专利名称：用于光动力消毒的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于革兰氏阴性生物的光动力消毒的光敏剂组合物。更特别地，本发明涉及下述光敏剂组合物，其被用于光动力消毒时，由于光敏剂和一种或多种对羟基苯甲酸酯类之间的协同抗微生物作用而对特定的革兰氏阴性生物具有显著加强的抗微生物效力。
背景技术：
光动力消毒(PDD)已被证实是有效的体外非抗生素抗微生物途径。PDD作为抗微生物处理形式的一个示例性优点是，由于其非特异性的杀菌机制，其典型地没有遭受可能影响抗生素使用的抗性问题。另一示例性优点是，PDD可以被用作局部外用处理，其可以被施用于持续的外用抗生素递送会造成问题的区域(例如口腔或鼻腔)中。出于这些原因以及其它原因，PDD很快成为细菌相关病况(例如牙周病)的治疗中一种有价值的工具。基本上，PDD涉及使用光能来活化光敏剂组合物的一种或多种光敏剂，从而这些光敏剂能够随后与底物/靶标直接相互作用(I型反应)，或者能与分子氧相互作用，生产单线态氧和其它活性氧类别(II型反应)。这些反应主要通过脂质过氧化、膜损伤和细胞内组件的损伤，来介导微生物细胞的非特异性杀伤。为了用所述方法杀伤和/或减少微生物，典型地，将光敏剂内化进此类微生物的细胞外膜中，或使光敏剂与此类微生物的细胞外膜非常密切地接近，是人们期望的。对羟基苯甲酸的酯通常被称作对羟基苯甲酸酯类(paraben)，它们是化妆品和药物配制物中最常用的防腐剂。它们提供了下述优点广谱抗微生物活性、在宽PH范围内有效、低毒性和低致敏可能性。另外，这些化合物是相对无味、无色和高度稳定的。对羟基苯甲酸酯类典型地对真菌和革兰氏阳性细菌最为有效。对羟基苯甲酸酯类如对羟基苯甲酸甲酯(甲基-4-羟基苯甲酸酯)和对羟基苯甲酸丙酯(丙基-4-羟基苯甲酸酯)的组合提供了比个别对羟基苯甲酸酯类更好的防腐活性和提高的溶解度，并且这些组合是商业产品中常用的。对羟基苯甲酸酯类抗微生物作用的机制刚刚开始被全面了解，已提出了关于若干种过程的证据。Furr和Russell检测了 krratia marcescens被暴露于对羟基苯甲酸酯类时RNA的细胞内渗漏，表明细胞膜转运进程的破坏(见J.R. Furr and A. D.Russell, Factors influencing the activity of esters of p-hydroxybenzoic acid on Serratia marcescens，Microbios，1972)。Freese, et al.测定了对羟基苯甲酸酯类受到膜转运和电子转运系统二者的干扰(见 E.Freese，C.W.Sheu and Ε. Galliers, Function of lipophilic acids as antimicrobial food additives, Nature,1973,241 :321-325)。Eklund发现对羟基苯甲酸酯类消除了细胞质膜的pH改变，但是没有破坏质子动力势(proton motive force)的膜电势组分。他随后得出结论质子动力势的中和以及随后的转运抑制可能不是唯一的抑制机制(见T. J.mdund，The effect of sorbic acid and esters of p-hydroxybenzoic acid on the protonmotive force in Escherichia coli membrane vesicles, Gen Microbiol 1985,131 :73-6)。
Panicker使用膜系统模型——二棕榈酰基磷脂酸跑囊(dipalmitoyl phosphatidic acid vesicles)进行的工作揭示了对羟基苯甲酸丙酯与脂质膜的浓度依赖性相互作用。在低浓度下，对羟基苯甲酸丙酯通过与细胞壁相互作用，允许朝向靶受体的被动跨膜扩散而改变膜功能。在高浓度下，对羟基苯甲酸丙酯与脂质组分相互作用，使得细胞壁更加坚硬。这进而改变了膜半渗透性并由此改变了膜功能(见L. PanickenEffect of propyl paraben on the dipalmitoyl phosphatidic acid vesicles, J Colloid Interface Science,2007，311 :407-416)。Bredin, et al.报道了将E. coli暴露于对羟基苯甲酸丙酯时诱导了膜的去稳定化。暴露后，钾以类似于外部膜透化作用的多粘菌素B诱导的方式被释放。另外，该外向通量依赖于孑L蛋白通道活性(见 J. Bredin,A. Davin-Regli and J. Μ· Pages,Propyl paraben induces potassium efflux in Escherichia coli, J Antimicrobial Chemo. 2005,55 1013-1015)。Nguyen, et al.