改和改变及其等同物。在以下详述中揭示或可明显看出本发明的其它目的、特征及方面。本领域普通技术人员应该理解，本发明论述仅为了说明例示性实施方案，并非意欲限制本发明的更宽广的方面。
如上所述，本发明一般涉及用于测定各种样品中TGF-β的生物活性的方法。与所述方法有关的参考资料可包括美国专利号6，194，208,7, 094，550和EP 759，029。
转化生长因子-β (TGF-β)是其成员具有多功能调节活性的多肽家族的通称。三种差异调节的哺乳动物同种型(命名为TGF-β 1、TGF-β 2和TGF-β 3)在胚胎、婴儿、儿童及成人发育的多个过程中起着重要作用。TGF-β是25-kDa的同型二聚体细胞因子，已知其既在免疫系统中又全身性地介导多效功能。TGF-β在肠粘膜的几种细胞类型(包括淋巴细胞、上皮细胞、巨噬细胞和基质细胞)以及T-细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、上皮细胞、成纤维细胞、血小板、造骨细胞、破骨细胞及其它细胞中中表达。另外，TGF-β存在于人母奶中， 可影响婴儿健康和发育的多个方面。
TGF-β以大的前体蛋白合成，后者由包含信号序列和潜伏状态相关 (latency-related)复合物的氨基末端原结构域和成熟的羧基末端亚单位组成。具生物活性的TGF-β是同型二聚体，由两个相同的二硫键连接的成熟亚基组成。要发挥TGF-β对靶细胞的生物活性，必须从潜伏状态相关复合物释放TGF-β同型二聚体。潜伏状态相关复合物的特性和负责释放TGF-β的机理是理解体内TGF-β生物活性的关键。在人肠道中， 可通过蛋白质水解酶、极端ΡΗ、热、钙和/或机械分裂来完成这一任务。
基于TGF-β提供多种益处，在各种营养品中存在或补充该生长因子通常很重要。 例如，某些营养品的蛋白质来源可提供TGF-β来源。或者，若该营养品本身不含TGF-β，则可将该生长因子补充到产品中。然而，如上所述，释放的TGF-β呈其无活性形式。营养品的蛋白质来源中存在的或加到那些营养品中的TGF-β亦呈其无活性形式。于是其在人肠道中由酶、极端PH和/或分裂来激活。
基于TGF-β提供多种益处，在各种液态营养品中存在或补充该生长因子通常很重要。然而，在本发明以前，一直没有用于测定奶、营养品或粗蛋白质来源(例如乳清蛋白浓缩物)的样品中TGF-β的生物活性的有效方法。在某种程度上，这可能是由于在报道这些组合物的TGF-β生物活性的研究之中及之间的变异性高。此外，对影响奶、营养品或粗蛋白质来源中所报道的生物活性的因素的了解相对很少。
因此，本发明要解决的技术问题是提供用于测定组合物中TGF-β (包括TGF-β 1 和TGF-i3 2)的生物活性的准确并可再现的方法。根据本发明，本发明人发现了用于测定奶、营养品或粗蛋白质来源的样品中TGF-β的生物活性的新颖方法。
如上所述，可用本发明方法来测定奶来源中TGF-β的生物活性。在该实施方案中，所述奶可为人乳、牛奶、山羊奶、绵羊奶或来源于哺乳动物的任何其它奶。
在另一实施方案中，可用本发明方法来测定营养品中的TGF-β生物活性。营养品可为婴儿配方奶粉。在某些实施方案中，所述营养品可为婴儿配方奶粉。术语“婴儿配方奶粉”适用于这样的组合物，其为液态或粉末状形式，必要时意欲作为人乳代用品(母乳代用品)使用以满足婴儿的正常营养需求。在独立的实施方案中，所述营养品可为人乳增强剂，意即其为添加到人乳中以便提高人乳的营养价值的组合物。本发明组合物作为人乳增强剂可呈粉末或液态形式。在另一实施方案中，本发明营养品可为较大婴儿及幼儿配方奶粉(follow-upformula)。本文所用术语“幼儿配方奶粉”指意欲用作6个月的婴儿及幼儿的断奶饮食的液体部分的食物。在又一实施方案中，本发明营养品可为儿童营养组合物。本文所用术语“儿童”意即超过3岁并在青春期之前的人。在再一实施方案中，本发明营养品可为成长奶(growing-upmilk)。术语“成长奶”指以奶为基础的多种多样种类的加强饮料， 其意欲用作多样化饮食的部分，以便支持1-6岁儿童的正常生长和发育。
