专利名称：抗人前胃液素多肽免疫组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种改良的抗人类延伸型胃泌素免疫组合物。
背景技术：
胃肠肿瘤是人类最常见的肿瘤，也是导致世界上许多国家死亡率最高的疾病。已知许多生长因子尤其是由前胃泌素原加工处理过程中产生的肽类激素家族影响恶性胃肠 细胞的增殖。前胃泌素原在正常组织中成熟过程涉及前胃液素中间体的多个加工处理步 骤，最终在外周循环中形成酰胺化形式的胃泌素，即胃泌素G34和胃泌素G17，又分别被称 为“大”胃泌素和“小”胃泌素。已知这些激素可调节黏膜细胞的增殖和进食后(餐后)胃 酸的分泌。有报道称前胃液素、胃泌素尤其是G17和甘氨酸延伸型胃泌素(gly_G17)在体 内外可营养恶性胃肠肿瘤细胞的生长，因此，许多实验都支持靶向抑制胃泌素的治疗方法。已知免疫抑制特定的促进肿瘤生长因子和激素对于治疗特定的疾病和癌症，特别 是胸部、肺部和某些胃肠(GI)型肿瘤很有效。此外，免疫学疗法对于预防和治疗胃-食管和 胃-十二指肠溃疡这些慢性病也很有效。一些治疗方法已成功应用，其中最引人注目的是 用靶向人的或人源单抗的方法。然而，建立生产人源单抗生产线需要巨额投资，购买商业化 的人源单抗不仅费用高，而且运输也是问题，考虑到上述因素，在发展中国家急需建立低成 本的治疗策略。对于胃肠肿瘤或疾病，在治疗上应采用能诱导产生中和促胃肠肽激素生物 活性的中和抗体。要求这些抗体必须是特异性针对特定生长因子或激素或激素前体。治疗 一种特定疾病可以选择一种或多种因子或激素。例如，人胃肠道胃泌激素17(“huG17”)参 与胃肠疾病过程，包括胃食管返流疾病，由于“huG17”可刺激产生酸性物质，造成胃和十二 指肠溃疡。此外，huG17还可刺激一些胃肠肿瘤细胞生长。因此，能中和huG17活性的抗 huG17抗体在临床上被用来治疗由huG17诱导和参与的疾病.可以将抗huG17抗体直接给病人注射(即通过被动免疫)或通过主动免疫让病人 自己产生抗huG17的抗体来达到治疗目的。同样，尽管人们认为在外周循环中只有酰胺化 的胃泌激素才具有生物活性，但根据已有的临床胃肠肿瘤及其衍生的人癌细胞株的研究， 表明前胃泌素原的前胃液素形式也具有促细胞增殖潜能。事实上，胃肠肿瘤细胞没有能力 将胃泌激素前体如前胃泌素原和前胃液素加工成正常的酰胺化形式的能力，因此，肿瘤患 者血清中胃泌激素的前体水平较酰胺化的形式高。有报道，与结肠直肠息肉或正常人相比，结肠直肠癌患者血浆中前胃液素的水平， 而不是酰胺化或甘氨酸延伸型前胃液素显著提高(Siddheshwar et al.，2001)。在结肠癌 肿瘤患者体内，前胃液素、酰胺化的胃泌激素、总胃泌激素与甘氨酸延伸型前胃液素的检出 率分别为100%,69%, 56%, and 44% (Ciccotosto et al，1995)，该现象提示肿瘤患者的 胃泌激素加工的确存在异常。通过给予患者具有一定化学结构的、诱导产生能与靶因子或激素结合的抗体的免 疫原，可以完成针对生长因子或胃肠激素的主动免疫。使用的免疫原在结构上应该是靶分 子或靶激素的抗原模拟肽，且含有能与靶分子或靶激素或其抗原表位发生交叉反应的分子。这些抗原模拟肽具有诱导机体产生特异性抗体的能力。例如，某靶分子具有一定的免 疫原性，但天然的抗原模拟肽往往其免疫原性较低，无法有效激活机体免疫反应，所以必须 将该模拟肽与具有强免疫刺激的免疫载体偶联形成具有免疫活性的复合物。典型的抗原模拟肽具有两个功能域一个可诱导免疫应答反应的抗原肽序列，一 个间隔子。抗原模拟肽的功能是诱导机体产生能够与肽靶分子结构结合的抗体。任何具有 可以与huG17肽单一抗原表位发生免疫交叉反应的化学结构均可作为抗原模拟肽。优选实 施例中的抗原模拟肽是包含huG17的氨基末端表位的huG17片段，其可刺激机体产生抗人 小胃泌激素及甘氨酸延伸型胃泌激素的交叉反应抗体。其中的间隔子作为抗原模拟肽与载 体分子之间的连接点，也会影响机体对免疫原表位部分的免疫应答。最近用一种具有专利权的huG17分子的N-末端9肽通过一个间隔子与白喉类 毒素偶联制备的免疫原，不仅可成功抑制了实验性大鼠溃疡的发生，还可抑制人的胃肠肿 瘤移植物在免疫缺损小鼠体内生长。许多临床试验也证实，给胃肠肿瘤患者使用该免疫原 (被称为G17DT)也得到很好的结果(Watson et al，2001)，但遗憾的是，最近在美国给晚期 胰腺癌患者进行的III期临床试验并没有得到理想的治疗效果。尽管在早期临床试验中显 示出一些成功，但G17DT的使用并未考虑到胃泌素基因表达的异质性，尤其在胃肠恶性肿 瘤中。虽然正常胃黏膜细胞和组织分泌/外周循环最多的胃泌素是G17和G34，但多数报道 显示在外周循环中G34含量占胃泌素的50%，甚至10-20%。大多数胃泌素是被加工的被 称为前胃液素的中间体，前胃液素具有独立(独立于传统的胃泌素受体)的生长促进活性。 这样，由G17DT诱导产生的抗体只可捕获G17和C-末端延伸的形式，却不能捕获胃肠患者 循环中大量存在的未被加工或部分加工的胃泌素(前胃液素)。针对重大缺陷和关键问题， 我们对其序列进行了新的设计，使得新型多肽免疫组合物物激活机体产生的特异性抗体能 在肿瘤患者循环中同时捕获存在的胃泌素和前胃液素。
