专利名称：一种乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统的制作方法
技术领域：
本发明属药学领域，涉及一种可跨过血脑屏障的脑靶向复合物和纳米递药系统， 具体涉及一种乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统。
背景技术：
研究显示，烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)是一种门控型离子通道受体，在中枢神经系统高度表达，在脑组织，包括组成血脑屏障的脑毛细内皮细胞均广泛表达。蛇神经毒素主要分为短神经毒素和长神经毒素，前者主要是指含有60-62个氨基酸、形成4对二硫键的蛋白分子；后者指含有71-74个氨基酸、形成5对二硫键的蛋白分子。 有研究表明，一些毒蛇，例如眼镜蛇、蝮蛇和金环蛇等，其分泌毒液中的神经毒素可以与乙酰胆碱受体特异性结合(KD = KT9-I(TwM)。蛇神经毒素属于三手指形结构，具有图1所示的结构。其中，蛇神经毒素形成的三个环中(1οορΙ、1οορΙΙ和loopIII)，IoopII是与nAChRs 结合的主要区域，分子水平实验结果表明，神经毒素loopll氨基酸序列与nAChRs具有高亲和力。KC2S是长神经毒素0. Hannah toxin b的Loopll区域氨基酸序列，包含20个氨基酸。其氨基酸序列为YTKTWCDGFCSSRGKRIDLG，6位和10位的半胱氨酸形成二硫键，Thomas L. Lentz [Biochemistry, 1991，30，10949-10957]化学合成了 KC2S，并考察了其与狂犬病毒糖蛋白多肽片段的构效关系。血脑屏障是阻碍药物进入脑部组织的主要障碍，研究和开发可以穿透血脑屏障的靶向分子，协助药物或者药物载体穿过血脑屏障，从而达到药物的脑内传输，具有现实意义。
发明内容
本发明的目的为寻找能穿透血脑屏障的靶向分子，协助药物或者药物载体穿过血脑屏障，从而达到药物的脑内传输的递药系统，具体涉及一种乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统。本发明将多肽KC2S作为可以穿透血脑屏障的靶向分子，利用其与乙酰胆碱受体具有高亲和力和被脑毛细内皮细胞特异性摄取的特性，将荧光探针和纳米载体系统或纳米递药系统靶向递送至动物脑内。所述的多肽KC2S其氨基酸序列为YTKTWCDGFCSSRGKRIDLG。所述的KC2S多肽与乙酰胆碱受体具有高结合活性。本发明中，利用固相合成制备KC2S的生物素衍生物，该衍生物可以与荧光素标记链霉亲和素偶联，经细胞特异性摄取和体内脑部分布结果表明，KC2S具有携带荧光分子跨越血脑屏障的特征；利用生物素链霉亲和素体系，将KC2S修饰到白蛋白(BSA)纳米粒表面，125I标记的脑部分布量增加结果说明，KC2S可以促进纳米粒载体系统的脑靶向作用；将 KC2S巯基化并与马来酰亚胺反应，修饰到聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)材料上，构建的胶束可将荧光染料或抗肿瘤药物携带入脑、延长脑肿瘤模型动物的生存期，表明KC2S可以介导纳米胶束递药系统脑靶向和抗脑肿瘤作用。本发明所述的KC2S可以利用生物素链霉亲和素的方式与荧光物质FITC形成复合物，但是不仅限于FITC，近红外染料Cy5. 5和IR820可以利用同样的方式与KC2S形成复合物；KC2S通过巯基化不但可以修饰到聚乙二醇-聚乳酸胶束给药系统，还可以修饰到聚乙二醇-聚乳酸-聚羟基乙酸、聚乙二醇-聚己内酯和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺； 所述KC2S生物素化后，还可以修饰到牛血清白蛋白纳米粒、人血清白蛋白纳米粒、聚乙二醇-聚乳酸纳米粒、聚聚乙二醇-乳酸-聚羟基乙酸纳米粒、聚乙二醇-聚己内纳米粒和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺纳米粒；所述的KC2S修饰的具有脑靶向特征的的递药系统不仅限于包载紫杉醇、阿霉素和伊曲康唑等抗肿瘤药物，还可以包载治疗神经退行性疾病的药物如银杏内酯脑内递药。本发明中，所述的KC2S多肽其N端经生物素化后与链霉亲和素衍生物耦合，得到荧光标记的KC2S-Biotin-Mr印tavidin-X复合物，其中X是荧光物质，选自FITC或近红外染料IR820。