在某些实施方案中，所述组合物为酸化产品。本文所用术语“酸化产品”指成品平衡pH为4. 6或以下并且水活性大于0. 85的营养组合物。在再一实施方案中，营养品可为医用食物。术语“医用食物”定义为调配用于在医生监督下消费或经肠道给予的食物，其意欲用于有特别营养需求的疾病或病况的特定饮食管理，所述特别营养需求基于公认的科学原理，通过医学评估确定。一般而言，被认为是医用食物的产品应该至少满足以下标准该
6产品应该为口服或管饲食物；该产品应该标示为用于有特定营养需求的特定医学病症、疾病或病况的饮食管理；和该产品应该计划在医学监督下使用。
在又一实施方案中，可用本发明方法来测定粗蛋白质来源中TGF-β的生物活性， 所述粗蛋白质来源例如乳清蛋白浓缩物、脱脂奶粉或酪蛋白蛋白质。
本发明组合物可以以本领域已知的任何形式提供，例如粉末、凝胶、混悬剂、糊状物、固体、液体、液体浓缩物或即用型产品。
在本发明方法中，用HT-2细胞生物测定来测量TGF-β 1和TGF-β 2的生物活性。 生物活性是以所测组合物的IC50值来测定。IC50值是组合物抑制一半生物功能或生物化学功能的效能的量度。在这种情况下，IC50值是抑制HT-2细胞的50%生物活性的浓度。
HT-2细胞系是由James Watson博士建立的因子依赖性克隆鼠T-辅助细胞系 (J.Exp. Med. 1979 ；150 :1510)。该生物测定测量TGF-β对细胞生长的剂量反应性抑制， 所述TGF-β剂量通常为2倍系列稀释。该生物测定测量TGF-β抑制这些业已用鼠白介素-4(mIL-4)激活的细胞的生长的活性。当与貂肺上皮细胞生长抑制(MvlLu生物测定) 比较时，该细胞生物测定业已显示具有高度再现性及准确性。证明该生物测定对皮摩尔浓度的TGF-β高度灵敏，抑制用IL-4刺激的ΗΤ-2细胞的S期进展。
在本发明之前，关于制备营养品、粗蛋白质来源或奶来源的样品用于ΗΤ-2细胞生物测定来测量TGF-β生物活性的方法尚未开发。本发明人开发了制备这些组合物并测量其中的TGF-β 1和TGF-β 2的生物活性的新颖方法。
在某些实施方案中，所述方法涉及测量未消化的粉末状营养品或粗蛋白质来源的样品中的TGF-β 1和TGF-β 2的生物活性。在该实施方案中，本发明方法可包括让营养品或粗蛋白质来源的样品在蒸馏水或磷酸缓冲盐水(PBQ中复溶至约200-约300mg/mL。在另一实施方案中，所述方法涉及让营养品或粗蛋白质来源的样品在蒸馏水或PBS中复溶为约250mg/mL。在实施方案中，复溶可包括将1克样品加到4mL蒸馏水或PBS中。
然后可使样品酸化到pH约1-约2。在实施方案中，可使样品酸化到pH约1. 5。可用本领域已知的任何酸完成酸化步骤。在特定实施方案中，所述酸可为6M HCl0样品酸的比率可为约2 0.06。因此，在一个实例中，2mL样品可用0.06mL的酸来酸化。可让样品于室温孵育约3小时，然后以13，OOOrpm离心约5分钟。
然后可收集并中和清澈的上清液层。可用本领域已知的任何碱完成中和步骤。在特定实施方案中，所述碱可为6M NaOH。可加入碱使样品pH为约7-约8。在特定实施方案中，样品pH可为约7-约7.5。样品碱的比率可为约2.6 0.05。因此，在一个实例中，2. 6mL样品可用0. 05mL的酸来酸化。样品酸碱的总比率可为1 0. 03 0. 02或 1. 05。
作为酸激活的替代方案，可过滤复溶样品。因此，在实施方案中，复溶后可让样品于室温孵育约1. 5小时。然后可让样品以约13，OOOrpm离心约5分钟。在实施方案中，可让样品以该方式离心两次。然后可收集样品的上清液，并用0. 8/0. 2 μ m过滤器过滤。
根据本发明方法，然后可对样品实施HT-2生物测定，在每一图表的第一个点以 1 5稀释，在每一图此后的9个点以2倍系列稀释。
在不同实施方案中，若样品为粉末，则可通过首先将样品复溶为约140mg/mL-约 150mg/mL，来测量营养品或粗蛋白质来源的样品中的TGF-β 1和TGF-β 2的生物活性。在一个实施方案中，可将样品复溶到约14aiig/mL。该复溶可包括将约8. 5克样品加到约2液量盎司的水中。或者，复溶可包括将约2. 84克样品加到约20mL水中。若样品为液体，则不需复溶。在一个实施方案中，PPBS可在复溶中代替水。
在该实施方案中，如下表1中所显示，由于复溶率较低TGF-β优先分级分离到复溶样品的乳清部分(占约约30%)中。如所观察到的，乳清相关TGF-β 2的量视婴儿配方奶粉的复溶率而定。
表 1.