展示了对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯与大电导和小电导的机械敏感通道(mechanosensitive channel)相互作用，由此破坏E. coli中的渗透梯度(JAL T. Nguyen, B. Clare, W. Guo and B. Martinac, The effects of parabens on the mechanosensitive channels of E. coli, Eur Biophys J. ,2005,34(5) :389_95)。最后，除了膜破坏机制以外，Ma, et al.还显示对羟基苯甲酸酯类是细菌酶系统的高度有效的抑制剂。例如，在Mi^ptococcus mutans中F-ATPases被可逆地抑制，但是用于葡萄糖摄取和磷酸化的磷酸丙酮酸磷酸转移酶系统的膜蛋白(酶II)被不可逆地抑制(见 Y. Ma, and R. Ε. Marquis, Irreversible paraben inhibition of glycolysis by Streptococcus mutans GS-5, Lett Appl Microbiol,1996, 23 :329-33)。
发明内容
本发明提供了包含光敏剂和至少一种对羟基苯甲酸酯类的组合物，以提供针对特定的革兰氏阴性生物的协同抗微生物效应。针对特定革兰氏阴性生物的该协同抗微生物效应(在下文中被称作“对羟基苯甲酸酯类加强作用”(paraben potentiation))在本申请文件下文中被定义和讨论。优选地，所述组合物还包含药物可接受的载体。本发明还提供了用于光动力消毒的方法，所述方法包括向位于目标处理区域内的革兰氏阴性生物应用包含光敏剂和至少一种对羟基苯甲酸酯类的组合物，其中所述革兰氏阴性生物对于对羟基苯甲酸酯类加强作用而言是受体性的(receptive)；并以所述光敏剂吸收的波长向所述处理区域应用光，从而消除革兰氏阴性生物。附图概述阅读以下详述的说明书、权利要求和附图后会更加清楚本发明的特征和创造性方面，以下是附图概述
图1是显示下文于实施例I中描述的两种组合物吸收谱的图表。发明详述本发明的组合物包含光敏剂和至少一种对羟基苯甲酸酯类。所述组合物优选地还包含药物可接受的载体。如下文实施例中所示，与单独使用光动力消毒(在类似或甚至相同的参数下)和对羟基苯甲酸酯类时针对相同革兰氏阴性生物的抗微生物效力的总和相
5比，本发明的组合物具有更高的针对特定革兰氏阴性生物的抗微生物效力。针对此类特定的革兰氏阴性生物的更大抗微生物效力在下文中会被称作“对羟基苯甲酸酯类加强作用”。光敏剂可以是任何合适的本领域公开的光敏剂。例如，光敏剂可以是吩噻鐺盐 (例如亚甲基蓝、甲苯胺蓝0及其衍生物等等)。Arianor钢蓝(Arianor steel blue)，结晶紫，天青蓝cert (azure blue cert)，天青B氯化物(azure B chloride)，天青2，天青A氯化物，天青B四氟硼酸盐，硫素，天青A曙红，天青B曙红，天青混合sicc.，天青II曙红，盐酸血卟啉，血卟啉酯，二磺酸化铝酞菁是合适的光敏剂的例子。卟啉，吡咯，四吡咯化合物， 扩大的吡咯大环及其各自的衍生物是合适的光敏剂的其它例子。QLT PhotoTherapeutics Inc. ,Vancouver,B. C.加拿大制造的Wiotofrin 是合适的光敏剂的另一个例子。其它示例性的光敏剂可在美国专利No. 5，611，793和No. 6，693，093中找到。上文所述光敏剂是不旨在以任何方式限制本发明范围的例子。取决于想要的应用，组合物可任选地包含多种光敏剂。光敏剂的量或浓度可根据想要的应用、使用的具体光敏剂和待抑制的靶标革兰氏阴性生物而变化。术语抑制和 /或被抑制表示防止、减少、杀伤、消除等等。例如，组合物中光敏剂的浓度范围可为从约 0. 00001% w/v 到约 25% w/v,从约 0. 0001% w/v 到约 10% w/v,从约 0. 001% w/v 到约 1 % w/v,从约 0. 001% w/v 到约 0. 1 % w/v,从约 0. 01% w/v 到约 1 % w/v,从约 0. 005% w/v 到约0. 05% w/v。在本文中使用时，术语“约”应当表示上述值的+/-20%。至少一种对羟基苯甲酸酯类可以是任何合适的本领域公开的对羟基苯甲酸酯类化合物(也已知为对-羟基苯甲酸的酯)。例如，对羟基苯甲酸甲酯(甲基-4-羟基苯甲酸酯)和对羟基苯甲酸丙酯(丙基-4-羟基苯甲酸酯)及其组合。对羟基苯甲酸酯类的量或浓度可根据想要的应用、使用的具体光敏剂和要抑制的靶标革兰氏阴性生物而变化。例如， 组合物中对羟基苯甲酸酯的浓度范围可为从约0. 00001%到约25% w/v，从约0. 0001%到约 10% w/v，从约 0. 001% 到约 w/v，从约 0. 01% w/v 到约 0. 1% w/v，从约 0. 01% w/v 到约 0. 5% w/v 和从约 0. 