发明内容
经过实验，我们已确定的是huG17抗原模拟肽与特定的间隔子肽偶联可提高模拟 肽的免疫原性，与以前使用的免疫原相比，产生了意想不到的改善免疫反应的效果。我们制 备的免疫原可诱导产生针对前胃液素和经加工处理的前胃液素N-末端氨基酸的多克隆抗 体，该免疫原包含了已鉴定的 Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn SEQ ID NO :1 的肽段，该肽段偶联了一个免疫载体白 喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳素等。其中在该实施例中破伤风类毒素是与抗原模拟肽偶 联的优选免疫载体，而抗原模拟肽为一个21个氨基酸的肽段(G21肽，即“前胃泌素”(前胃 泌素原的第88-101氨基酸残基)连接7个氨基酸的“间隔子”)。另一个改进的免疫原可 诱导产生针对huG17和gly-huG17氨基末端的多克隆抗体，该免疫原包含了已鉴定的SEQ ID NO 2 的肽段 pGlu-Gly-Pro-Trp-β Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys，该肽段偶联了一个免疫载体白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳素等，β Leu 为亮氨酸的β氨基酸类似物。破伤风类毒素是该肽段(G-18肽)(即为经过修饰的huG17 的N-末端(前胃泌素原第76-86肽段)上连接一个7氨基酸的间隔子)优选的免疫载体。使用经过修饰的氨基酸常常可提高其毗连的抗原肽“异源的”特性，与未经修饰的天然的抗 原肽相比，可诱导产生更高水平的交叉反应性抗体。已被鉴定的SEQ ID NO :3pGlu-Gly-Pro一Trp一Val一Glu一Glu一Glu一Glu一Glu_Ala一Thr一Thr一Pro一Pro一Pro一pro一Cys 与白喉类毒素、破 伤风类毒素或百日咳素等免疫载体偶联，其中破伤风类毒素是该肽段(G18LV)，即“修饰的 huG17的N-末端”(包含修饰的前胃泌素原第76-86肽段)连接一个7氨基酸的间隔子形 成的huG17同源抗原模拟肽的优选免疫载体。已被鉴定SEQID NO 4序列为pGlu-Gly-Pro -Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys, (G18LI肽)，也形成 一个huG17同源抗原模拟肽。序列表中SEQ ID NO 5的序列为Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp -Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly ；即(G-20)肽，包含一个 甘氨酸延伸的huG17抗原模拟肽(前胃泌素原第79-93氨基酸残基)连接一个7个氨基酸 的间隔子。序列表中 SEQ ID NO :6 的序列是 Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu -Glu-Glu-Ala-pN02-Phe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly, (G20YF)，包含了一个经过修饰的甘氨 酸延伸的huG17抗原模拟肽(前胃泌素原第79-93氨基酸残基)连接一个7个氨基酸的间 隔子。其余的肽序列(SEQ ID NO :7-10)，包含一个或多个脯氨酰氨基酸的D型异构体，在 免疫载体上，这些氨基酸对于正确呈递其毗邻的抗原肽非常重要。D型氨基酸异构体不仅使 免疫原在构象上，而且使其在体内的储留时间上均利于APC细胞的呈递，产生高滴度的抗体。序列表中鉴定为SEQ ID NO. :7的载体肽是间隔子肽Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys， 序列表中 SEQ ID NO. :8 是间隔子肽 Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys，SEQ ID NO. 9间隔子肽序列是Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. 