所得的KC2S-Biotin-Mr印tavidin-FITC，可用于脑部疾病的离体示踪， KC2S4tr印tavidin-IR820可以作为脑部疾病的活体诊断。本发明中，所述的多肽KC2S，其中半胱氨酸巯基用Acm保护，将其N端连接上半胱氨酸，得到巯基化多肽，与含马来酰亚胺-聚乙二醇的两亲性高分子胶束材料连接，碘氧化后，得到胶束材料KC2S-PEG-Y复合物，其中Y是聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)、 聚己内酯(PCL)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。所得的胶束材料KC2S-PEG-Y复合物包括 KC2S-PEG-PLA、KC2S-PEG-PLGA、KC2S-PEG-PCL 和 KC2S-PEG-DSPE，其可以包载难溶性药物。 所述的难溶性药物包括紫杉醇、阿霉素、伊曲康唑和银杏内酯。上述胶束材料KC2S-PEG-Y 复合物，具有脑靶向特征，可携带药物穿越血脑屏障向脑内递药。本发明中，所述的生物素化多肽KC2S，通过Biotin-Str印tavidin机制制备得到 KC2S-Z纳米粒。其中，Z纳米粒选自牛血清白蛋白(BSA)纳米粒、人血清白蛋白(HSA)纳米粒、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)纳米粒、聚聚乙二醇-乳酸-聚羟基乙酸(PEG-PLGA)纳米粒、聚乙二醇-聚己内(PEG-PCL)纳米粒和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE) 纳米粒。所得的KC2S-Z纳米粒包括KC2S-BSA纳米粒、KC2S-HSA纳米粒、KC2S-PEG-PLA纳米粒、KC2S-PEG-PLGA纳米粒、KC2S-PEG-PCL纳米粒和KC2S-PEG-DSPE纳米粒，具有脑靶向特征，可携带药物穿越血脑屏障向脑内递药。所述的纳米粒包载的药物，包括紫杉醇、阿霉素、伊曲康唑和银杏内酯。本发明经体内、外试验，结果表明，多肽KC2S可以携带分子、纳米粒和胶束载体系统跨越血脑屏障，增加荧光或纳米载体系统在脑中浓度，并使包载抗肿瘤药物的纳米递药系统具有良好的抗脑胶质瘤功效。
图1是三手指形蛇神经毒素结构示意图。图 2、KC2S 的 HPLC 禾口 ESI—MS 图谱，其中，色谱方法色谱柱YMC C18 5 μ 150X4. 6mm;流动相A 水(含0. 三氟乙酸)；流动相B 乙腈(含0. 三氟乙酸)；洗脱程序0-45分钟5^^-65% B ；流速0.7ml/ 分钟；柱温:40°C ；检测:UV280nm, TKC2S :14. 199 分钟。ESI-MS KC2S :2292. 1。
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图3、KC2S竞争抑制曲线。图4、BCECs (A，B)和 HeLa (C，D)细胞摄取结果，其中，图下方数字分别表示细胞荧光标记比例和荧光强度， A 和 C 为 KC2S-FITC-Str印tavidin 结合物摄取结果，B 和 D 为 FITC-Str印tavidin 摄取结果，E为流式检测结果。图5、KC2S体内生物分布图，其中，A、B分别为阴性对照FITC-Mr印tavidin脏器成像和荧光半定量结果，C、D 分别为KC2S-Biotin-Mr印tavidin-FITC脏器成像和荧光半定量结果，脏器从左至右分别为 0.5h、lh、2h 和 4h。图6、KC2S-BSA纳米粒体内生物分布图，其中，A为125I-BSA纳米粒在体内生物分布，B为KC2S-BSA-125I纳米粒在体内生物分布，C为KC2S-BSA-125I纳米粒脑靶向效率；Te = (KC2S-BSA-125I 脑分布)/ (125I-BSA 脑分布)。图7、KC2S-PEG-PLA胶束体内生物分布图，其中，上排为普通PEG-PLA胶束载Coumarin-6脑部分布，下排为KC2S-PEG-PLA载 Coumarin-6 脑部分布；从左至右为0. 083h、0. 25h、0. 5h、lh、2h、4h、8h、12h 和 24h。图8、抗原位脑胶质瘤模型裸鼠的生存曲线，其中，生理盐水组、Taxol组、载紫杉醇的PEG-PLA和KC2S-PEG-PLA胶束组平均生存时间为34，38. 5，41. 5和47. 5天。