005% w/v 到约 0. 05% w/v。药物可接受的载体是与组合物的其它组分(例如光敏剂和至少一种对羟基苯甲酸酯类等等)一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂(vehicle)。药物可接受的载体(carrier)优选地是联邦政府或州政府的管理机构批准的，或列于美国药典 (U. S. Pharmacopeia)或其它被普遍认可用于动物、更特别地用于人的药典中。药物可接受的载体的例子包括但不限于水、盐水溶液、右旋糖溶液、甘油溶液、磷酸盐缓冲的盐水溶液寸寸。组合物可任选地包含额外的组分，例如抗炎剂、缓冲剂、调节溶液张力的盐、抗氧化剂、额外的防腐剂、粘度改变剂(例如羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素等等)、调味剂/香料(例如羟糖铝等等)、氧载体分子、细胞透化剂、抗生素、杀菌剂/抑菌
剂等等。本发明还提供了用于光动力消毒的方法，所述方法包括向位于目标处理区域内的革兰氏阴性生物应用包含光敏剂和至少一种对羟基苯甲酸酯类的组合物，其中所述革兰氏阴性生物对于对羟基苯甲酸酯类加强作用来说是受体性的；并以所述光敏剂吸收的波长向所述处理区域应用光，从而抑制革兰氏阴性生物。目标处理区域可以是想要进行抗微生物处理的任何区域(例如人组织、动物组织、另外的底物周围等等)。
术语“革兰氏阴性生物对于对羟基苯甲酸酯类加强作用而言是受体性的”表示使用本发明的组合物进行光动力消毒时会显示对羟基苯甲酸酯类加强作用的革兰氏阴性生物。对于对羟基苯甲酸酯类加强作用而言是受体性的革兰氏阴性生物的例子包括但不限于 Escherichia coli ( "Ε. coli") Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp.禾口通常居住在口腔中的致病性革兰氏阴性生物(例如Porphyromonas，Prevotella，Fusobacterium， Tannerella, Actinobacillus, Selenomonas, Eikenella, Campylobacter, Wolinella 等等)。Porphyromonas gingivalis 和 Prevotella intermedia 是此类口腔致病性革兰氏阴性生物的例子。波长可以是能够被组合物的光敏剂吸收的光的任何波长。波长包括选自连续电磁波谱的波长，例如紫外(“UV”)、可见、(近、中和远)红外等。例如，波长在约ieonm到约1600nm之间，400nm到约800nm之间，约500nm到约850nm之间，约600nm到约700nm之间，虽然波长可根据使用的具体光敏剂和光强而变化。光可由任何合适的本领域公开的用于光动力消毒的发光设备产生，所述设备例如为激光器(例如非热激光器等等)、发光二极管(“LED”)、白炽光源、荧光源等等。取决于光敏剂浓度和发光设备的功率，对处理位点的光应用可仅需要较短的时间段，例如从约15秒到少于约5分钟，优选地从约15秒到约2分钟，更优选地从约15秒到约 90秒，最优选地从约30秒到60秒。应用光的每个循环期间提供的光能范围可从约lj/cm2 到约 50J/cm2，从约 lj/cm2 到约 25J/cm2，从约 5J/cm2 到约 20J/cm2，和从约 6J/cm2 到约 12J/ cm2。取决于位于处理区域内的革兰氏阴性生物的性质和程度，专业人员(practitioner)可对处理位点应用多个循环的光应用(例如从约2到约10、约3到约5个等等)，从而导致被应用至处理位点的总累计光能能够可观地高于每个循环期间提供的光能。此外，取决于位于处理位点内的革兰氏阴性生物的性质和程度，可以将整个方法重复多次(例如约2到约10，约3到约5，等等)，直至达到想要的效果。优选地，对光敏剂浓度、波长和/或应用至处理位点的总累计光能的选择将允许本发明的方法将位于处理位点内的靶标革兰氏阴性生物减少超过约90 %，更优选地超过95 %，最优选地超过99 %。还优选地，对处理位点的光应用不引起对宿主组织和/或处理位点周围的生理学损伤。本发明的范围不限于本文所述的特定实施方案。事实上，除了本文所述的这些以外，从前文的说明和附图中本领域技术人员能够明白本发明的多种改变。此类改变旨在落入附带的权利要求的范围内。还应当理解，所有数值是约数，并且仅提供来用于说明。本申请通篇引用的专利、专利申请和公开通过引用整体并入本文。根据本发明提供的以下实施例仅用于阐述的目的，而不旨在表示穷举尽或限制本发明。实施例I组合物A在磷酸盐缓冲的盐水溶液中具有约0. 01 % w/v亚甲基蓝的活性成分。组合物B除了还含有约0. 18% w/v对羟基苯甲酸甲酯和约0. 02% w/v对羟基苯甲酸丙酯以外，与组合物A相同。使用定制设计的Imm路径长度杯，用分光光度计检查组合物A和组合物B的光吸收特征，结果展示于图1中。图1的垂直标度显示Imm路径长度下的光密度(即吸光度)。 图1的水平标度显示以nm为单位的波长。图1中的A线代表组合物A的吸光谱。图1的B线代表组合物B的吸光谱。665-670nm范围内的吸收峰表明单体形式亚甲基蓝的存在。600_610nm处的第二
