专利名称：：N′-(3-硝基苯甲酰基)-n-水杨酰肼合铜配合物及其制法与用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水杨酰肼合铜及其制法与用途。
背景技术：
：多数抗肿瘤药物主要诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用，其效能与其诱导细胞凋亡的能力密切相关。细胞凋亡是在基因调控下发生的细胞自杀行为，在各种因素作用下，细胞凋亡调控因素的表达发生改变，同时引起一系列生化变化，如ph值下降，某些蛋白酶活性增高，最终导致细胞凋亡。双酰肼含有酰基和肼基，可以与酶相应的活性点发生作用，同时又是一种很好的螯合剂，与金属离子配位，形成螯合环，增加了n电子的离域化作用，增强了配合物的亲脂性。亲脂性的增加使配合物易于渗透细胞。当配合物进入细胞内，与细胞中的微量金属生成药物_金属_酶的混合配合物而阻止病毒的复制。同时，某些核酸和蛋白质又是很好的配位体，可与从配合物中解离出来的金属离子作用，使一些活性官能团失活，因而具有明显的细胞毒活性。异烟酰肼是一种很好的抗结核药物，临床应用已有几十年的历史，虽然反复使用具有很大的毒性和抗药性，但至今依然被认为是化学治疗的首选药物。为了克服抗药性，最近，人们已经合成出各种各样的酰肼类衍生物，特别是水杨酰肼类化合物。根据文献报道，这类化合物具有很好的生物活性，如抗菌、抗结核和抗肿瘤等。本发明在水杨酰肼的基础上连接3-硝基苯甲酰基，合成双酰肼类化合物N'_(3-硝基苯甲酰基)-^水杨酰肼，以此为配体，合成出一类新型配合物N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水杨酰肼合铜，该配合物具有很好抗肿瘤活性，特别是对白血病癌细胞K562。因此，该类配合物将会成为市场上最有潜力的一类新药之一。
发明内容本发明的目的在于提供一类新型配合物N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水杨酰肼合铜及其制法与作为抗肿瘤的药物。本发明的技术方案如下—种四吡啶-二-N'-(3_硝基苯甲酰基)_二-N-水杨酰肼合三铜配合物，它有如下结构式中py为妣啶。—种制备上述配合物的方法，其制备路线图如下它由下列步骤组成步骤i.将水杨酰肼的三氯甲烷溶液冷却至8t:，在激烈搅拌下，滴加入与水杨酰肼等物质量的3-硝基苯甲酰氯的三氯甲烷溶液，继续搅拌，让反应混合物自然升温至25°C，搅拌3小时后，冷却，过滤和洗涤，得到黄色的N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水杨酰肼固体，步骤2.将步骤1得到的N'_(3-硝基苯甲酰基)-^水杨酰肼溶解在甲醇中，在室温搅拌下，加入物质的量比为2:3的醋酸铜的甲醇溶液，同时滴加2倍物质的量的吡啶，溶液变成黑色，继续搅拌4小时，过滤，清液静置9天后，析出黑色晶体，即为四吡啶_二-N'-(3-硝基苯甲酰基)-二-N-水杨酰肼合三铜配合物。上述的制备方法，步骤l中水杨酰肼的三氯甲烷溶液，三氯甲烷的用量为每毫摩尔水杨酰肼加10-15ml，3-硝基苯甲酰氯的三氯甲烷溶液，三氯甲烷的用量为每毫摩尔3-硝基苯甲酰氯加10-15ml。上述的制备方法，步骤2中甲醇的总用量是每毫摩尔N'_(3-硝基苯甲酰基)-N-水杨酰肼用无水甲醇80-120ml。上述的制备方法，步骤2中吡啶的用量是N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水杨酰肼的物质的量的2-2.5倍。经研究，本发明的四吡啶_二-N'_(3-硝基苯甲酰基)_二-N-水杨酰肼合三铜配合物对人胃癌细胞(BGC-823)和人白血病细胞株(K652)有明显的抑制作用，因此可以用于制备抗癌药物。具体实施例方式实施例l.四妣啶-二-N'_(3-硝基苯甲酰基)-二-^水杨酰肼合三铜配合物的制备1.