具体实施例方式
通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。实施例1KC2S制备与表征采用固相合成法，将PAM-Gly-Boc树脂用三氟乙酸(TFA)脱保护1分钟，两次。用 Boc保护氨基酸依次反应，反应完成后，三氟乙酸脱Boc保护后，用20%的哌啶DMF溶液脱除CHO保护基15分钟，两次。用氢氟酸将多肽切割下来，用20% DMSO氧化形成分子内二硫键，乙腈/水(含0. 1 % TFA)体系分离纯化。HPLC和ESI-MS表征KC2S的纯度和分子量。 结果如附图1所示，KC2S的分子量为2四2. 1。实施例2KC2S竞争结合乙酰胆碱受体活性试验Wister大鼠Q20 260克)断头处死后迅速分离出海马，称量后加入10倍体积的 Tris-HCl 缓冲液(50mM Tris-HCl,5mM MgCl2 · 6H20，ImM EDTA,0. 5% (ff/V)BSA, ImM PMSF, 3 μ g/ml蛋白酶抑制剂，0. 1% NaN3,0. 32M sucrose,pH7. 4)，用勻浆器15000转/分钟进行勻浆，每次30秒，共5次。勻浆液经1000 Xg离心10分钟，取上清液再用39000 Xg离心10 分钟，收集沉淀，用原重量的10倍体积Tris-HCl缓冲液pH7. 4重新悬液，再用39000 X g离心10分钟，取沉淀再用相同缓冲液洗涤，39000 X g离心10分钟，最后将得到的沉淀用以上缓冲液悬浮，分装在-80°C保存备用，用R)tin法测定蛋白质含量。在37°C反应器中摆放试管，所有管中均加入50μ g乙酰胆碱受体(nAChRs)蛋白量。测试管中依次加入20 μ 1 —定浓度的KC2S，非特异结合管中加入50 μ 1非标记配体0-811叫31~0丨(《111(0-880，终浓度为1(^11，预先反应50分钟。全部试管依次加入30 μ I125I-α -Bgt,终浓度为2ηΜ。用TriS-HCl缓冲液ρΗ7. 4补足所有反应管体积为200 μ 1。 在37°C反应条件下反应2小时。点样于49型玻璃纤维滤膜上，负压抽滤，再用冰冷的缓冲液洗涤10次，每次anl，抽干滤膜，烘干后，放在闪烁瓶中，加Iml闪烁液，用LS6500型液闪计数器测定放射性强度。KC2S在不同浓度时对nAChR与125I- α -Bgt结合竞争性抑制作用结果如附图2所示。KC2S的IC50为42. 66ηΜ。实施例3KC2S脑毛细管内皮细胞(BCECs)摄取试验在KC2S分子上连接生物素，制备得到生物素化的KC2S(KC2S_Biotin)。将 BCECs和HeLa细胞按照2 X IO5细胞/孔密度种在6孔板上，贴壁Mh。将FITC标记的Mi^ptavidin与生物素化KC2S溶解在PBS (pH7. 4)中，涡旋30分钟，制备得到 FITC-Streptavidin-Biotin-KC2S复合物。细胞摄取实验之前，将BSA溶液与细胞孵育 4h，饱和蛋白非特异性结合。BCECs和HeLa细胞分别用800 μ 1 FITdtr印tavidin或者 FITC-Streptavidin-Biotin-KC2S复合物溶液孵育2h(KC2S的终浓度为2. 5 μ M)。用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7. 4)洗涤细胞3次，用荧光显微镜观察细胞摄取情况，实验结果见附图2。 同时，将BCECs和HeLa细胞胰酶消化后，1600转/分钟离心10分钟，用PBS洗涤3次，涡旋分散，流式细胞仪定量检测，定量检测结果见附图3。KC2S被具有nAChRs表达的BCECs细胞特异性摄取，而在没有nAChRs表达的HeLa细胞无特异性摄取。实验结果表明，KC2S细胞水平具有脑靶向性特征。实施例4KC2S4tr印tavidin复合物体内生物分布试验FITC-Streptavidin 或者 FITC-Str印tavidin-Biotin_KC2S 复合物昆明种小鼠 ( 25克)尾静脉注射100 μ 1 (KC2S的终浓度为2. 5 μ Μ)，分别在0. 5、1、2和4小时用乙醚麻醉，用生理盐水心脏灌流，分别取心、肝、脾、肺、肾和脑等主要器官，用活体成像仪 (in-vivolmaging System,FX Pro,Kodak,USA)检测各个脏器的荧光分布，同时根据荧光强度进行半定量计算，实验结果如附图4所示。实验结果表明，尾静脉KC2S-Streptavidin复合物，在0. 