样品重量酸姿封部分乳清部分e/o乳清部分食物样品重量食物样品重量I！ Enf. Lip 250 mg/ml(1)5.06090,60442.7234 IhbhhhbmI Enf. Lip 250 mg/ml (2)5.05620.53692.8210Enf. Lip 142 mg/ml (1)2.84630.14071.854564Enf. Lip 142 mg/ml (2)2.84080.16421.7570 在该实施方案中，然后可让样品以10，OOOrpm离心约10分钟。应该保留沉淀及顶部脂肪层。然后可将浓HCl加到上清液中使ρΗ为约2-约3。然后可让样品于室温孵育约 15分钟。再次让样品以约10，OOOrpm离心约10分钟。再次应该保留酪蛋白层(沉淀或顶层)以及乳清(上清液)部分。可用50% NaOH中和上清液层使其ρΗ为约7-约7. 5。然后可让上清液再次以约10，OOOrpm离心约10分钟。然后可将沉淀及上清液部分冻干。用水将冻干粉复溶为浓度500mg/ml用于HT-2细胞生物测定。
在另一实施方案中，本发明方法包括测量未消化奶样品中的TGF-β 1和TGF-β 2 的生物活性。在该实施例中，可让样品以约13，OOOrpm离心约15分钟三次。然后样品可用 IN HCl (125 μ L样品/25 μ L 1NHC1)激活，并于室温孵育约3小时。然后可用1. N NaOH中和样品(125 μ L样品/25 μ L IN NaOH)。然后用2倍稀释的样品实施ΗΤ-2生物测定。
在备选实施方案中，可通过首先用IN HCl将样品激活(125 μ L样品/25 μ L IN HCl)并于室温孵育约3小时，来制备用于ΗΤ-2生物测定的未消化奶样品。然后可让样品以约13，OOOrpm离心约5分钟。可收集上清液并以约13，OOOrpm离心约5分钟。然后可用 IN NaOH中和样品(125 μ L样品/25 μ L IN NaOH)。然后可用2倍稀释的样品实施ΗΤ-2生物测定。
在本发明另一实施方案中，所述方法可包括测量消化的营养品、粗蛋白质来源或奶的样品中TGF-β 1和TGF-β 2的生物活性。在所述实施方案中，样品若冻干则可让样品于室温融化。可测定样品ΡΗ，然后调整为ρΗ约6. 7-约6. 8。然后可让样品以13，OOOrpm 离心约5分钟。在实施方案中，可让样品以该方式离心两次。然后可收集上清液层，并以2 倍稀释实施ΗΤ-2生物测定。
在实施ΗΤ-2生物测定时，方案如下。ΗΤ-2细胞应该处于对数生长期。然后可用测定培养基将标准品及样品稀释到工作浓度。可将大约50 μ L测定培养基加到96孔板的每一孔中。然后可将标准品及样品加到每板中。可向第一孔中加入25yL，此后以2倍系列稀释。最后一孔可作为空白，可仅加入稀释用培养基。可让样品一式二份进行测量。
在接下来的步骤中，可将测定培养基以大约25 μ L/孔的量加到各孔中。然后可收获HT-2细胞，并用RPMI洗涤3次。然后可让细胞以虹IO5个细胞/mL悬浮在测定培养基中。可将大约25 μ L的细胞加到对照孔(无IL-4的孔)中。然后可在将25yL细胞加到其余孔之前将IL-4以约30ng/mL加到剩余的细胞悬浮液中。
然后可让细胞在潮湿小室中于约37°C、5% CO2孵育约48小时。在孵育的最后 4-6小时期间，可将大约10μ L的0. lmg/mL刃天青(Resazurin)加到各孔中。孵育后可以 560nmm激发波长和590nm发射波长测定荧光强度。
可用rhTGF-β生物活性作图计算TGF-β生物活性相当量。在实施例中，在图1所示的产生的图中计算具有7175. 3pg/mL的TGF- β 2活性和0. 118ng/mL的ED5tl的rhTGF- β 2 的样品的TGF-β生物活性相当量。可从rhTGF-β 2的ED5tl(在本实施例中为0. 118ng/mL) 开始向上做垂线(1)。可从rhTGF-β 2线与所述垂线交点开始作水平线(2)。然后可从水平线O)与样品线交点作垂线(3)。基于垂线(3)与χ-轴交点确定稀释因子。如图1所示， 在本案例中稀释因子为0. 0048。用该稀释因子及0. 118ng/mL的ED5tl，可计算样品相当量 (0. 118/0. 0048 = 24. 583ng/mL或24583pg/mL)。为了产生相当量图，可用计算的活性相当量(pg/mL)对通过ELISA测量的样品浓度(pg/mL)作图。相当量图和数据示于图2A-D中。