峰表明二聚体形式的亚甲基蓝的存在。已显示二聚体形式的亚甲基蓝在产生单线态氧方面较不有效；因此，相信其在抗微生物方面较不有效。图1中展示的特征性吸收谱表明，与组合物B相比，组合物A导致更低水平的单体形式的亚甲基蓝。含有对羟基苯甲酸酯类的组合物B提高了亚甲基蓝的单体吸收峰。显示对羟基苯甲酸酯类的添加将亚甲基蓝单体二聚体的比例朝向单体形式的亚甲基蓝迁移。如Tardivo et al所解释的，非聚集(即单体)形式的亚甲基蓝可以被光化学激发为高量子产率的三倍体形式，得到单线态氧，所述单线态氧被认为是抗微生物光动力消毒中主要的有毒种类。相反，聚集(二聚体化的、三聚体化的等等)形式的亚甲基蓝不影响单线态氧生产，因此从抗微生物角度来看较不有用。因此，在针对抗微生物应用设计的亚甲基蓝光敏剂制剂中，期望具有高的单体对二聚体比例(见Tardivo，J.，Giglio, Α.，Oliveira, C. , Gabrielli, D. , Junqueira, H. , Tada, D. , Severino, D. , Turchiello, R. , Baptista, Μ., 2005. Methylene blue in photodynamic therapy :From basic mechanisms to clinical applications, Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, v. 2，p.175—191)。实施例II通过向每毫升约IO7到IO8个菌落形成单位(“CFU/ml”)的悬浮 E. coli (Escherichia coli ATCC 25922 )培养物应用包含磷酸盐缓冲的盐水溶液的对照和以下两种组合物，进行体外实验。组合物C含有在用浓度约0.2% w/v的苯甲酸钠防腐的等渗缓冲的载剂中的、浓度约0. 01% w/v的亚甲基蓝的活性成分。组合物D含有在等渗缓冲载剂中的、浓度约0. 01% w/v的亚甲基蓝、浓度约0. 18% w/v的对羟基苯甲酸甲酯、浓度约0. 02% w/v的对羟基苯甲酸丙酯的活性成分。等渗缓冲的载剂由磷酸盐缓冲的盐水溶液中的调味剂(例如羟糖铝)和粘度改变剂(例如羧甲基纤维素)组成。仅含磷酸盐缓冲的盐水的对照和上述组合物处于约中性的pH(例如约pH 7)下。使用约220mW输出功率的激光器，在约670nm的波长下，以约344mW/cm2的功率密度持续约60秒的时间，以约20. 6J/cm2的总能量剂量，来照射暴露于组合物C或组合物D的悬浮的E. coli培养物。另外，使用暴露于磷酸盐缓冲的盐水、组合物C或组合物D任一中 60秒而不经照射的悬浮E. coli培养物作为“无光”对照。在上述处理后，将样品连续稀释并涂布在固体培养基上保持M小时，从而允许未经照射的仅含磷酸盐缓冲的盐水的对照 (“对照”)中悬浮E. coli菌落变得可见。对每个实验条件的多个重复的平板计数进行平均和反计算(back-calculated)，其中考虑稀释度，得到以CFU/ml为单位的数据。数据被表示为处理后存活生物的CFU/ml，悬浮E. coli存活力的降低率(“杀伤率”)被计算为实验样品的该值与对照的比，其被表示为悬浮E. coli存活力(“PE”存活力)的Iogltl以及百分比降低。结果显示了与经照射的组合物C相比暴露于经照射的组合物D后显著更高的抗微生物效力。经照射的组合物D实现了悬浮E. coli的总体杀灭(> 7. 2的PE存活力Iogltl降低)，与之相反，经照射的组合物C仅实现了 3. 1的PE存活力Iogltl降低。该杀伤率差异是统计学上显著的(P < 0. 05)。暴露于未经照射的组合物D没有产生可观察到的PE存活力降低，这表明在所述浓度下对羟基苯甲酸酯类自身没有显示出强烈的抗微生物效果。这些结果是出乎意料的，它们显示在光动力消毒期间使用时，光敏剂(例如吩噻嗪如亚甲基蓝) 和对羟基苯甲酸酯类的组合提供了对羟基苯甲酸酯类加强作用，并且递送了更大的针对悬浮E. Coli的抗微生物效力。实施例III通过对约IO7 到 108CFU/ml 的悬浮 E. coli (Escherichia coli ATCC 25922 )培养物应用含有与实施例II中所述相同磷酸盐缓冲的盐水溶液的对照和以下四种光敏剂组合物，进行另一体外研究。组合物E含有如实施例II中所述的等渗缓冲的载剂，其具有以下活性成分浓度约0. 01% w/v的亚甲基蓝。除了添加浓度约0. 18%w/v的对羟基苯甲酸甲酯外，组合物F与组合物E相同。除了添加浓度约0. 02% w/v的对羟基苯甲酸丙酯外，组合物G与组合物E相同。除了添加浓度约0. 18% w/v的对羟基苯甲酸甲酯和浓度约0. 02% w/v的对羟基苯甲酸丙酯以外，组合物H与组合物E相同。