5小时到4小时内主要分布在脑和肾脏，其中肾脏是其主要代谢途径，而阴性对照FITC-Sti^ptavidin在脑内没有分布，说明KC2S可以促进FITC-Sti^ptavidin跨越血脑屏障。 实施例^C2S_BSA纳米粒体内分布试验利用沉淀-固化法制备BSA纳米粒。将BSA溶解在PBS (pH9. 0)，边搅拌边加入2. 5 倍乙醇，Iml/分钟。加入等摩尔比例的戊二醛固化，旋转蒸发除去乙醇，S印hadexG-50除去残留的戊二醛，冻干。将IOmg BSA纳米粒分散在Iml PBS (pH9. 0)，按照摩尔比1 4加入 NHS-Biotin，室温反应2h，Sephadex G-50柱洗脱除去残留的活泼酯。0. 5ml 生物素化纳米粒(lmg/ml)与 0. 75ml Mi^ptavidin 溶液 Qmg/ml)混合，室温搅拌30分钟，离心(12000转/分钟，10分钟)三次除去未结合蛋白。加入等摩尔比的生物素化KC2S，室温搅拌30分钟，离心三次除去未结合多肽，制备得到KC2S-BSA纳米粒。Iodogen法将BSA纳米粒进行125I标记，除去游离1251，分别制备125I-BSA纳米粒和 125I-KC2S-BSA 纳米粒。昆明小鼠尾静脉注射125I-BSA纳米粒和125I-KC2S_BSA纳米粒，200μ 1/只( 20 μ Ci)。Ih和Ia1收集血样，乙醚麻醉，生理盐水心脏灌流，取心、肺、肝、脾、肾和脑等脏器，gamma计数器检测放射强度并计算％ID/g。试验结果如附图5所示，试验结果表明，KC2S修饰后，BSA纳米粒在Ih和1 !入脑均增强。实施例6KC2S-PEG-PLA胶束体内生物分布试验固相合成KC2S时，序列中的半胱氨酸用Acm保护巯基，序列完成后连接半胱氨酸。 KC2S (Acm)2-Cys在pH8. 0的PBS中与马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸(Maleimide-PEG-PLA) 反应，反应完成后透析除去小分子，KC2S(Acm)2-Cys-PEG-PLA继续用碘氧化得到分子内二硫键。制备的KC2S-PEG-PLA(Img)与PEG-PLA(19mg)溶解在3ml乙腈中，加入15 μ g 6-香豆素(Coumarin-6)，减压成膜浊，水化，CL-4B柱除去游离Coumarin-6，制备得到包埋 Coumarin-6的多肽修饰胶束，同法制备载Coumarin-6的PEG-PLA普通胶束，将KM鼠( 25g)尾静脉注射100 μ 1。分别在5分钟 M小时用乙醚麻醉，40ml生理盐水心脏灌流，分别取心、肝、脾、肺、肾和脑等主要器官，用活体成像仪检测各个脏器的荧光分布，实验结果如附图6所示。与普通胶束相比，KC2S-PEG-PLA胶束在脑部荧光分布强，说明KC2S可以促进PEG-PLA载体系统穿透血脑屏障。实施例7载紫杉醇KC2S-PEG-PLA胶束体内药效学试验KC2S-PEG-PLA (Img)与 PEG-PLA (19mg)溶解在 3ml 乙腈中，加入 IOmg 紫杉醇，减压成膜池，水化，0. 22 μ m水膜过滤除去游离紫杉醇，制备得到包载紫杉醇的KC2S修饰胶束， 同法制备PEG-PLA载紫杉醇普通胶束，原位肿瘤模型裸鼠尾静脉注射100 μ 1载紫杉醇的 KC2S-PEG-PLA和PEG-PLA胶束，以及Taxol (生理盐水稀释)和生理盐水，紫杉醇制剂的给药剂量为10mg/kg，分别在肿瘤种植后第7、12、17和22天给药，记录裸鼠的生存时间。裸鼠生存曲线如附图7所示，与其他组别相比，载紫杉醇KC2S-PEG-PLA胶束显著延长原位肿瘤裸鼠生存时间。
权利要求
1.一种乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统，其特征在于，通过下述方法制备利用多肽KC2S将其生物素化衍生物与链霉亲和素化荧光素偶联，或将多肽KC2S 修饰到白蛋白纳米粒上，或将多肽KC2S修饰到聚乙二醇-聚乳酸上并构建成胶束制得跨越血脑屏障的主动靶向递药系统；所述多肽KC2S其氨基酸序列为YTKTWCDGFCSSRGKRIDLG。
2.按权利要求1所述的乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统，其特征在于，所述多肽KC2S其N端经生物素化后与链霉亲和素衍生物耦合，制得荧光标记的 KC2S-Biotin-Streptavidin-X 复合物。