在250mL的圆底烧瓶中，加入3-硝基苯甲酸(10.OOg，O.06mol)和的氯化亚砜(80mL)，加热回流4h后，蒸出过量的氯化亚砜，得到淡黄色晶状固体3-硝基苯甲酰氯。2.在lOOmL圆底烧瓶中，加入水杨酰肼(0.15g，lmmol)的的三氯甲烷(10mL)溶液，冰盐浴冷却至8t:以下。在激烈搅拌下，缓慢滴加3-硝基苯甲酰氯(0.19g，lmmo1)的三氯甲烷(lOmL)溶液。然后使混合溶液的温度慢慢升到25t:左右，搅拌3h，得到黄色固体。冷却，过滤，洗涤，得到黄色的N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水杨酰肼固体。3.将(0.030g，0.1,1)的N'-(3_硝基苯甲酰基)-^水杨酰肼溶于甲醇(10mL)溶液中，加入Cu(0Ac)2(0.018g，0.lmmol)的甲醇溶液，同时滴加吡啶(lmL)，溶液变成黑色，在室温下继续搅拌4h，静置，过滤，得黑色清液。9d后析出黑色晶体，本发明的N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水杨酰肼合铜配合物。经X-射线衍射分析其结果为Q具。^。Cu30n。其结构见图1.实施例2.四妣啶-二-N'_(3-硝基苯甲酰基)-二-^水杨酰肼合三铜配合物体外抗肿瘤活性研究采用MTT[3-(4，5)-双甲基_2_噻唑_(2，5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定N'-(3-硝基苯甲酰基)-^水杨酰肼合铜配合物对人胃癌细胞(BGC-823)和人白血病细胞株(K562)的抑制率，计算IC50阔。(1)培养液(每升)的配制掘I-翻培养粉一袋(10.4g)，新生牛血清100ml，青霉素溶液(20万U/ml)0.5ml，链霉素溶液(20万U/ml)0.5ml，加三蒸水溶解后，用5.6%的NaHC03溶液调pH值至7.2-7.4，最后定容至1000ml。过滤灭菌。(2)D-Hanks缓冲液(每升)的配制NaCl8.OOg，KC10.40g，Na2HP0412H200.06g，KH2P040.06g，NaHC030.35g。高压灭菌。(3)胰蛋白酶液的配制利用D-Hanks缓冲液配成浓度为0.5%胰蛋白酶液。过滤除菌。(4)实验药液的配制将测试样品用三蒸水和少量的匿SO溶解配成储备液，一般按实验最高浓度的io倍配制储备液。匿SO在培养液中的浓度不宜过大，加药后的每孔细胞悬液中匿SO的终浓度一般不超过0.05%-0.1%。储备液保存于-20°〇冰箱中备用。(5)人白血病细胞K562的培养常规培养于RPMI-1640培养液内(含10%小牛血清、100U/ml链霉素)，置于37°C、5%C02培养箱中培养，每隔3-4天传代一次。传代时将原瓶中培养液转移至离心管中，lOOOrpm离心5min，弃去原培养液，加入等量新鲜培养液，吹打均匀，移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原体积(培养液体积约为培养瓶容量的1/10)。(6)人胃癌细胞BGC-823的培养常规培养于RPMI-1640培养液内(含10%小牛5血清、100U/ml链霉素)，置于37t:、5XC02培养箱中培养，每隔3_4天传代一次。传代时将原瓶中培养液转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃去原培养液，加入等量新鲜培养液，吹打均匀，移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原体积(培养液体积约为培养瓶容量的1/10)。(7)细胞孵育取对数生长期的2种肿瘤细胞，调细胞悬液浓度为l-1.5X105个m1—1。在96孔培养板中每孔加细胞悬液lOOiU，置37°C，5%C02培养箱中培养24h。培养24h后，分别按设计加入药液。