所有组合物均处于中性PH水平 (例如约 的pH)。使用约220mW输出功率的激光器，在约670nm的波长下，以约344mW/cm2的功率密度持续约60秒的时间，以约20. 6J/cm2的总能量剂量，来照射暴露于四种上述组合物(组合物E、F、G和H)的悬浮的E. coli培养物。在上述处理后，将样品连续稀释并涂布在固体培养基上保持M小时，从而允许对照中悬浮E. coli菌落变得可见。对每个实验条件的多个重复的平板计数进行平均和反计算，其中考虑稀释度，得到以CFU/ml为单位的数据。数据被表示为处理后存活生物的CFU/ml，杀伤率被计算为实验样品中的该值与对照的比，其被表示为悬浮E. coli存活力的Iogltl以及百分比降低。数据显示，单独含有约0. 18% w/v对羟基苯甲酸甲酯或含有约0. 18%W/v对羟基苯甲酸甲酯与约0. 02% w/v对羟基苯甲酸丙酯的组合的经照射的光敏剂组合物(组合物F 和组合物H)实现了 E. coli的总体杀灭(即> 7. 9的PE存活力Iogltl降低)。经照射的组合物G(含有约0. 02% w/v对羟基苯甲酸丙酯)实现了 7. O的PE存活力Iogltl降低。经照射的不含对羟基苯甲酸酯类的组合物E显示显著更低的抗微生物效力，其具有3. 9的PE存活力Iogltl降低。所述研究的结果还表明，在革兰氏阴性生物的光动力消毒中使用时，向光敏剂组合物中添加对羟基苯甲酸酯类导致了对羟基苯甲酸酯类加强作用。实施例IV通过将约IO7 至Ij 108CFU/ml 的悬浮 Ε. coli (Escherichia coli ATCC 25922 )暴露于八种光敏剂组合物，进行体外研究。如实施例II中所述等渗缓冲载剂中浓度约0.01% w/v的亚甲基蓝被分别调节至约5、6、7和8的pH水平，得到约pH 5的组合物I，约pH 6的组合物J，约PH 7的组合物K和约pH 8的组合物L。组合物M(约pH 5)、组合物N(约pH6)、 组合物0(约？!1 7)和组合物PGApH 8)具有以下成分与实施例II中所述相同的等渗缓冲的载剂中浓度约0. 01% w/v的亚甲基蓝，浓度约0. 18% w/v的对羟基苯甲酸甲酯，浓度约0. 02% w/的对羟基苯甲酸丙酯。将悬浮E. coli培养物暴露于八种上述组合物后，使用约220mW输出功率的激光器，在约670nm的波长下，以约344mW/cm2的功率密度持续约60秒的时间，以约20. 6J/cm2 的总能量剂量进行照射。在上述处理后，将样品连续稀释并涂布在固体培养基上保持M小时，从而允许对照中悬浮E. coli的菌落变得可见。对每个实验条件的多个重复的平板计数进行平均和反计算(back-calculated)，考虑稀释度，得到以CFU/ml为单位的数据。数据被表示为处理后存活生物的CFU/ml，杀伤率被计算为实验样品的该与对照的比，其被表示为悬浮E. coli存活力的Iogltl以及百分比降低。经照射的组合物I产生了 2. 7的PE存活力Iogltl降低，而处于约5的相同pH水平下的经照射的组合物M给出3. 4的PE存活力Iogltl降低。经照射的组合物J实现了 4. 3的 PE存活力Iogltl降低，而处于约6的相同pH水平下的经照射的组合物N实现了 5. 4的PE存活力Iogltl降低。经照射的组合物K实现了 4. 7的PE存活力Iogltl降低，而处于约7的相同 PH水平下的经照射的组合物O导致了总体杀灭(> 7. 9的PE存活力Iogltl降低)。最后， 暴露于经照射的组合物L导致4. 8的PE存活力Iogltl降低，而暴露于处于约8的相同pH水平下的组合物P导致总体杀灭(> 7. 9的PE存活力Iogltl降低)。数据显示，与不含有对羟基苯甲酸酯类的相同光敏剂组合物(组合物I、J、K和L) 相比，在测试的所有PH水平下，含有对羟基苯甲酸酯类的经照射的光敏剂组合物(组合物 Μ、Ν、0和P)具有更好的抗微生物效力。另外，对含有对羟基苯甲酸酯类和不含对羟基苯甲酸酯类的两种光敏剂组合物而言，均随着递增的PH水平观察到抗微生物效力的总体提高。实施例V通过对每种以下的悬浮细菌培养物应用含有磷酸盐缓冲的盐水溶液的对照和三种光敏剂组合物，进行另一体外研究约IO6到107CFU/ml的Escherichia coli ATCC 25922 (革兰氏阴性)，Pseudomonas aeruginosa ATCC 卯27 (革兰氏阴性)，Serratia marcescens ATCC㊣43862 (革兰氏阴性)，Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 25923 (甲氧西林敏感且革兰氏阳性)和Maphylococcus epidermidis ATCC 49461 (革兰氏阳性)培养物。组合物Q含有以下成分如实施例II中所述等渗缓冲的载剂中浓度约 0.01%w/v的亚甲基蓝。除了添加浓度约0. 18% w/v的对羟基苯甲酸甲酯和浓度约0. 