在本发明单个实施方案中，可用cellomics生物测定来测量TGF-β生物活性。 TGF-β通过提供丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞表面受体将信号传导到称为Smad的细胞内信号传导组分，进而调节细胞核中的靶基因的活性。可将Smad分为3类受体激活的 Smad (Smad 1、2、3、5、8)、通用或中介 Smad (Smad 4)和抑制性 Smad (Smad 6 禾Π 7)。Smad 2 和 3由TGF-β本身激活，而Smad 1和5由转化生长因子超家族的其它成员激活。生物信号传导是个复杂的过程，涉及多种信号传导分子的激活及转运。大部分信号传导事件涉及多种互相作用的组分，在很多情况下，激活与靶分子从细胞的一个位置到另一位置的移动偶联， 在该过程中传导生物信号。
本发明方法中使用的cellomics仪器可为本领域已知的任何仪器。在一个实施方案中，仪器为 Thermo Scientific Cellomics MolecularTranslocation Bioapplication。 一般而言，cellomics生物测定提供以完全自动方式定量测定单个细胞内荧光标记的靶分子在细胞内移动的能力。更具体地讲，cellomics提供用于通过监测细胞质和细胞核之间的移动来分析转录因子和激酶激活的极为有效的方法。
设计了用于TGF-β 1-诱导的Smad2转运的抑制剂的本文所述Smad重分配测定， 其通过监测GFP-Smad2融合蛋白从细胞质转运到细胞核来实现。TGF-β 1用作参考激动剂， 测定化合物的抑制TGF-β 1-刺激的Smad2核转运的能力。然而，先前尚未采用标准Smad cellomics研究来测量奶、营养品或粗蛋白质来源样品中TGF-β的生物活性。在本发明中， 本发明人开发了这一方法。
在所述方法的第一步中，可用水或PBS让粉末状样品复溶为浓度8. 5g/l f 1. oz或 0. 284g/mL0在另一实施方案中，可让粉末状样品复溶为浓度约14aiig/mL。对于液体例如奶不需复溶，样品可原样使用。工作体积可为lml。
然后可通过加入酸例如浓HCl达到pH约2-约3来激活TGF- β。对于复溶的粉末状营养品，HCl量可为约13 μ L-约16 μ L0对于奶，HCl量可为约4 μ L-约5 μ L。
然后所有样品都可于室温孵育15分钟。然后可让样品以10，OOOrpm离心约10分钟。可保留酪蛋白(沉淀或顶层)和乳清(上清液)部分。
然后可用碱例如50% NaOH中和乳清部分/上清液以达到pH约7_约7. 5。对于营养品，NaOH的量可为约4 μ L-约8 μ L。对于奶，NaOH的量可为约1 μ L-约2 μ L。
然后可按照MDA-MB-468细胞的Smad2生物测定的cellomics方案将样品加到细胞中。该方案如下所述。让细胞在血清存在下与含有TGF-β的样品接触90分钟。固定后在Cellomics ArrayScan VTI上分析细胞。基于GFP标记的Smad2从细胞质转运到细胞核来计算TGF-β反应。
以下实施例阐述本发明不同实施方案。通过参考本文揭示的本发明说明书或本发明的实施，本领域技术人员显然明了本文权利要求范围内的其它实施方案。应该将说明书连同实施例仅看作是例示，本发明范围及精神由权利要求所指示。在实施例中，除非另外指出，否则给出的所有百分比皆基于重量。
实施例1 本实施例阐明经由用ΗΤ-2细胞的生物测定来测量TGF- β的生物活性。从 P. Marrak 博士实验室获得 ΗΤ-2 亚克隆(Kappler，J. W.等，J. Exp. Med. 153 1198-214(1981))。该亚系无可检测的辅助细胞活性。细胞处于对数生长期。
细胞生长和制备 材料 HT-2 细胞 生长培养基 1. RPMI 1640 2. 10% FBS (JRH # :12107-1000M) 3. 50uM β-巯基乙醇 4. 2mML谷氨酰胺 5. 10ng/mL rhIL-2 细胞维持方案 将细胞以h IO4个细胞/mL接种于生长培养基中。