3.按权利要求2所述的乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统，其特征在于，所述的KC2S-Biotin-Mr印tavidin-X复合物，其中X是荧光物质FITC或近红外染料 IR820 ；所述的复合物是 KC2S-Biotin-Str印tavidin-FITC 或 KC2S_Str印tavidin_IR820。
4.按权利要求1所述的乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统，其特征在于，所述多肽KC2S其序列中半胱氨酸巯基用Acm保护，将其N端连接上半胱氨酸，得到巯基化多肽，与含马来酰亚胺-聚乙二醇的两亲性高分子胶束材料连接，碘氧化后，得到胶束材料KC2S-PEG-Y复合物。
5.按权利要求4所述的乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统，其特征在于，所述KC2S-PEG-Y复合物，其中Y是聚乳酸PLA、聚乳酸-聚羟基乙酸PLGA、聚己内酯 PCL或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE。
6.按权利要求5所述的乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统，其特征在于，所述KC2S-PEG-Y复合物形成聚合物胶束，包载难溶性药物。
7.按权利要求6所述的乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统，其特征在于，所述聚合物胶束包载的难溶性药物包括紫杉醇、阿霉素、伊曲康唑和银杏内酯。
8.按权利要求1所述的乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统，其特征在于，所述的生物素化KC2S，通过Biotin-Sti^ptavidin机制制备得到KC2S-Z纳米粒。
9.按权利要8所述的乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统，其特征在于，所述的KC2S-Z纳米粒，其中Z纳米粒是牛血清白蛋白BSA纳米粒、人血清白蛋白HSA纳米粒、聚乙二醇-聚乳酸PEG-PLA纳米粒、聚聚乙二醇-乳酸-聚羟基乙酸PEG-PLGA纳米粒、聚乙二醇-聚己内PEG-PCL纳米粒或聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺PEG-DSPE纳米粒。
10.按权利要求8所述的乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统，其特征在于，所述的KC2S-Z纳米粒具有脑靶向特征，可携带药物穿越血脑屏障向脑内递药。
11.按权利要求10所述的乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统，其特征在于，所述的纳米粒包载的药物包括紫杉醇、阿霉素、伊曲康唑和银杏内酯。
12.权利要求3所述的KC2S-Biotin-Mr印tavidin-FITC在制备用于脑部疾病的离体示踪制剂中的用途。
13.权利要求3所述的按KC2S-Str印taVidin-IR820在制备脑部疾病的活体诊断制剂中的用途。
14.按照权利要求6所述的KC2S-PEG-Y复合物在制备跨越血脑屏障的主动靶向递药系统中的用途。
全文摘要
本发明属药学领域，具体涉及一种乙酰胆碱受体介导跨越血脑屏障的主动靶向递药系统。本发明利用与乙酰胆碱受体具有高亲和力的多肽KC2S将其生物素化衍生物与链霉亲和素化荧光素偶联后，细胞特异性摄取和体内脑部分布结果表明，KC2S可以介导蛋白分子跨越血脑屏障；将KC2S修饰到白蛋白纳米粒上，其125I标记物体内分布表明，KC2S可以促进纳米载药系统跨越血脑屏障；将KC2S修饰到聚乙二醇-聚乳酸上并构建成胶束，荧光示踪结果表明，KC2S可以介导载药系统脑靶向；将KC2S-聚乙二醇-聚乳酸胶束包载紫杉醇，可以显著延长脑胶质瘤原位模型裸鼠的生存期。
文档编号A61K47/42GK102151336SQ20101011066
公开日2011年8月17日 申请日期2010年2月12日 优先权日2010年2月12日
发明者占昌友, 孟庆刚, 谢操, 陆伟跃, 顾炳 申请人:复旦大学