02% w/v的对羟基苯甲酸丙酯以外，组合物R含有与组合物Q相同的成分。组合物S含有在用浓度约0. 2% w/v的苯甲酸钠防腐的如实施例II中所述等渗缓冲的载剂中的、浓度约0. 01% w/v的亚甲基蓝。所有这些组合物均处于中性PH水平(例如约7pH)下。暴露于上述组合物(组合物Q、R和S)之一之后，使用约220mW输出功率的激光器， 在约670nm的波长下，以约344mW/cm2的功率密度持续约60秒的时间，以约20. 6J/cm2的总能量剂量，来照射每种细菌培养物。在上述处理后，将样品连续稀释并涂布在固体培养基上保持M小时，从而允许未经照射的仅含磷酸盐缓冲的盐水的对照中细菌的菌落变得可见。 对每个实验条件的多个重复的平板计数进行平均和反计算，考虑稀释度，得到以CFU/ml为单位的数据。数据被表示为处理后存活生物的CFU/ml，杀伤率被计算为实验样品的该值与可应用的未经照射的仅含磷酸盐缓冲的盐水的对照的比，并表述为细菌存活力(“B.存活力”)的Iogltl以及百分比降低。该实验检查了用于针对革兰氏阴性和革兰氏阳性生物进行光动力消毒时，含有和不含对羟基苯甲酸酯类的光敏剂组合物的抗微生物效力。对E. coli而言，不含对羟基苯甲酸酯类的组合物(组合物Q和S)均实现了 3. 9的B.存活力Iogltl降低，而经照射的含有对羟基苯甲酸酯类的组合物(组合物R)实现了 5. 6的B.存活力Iogltl降低。对I^seudomonas aeruginosa而言，不含对羟基苯甲酸酯类的组合物(组合物Q和S)均实现了 2. 8的B.存活力Iogltl降低，而经照射的含有对羟基苯甲酸酯类的组合物(组合物R)实现了 6.6的B.存活力Iogltl降低。对义！^站化marcescens而言，经照射的不含对羟基苯甲酸酯类的组合物 Q实现了 3. 3的B.存活力Iogltl降低，经照射的不含对羟基苯甲酸酯类的组合物S实现了 4.1的B.存活力Iogltl降低。对相同生物而言，而经照射的含有对羟基苯甲酸酯类的组合物(组合物R)实现了 4. 1的B.存活力Iogltl降低。对Maphylococcus aureus而言，经照射的不含对羟基苯甲酸酯类的组合物(组合物Q和S)均实现了 4. O的B.存活力Iogltl降低，而经照射的含有对羟基苯甲酸酯类的组合物(组合物R)实现了 3. 9的B.存活力Iogltl 降低。最后，对乂3 1^10(30(^心epidermidis而言，经照射的不含对羟基苯甲酸酯类的组合物Q实现了 3. 4的B.存活力Iogltl降低，经照射的不含对羟基苯甲酸酯类的组合物S实现了 3. 7的B.存活力Iogltl降低。在相同的菌株中，经照射的含有对羟基苯甲酸酯类的组合物(组合物R)实现了 4. 6的B.存活力Iogltl降低。该研究的结果显示，与经照射的不含有对羟基苯甲酸酯类的组合物(组合物Q和 S)相比，经照射的含有对羟基苯甲酸酯类的光敏剂组合物(组合物R)具有针对革兰氏阴性菌株E. coli和I^seudomonas aeruginosa的更高的抗微生物效力。评价的第三种革兰氏阴性生物S. marcescens未显示在含有对羟基苯甲酸酯类的组合物中被杀灭至更大程度，这表明所述生物对对羟基苯甲酸酯类加强作用不易感。在先前的研究中，Furr and Russell观察到对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯不被S. marcescens的整个细胞或经分离的细胞壁摄入，然而对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯则被摄入(见J. R. Furr and A. D. Russell,Factors influencing the activity of esters of p-hydroxybenzoic acid on Serratia m￡ircescens，Microbios，1972) 。 介白勺胃禾中胃gftP曰个生L S· aureus 和S. epidermidis也对对羟基苯甲酸酯类加强作用不易感，并且在暴露于对羟基苯甲酸酯类和非对羟基苯甲酸酯类的经照射的组合物后被杀灭至相同程度。总而言之，这些结果表明，对羟基苯甲酸酯类加强了针对某些革兰氏阴性生物(即能接受对羟基苯甲酸酯类强化作用的革兰氏阴性生物)的光动力消毒的抗微生物效力，并且当PH约为中性或更高时，所述对羟基苯甲酸酯类加强作用是最大的。因为对羟基苯甲酸酯类引起细菌膜中的渗透性改变，所以相信这可促进提高的光敏剂穿透进入革兰氏阴性生物的细胞中。这些改变也可以允许亚甲基蓝分子与革兰氏阴性细菌膜(即脂多糖部分)自身的结合提高，所述革兰氏阴性细菌膜是光动力消毒的主要作用位点。含对羟基苯甲酸酯类的光敏剂组合物中存在的更高比例的单体亚甲基蓝也可由于提高单体生产的单线态氧而加强光动力消毒的抗微生物效力。光动力消毒期间光敏剂组合物的对羟基苯甲酸酯类加强作用可允许用更短的光照处理时间(即降低的被应用的能量剂量)实现相同水平的抗微生物效力。