每2-3天给细胞传代一次。
样品制备 从供者获得人乳样品。通过让125μ L样品与25μ L IN HCl混合来激活样品。然后让样品于室温孵育约3小时。然后让样品以13，OOOrpm离心5分钟。收集上清液，并以约13，OOOrpm离心约5分钟。然后用1. 2Ν NaOH(125 μ L样品/25 μ L IN NaOH)中和样品。
ΗΤ-2生物测定 材料 ΗΤ-2 细胞 测定培养基 1. RPMI 1640 2. 10% FBS(JRH# 12107—1000M) 3. 50uM β-巯基乙醇 4. 2mML谷氨酰胺 rmIL-4 Dulbecco' s PB S (Irvine#9240)
10 BSA(Sigma#A-7888) 刃天青(R&DCatalog#AR002) 用于激活潜伏状态TGF β 冰乙酸(来自Mallinckrodt Baker) TGF-β生物测定方案 1.用测定培养基将标准品和样品稀释为工作浓度 i.将50 μ L测定培养基加到96孔板的各孔中。
ii.然后将标准品和样品加到板中。
1.将25μ L样品加到第一孔中，从此处开始3倍系列稀释。
2.最后一孔仅含稀释用培养基(空白)。
3.样品一式二份进行。
iii.所有孔中加入25uL/孔的测定培养基。
2.然后收获HT-2细胞，用RPMI洗涤3次。
3.将细胞以4xl05个细胞/mL悬浮在测定培养基中。
4.将25 μ L细胞加到对照孔(无IL_4的孔)中。在将25 μ L细胞加到其余孔之前向剩余细胞悬浮液中加入30ng/mL的mIL_4。
5.让板在潮湿小室中于37°C、5% CO2孵育48小时。
6.在孵育的最后4-6小时期间向每孔中加入10 μ L的0. lmg/mL刃天青。
7.孵育结束时，用560nm激发波长和590nm的发射波长测量荧光强度。
同时制备同样的人乳样品，用标准HT-2细胞生物测定技术检测。图3阐明用两种不同的激活程序处理的人乳样品的生物活性差异。图3阐明用本发明方法制备(“改良激活")的人乳样品与按照标准程序制备(“标准激活")的人乳样品相比具有5倍的生物活性。因此，显然本发明方法提供了对TGF-β生物活性的令人惊讶的出乎意料之外的增强。
实施例2 本实施例阐明本发明测量TGF-β生物活性的cellomics方法。
在本实施例中使用以下样品 婴儿配方奶粉 i.21g 干奶粉 ii. TGF-β 2 浓度 0. 05ppm 含TGF-β 2的奶蛋白部分 i. 11.5g 干奶粉 ii. TGF-β 2 浓度 0. 9ppm 样品制备 用水将样品复溶为0. 142g/ml。然后让样品以10，OOOrpm离心10分钟。保留沉淀和溶液顶部的脂肪层。通过加入浓HCl直到pH为2-3来激活TGF-β。然后让样品于室温孵育15分钟。孵育后让样品以10，OOOrpm离心10分钟。保留酪蛋白(沉淀或顶层)和乳清(上清液)部分。用50% NaOH中和乳清部分/上清液直到ρΗ为7-7. 5。然后让样品以 10，OOOrpm离心10分钟。
纯化的重组人TGF-β 2购自Sigma(货号Τ4815)，按照厂商说明书来溶解及储存。
样品从0. 071g/ml (最终测定浓度)开始、重组人TGF- β 2从lOng/ml (最终测定浓度)开始，在9点半log对数浓度反应中作出所有化合物的曲线。相对于同一块板的阴性对照和阳性对照来计算化合物活性。
表2.板图
权利要求
1.用于测定粉末状营养组合物或粉末状粗蛋白质来源的样品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括a.让所述样品复溶为约140mg/mL-约150mg/mL的浓度；b.让所述复溶样品以约10，OOOrpm离心约10分钟，并保留上清液层；c.使所述上清液层酸化到pH约2-约3；d.让所述上清液层于室温孵育约15分钟；e.让所述上清液层以约10，OOOrpm离心约10分钟，并保留上清液层；f.将来自步骤(e)的上清液层中和到pH约7-约7.5;g.让步骤(f)的上清液层以约10，OOOrpm离心约10分钟，并保留上清液层；h.让所述上清液层与HT-2细胞接触；和i.测定抑制50%的HT-2细胞的生物活性的浓度。