(8)加药将测试药液按照最终浓度的浓度梯度分别加入到各个孔中，每个浓度设6个平行孔。实验分为药物试验组(分别加入不同浓度的测试药)、对照组(只加培养液和细胞，不加测试药)和空白组(只加培养液，不加细胞和测试药)。将加药后的96孔板置于37°C，5%C02培养箱中培养24、4S、72h。阳性对照药物的活性按照测试样品的方法测定。(9)存活细胞的测定在培养了24、48、72h后的96孔板中，每孔分别加MTT40iil(用D-Hanks缓冲液配成4mg/ml)。在37。C放置4h后，移去上清液。每孔加150ylDMSO，振荡5min，使formazan结晶溶解。最后，利用自动酶标仪在570nm波长处检测各孔的光密度(0D值)。抑制率的计算细胞生长的抑制率按照下列公式计算生长抑制率=(l-存活率)X100%=[l-(0D实验-0D空白)/(0D对照-0D空白)]X100%(OD实验表示测试药物组的平均光密度，OD对gg表示对照组的平均光密度，OD空自表示对照组的平均光密度)。半数抑制浓度(IC5。)定义为当50%的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测定的光密度(OD值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。测得的ICs。见表l所示表1本发明所列铜配合物对肿瘤细胞的抑制IC5。值(yM)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求一种四吡啶-二-N′-(3-硝基苯甲酰基)-二-N-水杨酰肼合三铜配合物，其特征是它有如下结构式中py为吡啶。F2010100172870C00011.tif2.—种制备权利要求1所述的配合物的方法，其特征是它由下列步骤组成步骤1.将水杨酰肼的三氯甲烷溶液冷却至8t:，在激烈搅拌下，滴加入与水杨酰肼等物质量的3-硝基苯甲酰氯的三氯甲烷溶液，继续搅拌，让反应混合物自然升温至25t:，搅拌3小时后，冷却，过滤和洗涤，得到黄色的N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水杨酰肼固体，步骤2.将步骤1得到的N'_(3-硝基苯甲酰基)-^水杨酰肼溶解在甲醇中，在室温搅拌下，加入等物质量的醋酸铜的甲醇溶液，同时滴加入吡啶，溶液变成黑色，继续搅拌4小时，过滤，清液静置9天后，析出黑色晶体，即为四吡啶_二-N'-(3-硝基苯甲酰基)-二-N-水杨酰肼合三铜配合物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤1中水杨酰肼的三氯甲烷溶液，三氯甲烷的用量为每毫摩尔水杨酰肼加10-15ml，3-硝基苯甲酰氯的三氯甲烷溶液，三氯甲烷的用量为每毫摩尔3-硝基苯甲酰氯加10-15ml。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是步骤2中甲醇的总用量是每毫摩尔N'-(3-硝基苯甲酰基)-N-水杨酰肼用无水甲醇80-120ml，吡啶用量为2_2.5毫摩尔。5.权利要求l所述的四吡啶-二-N'_(3-硝基苯甲酰基)-二-^水杨酰肼合三铜配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。全文摘要一种四吡啶-二-N′-(3-硝基苯甲酰基)-二-N-水杨酰肼合三铜配合物，它有如下结构式中py为吡啶。本发明的四吡啶-二-N′-(3-硝基苯甲酰基)-二-N-水杨酰肼合三铜配合物对人胃癌细胞(BGC-823)和人白血病细胞株(K652)有明显的抑制作用，因此可以用于制备抗癌药物。文档编号A61P35/00GK101747353SQ20101001728公开日2010年6月23日申请日期2010年1月8日优先权日2010年1月8日发明者仇晓阳,刘淑娟,徐茂田,赵文献,郑昕申请人:商丘师范学院