其也允许下述可能性甚至以更短的处理时间从目标处理区域中完全杀灭病原体如E. coli，从而避免微生物的再建群和/或再感染。实施例VI在存在和不存在对羟基苯甲酸酯类时评价使用光敏剂亚甲基蓝的光动力消毒的效力，从而确定是否存在针对两种常见牙周病原体Porphyromonas gingival is和 Prevotella intermedia的对羟基苯甲酸酯类加强效应。这些牙周病原体已肯定地涉及牙周病的病因学。如下进行体外实验在厌氧条件(例如使用Brucella琼脂与氯高铁血红素和维生素 K 培养基)下培养 Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277)和 Prevotella
11intermedia(ATCC 25611)至对数期，并制备液体悬浮培养物至约107CFU/ml的浓度。随后将这些悬浮培养物暴露于含有磷酸盐缓冲的盐水溶液的对照，或暴露于以下两种组合物之一。组合物T含有以下成分如实施例II中所述等渗缓冲的载剂中浓度约0. 01%w/v的亚甲基蓝。除了添加浓度约0. 18% w/v的对羟基苯甲酸甲酯和浓度约0. 02% w/v的对羟基苯甲酸丙酯以外，组合物U含有与组合物T相同的成分。初步实验证实，在不存在光时暴露于含有浓度约0. 18% w/v的对羟基苯甲酸甲酯和浓度约0. 02% w/v的对羟基苯甲酸丙酯的组合物U中多达5分钟未导致细菌存活力的任何损失。该结果表明在这些参数下，对羟基苯甲酸酯类组分自身不显示剧烈的抗菌活性。使用约IOOmW功率输出的激光器，在约670nm的波长下，以约160mW/cm2的功率密度持续约60秒的时间，以约9. 6J/cm2的总能量剂量照射暴露于上述组合物(组合物T和 U)之一的上述生物的悬浮培养物。在上述处理后，将样品连续稀释并涂布在固体培养基上保持多达5天，从而允许仅含有未经照射的磷酸盐缓冲的盐水的对照中细菌的菌落变得可见。对每个实验条件的多个重复的平板计数进行平均和反计算，考虑稀释度，得到以CFU/ml为单位的数据。数据被表示为处理后存活生物的CFU/ml，杀伤率被计算为实验样品的该值与可应用的未经照射的仅含有磷酸盐缓冲的盐水的对照的比，其被表示为细菌存活力(“B.存活力”)的IogltlW 及百分比降低。所述研究的结果如下显示对羟基苯甲酸酯类加强作用与单独使用亚甲基蓝(组合物T)相比，存在对羟基苯甲酸酯类(组合物U)时光动力消毒的抗微生物效力被加强。 对Porphyromonas gingivalis而言和与对照相比，暴露于经照射的组合物T导致6. 0的 B.存活力Iogltl降低，暴露于经照射的组合物U导致7. 2的B.存活力Iogltl降低。因此，与组合物T相比，暴露于组合物U导致1.2的细菌杀伤Iogltl提高(> 10倍)。对I^revotella intermedia而言，暴露于经照射的组合物T导致3. 5的B.存活力Iogltl降低，而暴露于经照射的组合物U导致5.1的B.存活力Iogltl降低。因此，与组合物T相比，暴露于组合物 U导致导致1. 6的细菌杀伤Iogltl提高。使用牙周病原体Porphyromonas gingivalis和 Prevotella intermedia的所述研究的结果显示了清楚的、对这些生物的亚甲基蓝光动力消毒的对羟基苯甲酸酯类加强效应。
权利要求
1.用于光动力消毒的组合物，所述组合物包含光敏剂；和至少一种对羟基苯甲酸酯类，其中所述组合物被用于对革兰氏阴性生物的光动力消毒，所述革兰氏阴性生物对于对羟基苯甲酸酯类加强作用来说是受体性的，并且位于目标处理区域内。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含药物可接受的载体。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述光敏剂是吩噻鐺盐。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述光敏剂是亚甲基蓝。
5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述光敏剂的浓度范围为从约 0. 001% w/ν 到约 w/v。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述至少一种对羟基苯甲酸酯类选自由对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯及其组合组成的组。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述至少一种对羟基苯甲酸酯类的浓度范围为从约0. 001% w/v到约1% w/vo