2.权利要求1的方法，其中所述营养组合物选自营养增补剂、儿童营养品、婴儿配方奶粉和人乳增强剂。
3.权利要求1的方法，其中所述酸化步骤包括加入浓HCl。
4.权利要求1的方法，其中所述中和步骤包括加入50%NaOH。
5.用于测定液态奶样品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括a.让所述样品以约13，OOOrpm离心约15分钟；b.收集所述样品的上清液层并用所述上清液重复步骤(a)；c.收集来自步骤(b)样品的上清液层并用来自步骤(b)的该上清液重复步骤(a)；d.使所述上清液层酸化到pH约2-约3；e.让所述上清液层于室温孵育约3小时；f.将所述上清液层中和到PH约7-约7.5 ；g.让步骤(f)的上清液层以约10，OOOrpm离心约10分钟，并保留上清液层；h.让所述上清液层与HT-2细胞接触；和i.测定抑制50%的HT-2细胞的生物活性的浓度。
6.权利要求5的方法，其中所述酸化步骤包括将约25μ L IN HCl加到约125 μ L样品中。
7.权利要求5的方法，其中所述中和步骤包括将约25μ L INNaOH加到约125 μ L样品中。
8.用于测定液态奶样品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括a.使所述样品酸化到pH约2-约3；b.让所述样品于室温孵育约3小时；c.将所述样品中和到pH约7-约7.5 ；d.让所述样品以约10，OOOrpm离心约5分钟，并保留上清液层；e.让所述上清液层以约10，OOOrpm离心约5分钟，并保留上清液层；f.让来自步骤(e)的上清液层与HT-2细胞接触；和g.测定抑制50%的HT-2细胞的生物活性的浓度。
9.用于测定粉末状营养组合物或粉末状粗蛋白质来源的样品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括a.让所述样品复溶为约140mg/mL-约150mg/mL的浓度；b.使所述复溶的样品酸化到pH约2-约3；c.让所述上清液层于室温孵育约15分钟；d.让所述上清液层以约10，OOOrpm离心约10分钟，并保留上清液层；e.中和来自步骤⑷的上清液层到pH约7-约7.5;f.在血清存在下让所述样品与MDA-MB-468细胞接触；和g.基于GFP标记的Smad2从细胞质转运到细胞核来分析TGF-β反应。
10.权利要求9的方法，其中所述酸化步骤包括将约13μ L-约16 μ L的HCl加到约ImL 样品中。
11.权利要求9的方法，其中所述中和步骤包括将约4μ L-约8 μ L的NaOH加到约ImL 样品中。
12.用于测定液态奶样品中TGF-β的生物活性的方法，所述方法包括a.使所述样品酸化到pH约2-约3；b.让所述样品于室温孵育约15分钟；c.让所述样品以约10，OOOrpm离心约10分钟，并保留上清液层；d.将步骤(c)的上清液层中和到pH约7-约7.5 ；e.在血清存在下让所述样品与MDA-MB-468细胞接触；和f.基于GFP标记的Smad2从细胞质转运到细胞核来分析TGF-β反应。
13.权利要求12的方法，其中所述酸化步骤包括将约4μ L-约5 μ L的HCl加到约ImL 样品中。
14.权利要求12的方法，其中所述中和步骤包括将约1μ L-约2 μ L的NaOH加到约ImL 样品中。
全文摘要
本发明提供用于测定奶、粗蛋白质来源或营养组合物样品中TGF-β的生物活性的新颖方法。所述方法包括特别的复溶步骤、离心步骤、孵育步骤和激活步骤。可在HT-2细胞生物测定或cellomics生物测定中测量样品中的TGF-β的生物活性。
文档编号A61K38/00GK102186492SQ200980142165
公开日2011年9月14日 申请日期2009年10月23日 优先权日2008年10月24日
发明者G·P·赖, F·J·罗塞尔斯, Z·E·朱尼, R·瓦沃伦图 申请人:美赞臣营养品公司