8.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述光敏剂是浓度约0.01% w/v的亚甲基蓝，所述至少一种对羟基苯甲酸酯类包括浓度约0. 18% w/v的对羟基苯甲酸甲酯和浓度约 0. 02% w/v的对羟基苯甲酸丙酯。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述组合物的pH水平被调节为约6.0 至约7. 0。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述革兰氏阴性生物选自由 Escherichia coli、 Pseudomonas aeruginosa、 Porphyromonas、 Prevotella、 Fusobacterium、Tannerella、Actinobacillus、Selenomonas、Eikenella、Campylobacter、 Wolinella及其组合组成的组。
11.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述革兰氏阴性生物是 Porphyromonas gingivalis。
12.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述革兰氏阴性生物是I^revotella intermedia0
13.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述革兰氏阴性生物是hcherichia coli ο
14.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述革兰氏阴性生物是I^seudomonas aeruginosa0
15.光敏组合物用于制造用于在光动力消毒期间减少革兰氏阴性生物的药物的用途， 所述用途包括a.向目标处理区域应用包含光敏剂和至少一种对羟基苯甲酸酯类的组合物；和b.以所述光敏剂吸收的波长向目标处理区域应用光，从而抑制位于所述目标处理区域内的革兰氏阴性生物，其中所述革兰氏阴性生物对羟基苯甲酸酯类加强作用来说是受体性的。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述光敏剂是亚甲基蓝，并且所述波长范围为约 600nm 到约 700nm。
17.如权利要求15或权利要求16所述的用途，其中在向所述目标处理区域应用光的步骤期间，被应用至所述目标处理区域的光的能量剂量范围从约lj/cm2到约50J/cm2。
18.如权利要求15-17中任一项所述的用途，其中所述至少一种对羟基苯甲酸酯类选自由对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯及其组合组成的组。
19.如权利要求15-18中任一项所述的用途，其中所述光敏剂是浓度约0.01% w/v的亚甲基蓝，所述至少一种对羟基苯甲酸酯类包括浓度约0. 18% w/v的对羟基苯甲酸甲酯和浓度约0. 02% w/v的对羟基苯甲酸丙酯。
20.如权利要求15-19中任一项所述的用途，其中所述目标处理区域是口腔内的软组织，并且所述革兰氏阴性生物选自由Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、 Porphyromonas、Prevotella、Fusobacterium、Tannerella、ActinobaciIlus、Selenomonas、 Eikenella、Campylobacter、Wolinella 及其组合组成的组。
21.如权利要求15-19中任一项所述的用途，其中所述革兰氏阴性生物是 Porphyromonas gingivalis 或 Prevotella intermedia0
22.如权利要求15-21中任一项所述的用途，其中所述光敏剂是吩噻鐺盐。
23.如权利要求15-22中任一项所述的用途，其中使用激光提供被应用至目标处理区域的光。
24.如权利要求15-23中任一项所述的用途，其中重复所述应用组合物的步骤和对目标处理区域应用光的步骤，直至位于所述目标处理区域内的革兰氏阴性生物被减少超过 90%。
全文摘要
本发明涉及用于增强针对下述革兰氏阴性生物的光动力消毒的抗微生物效力的组合物，所述革兰氏阴性生物对使用包含光敏剂和至少一种对羟基苯甲酸酯类的组合物的对羟基苯甲酸酯类加强作用来说是受体性的。本发明还涉及用于光动力消毒的方法，所述方法包括向目的处理区域应用组合物，并以光敏剂所吸收的波长向目标处理区域应用光，从而抑制位于所述处理区域内的革兰氏阴性生物，其中所述革兰氏阴性生物对于对羟基苯甲酸酯类加强作用来说是受体性的。
文档编号A61P31/04GK102348467SQ200980158082
公开日2012年2月8日 申请日期2009年10月21日 优先权日2009年3月16日
发明者丽萨·佩蒂戈, 卡尔·斯特瑞特, 尼古拉斯·勒贝尔 申请人:恩迪尼国际有限公司