10间隔子肽序列是 Thr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cys，序列表中 SEQ ID NO :7_10 均为间隔子肽。一般来说，用抗原模拟肽-载体复合物进行免疫，需要注射2次或2次以上，且需 要几周或几个月的时间才能使抗体滴度升到理想水平。用本发明改进的免疫原在初次免疫 后很短的时间内即可产生有效水平的抗体，抗体水平可稳定维持几个月之久，且只需一次 加强免疫即可迅速产生更高水平的抗体。
图1(1A、1B、1C、1D)描述ELISA检测的小鼠抗体反应，其是对三个多肽免疫原的免 疫反应，该多肽免疫原分别含有偶联物hG18TT ；hG18DT ；hG21TT和hG21DT，其中，图IA为小 鼠抗人GT18TT ELISA滴度，图IB为小鼠抗人GT18DT ELISA滴度，图IC为小鼠抗人GT21TT ELISA滴度，图ID为小鼠抗人GT21DT ELISA滴度。图2 (2A、2B)描述了给予与实施例1和实施例2中的与肽1 (hG18TT)和肽 2(hG21TT)偶联结合的多肽免疫组合物后，ELISA法检测的兔中抗体反应结果，其中，图2A 为兔抗G18滴度，图2B为兔抗G21ELISA滴度。图3描述了用hG18TT和hG21DT多肽免疫组合物免疫处理小鼠对移植的人胃癌细 胞(BCC-823细胞)的抑制作用，将含有人胃癌细胞的无菌的中空密封纤维管移植给42日 龄小鼠。如图所示，一些动物除了接受免疫原外还接受了传统的胃癌化疗药物。图4(4A、 4B、4C、4D)描述ELISA检测的小鼠抗体反应比较，其中，图4A为小鼠抗人G18-a TT与小鼠 抗人G21TT抗体滴度比较，图4B为小鼠抗人G18-b TT与小鼠抗人G21TT抗体滴度比较，图 4C为小鼠抗人G20TT与小鼠抗人G21TT抗体滴度比较，图4D为小鼠抗人G20_a TT与小鼠 抗人G21TT抗体滴度比较。
具体实施例方式
实施例1多肽合成采用标准固相合成方法。每个多肽的氨基酸含量和纯度均采用本领域通 用的方法进行了鉴定。合成如下列氨基酸序列的多肽肽的氨基酸序列1) Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn(SEQ ID NO. 1)(G-21) ；2)pGlu-Gly-Pro-Trp-β Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(SEQ ID NO. 2) (G-18) ；3) (hu G17 同源物)pGlu-Gly-Pro-Trp-β Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro -pro-Cys(SEQ ID NO. 3) (G-18LV) ；4)pGlu-Gly-Pro-Trp-IIe-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala -Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(SEQ ID NO. 4)(G18LI) ；5)Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Le u-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly ； (SEQ ID No. 5)(G_20a) ；6) Cy s-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-pN02-Phe-Gly-Trp-Me t-Asp-Phe-Gly ； (SEQ ID No. 6) (G_20b) ；7) Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. :7 ；丝氨 酰基-脯胺醯基(Seryl-Prolyl)间隔子 7 氨基酸肽；8) Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys， SEQ ID NO. :8 ；丝氨酰基-丝氨酰基全部D-脯胺醯基间隔子7氨基酸肽，and 9) Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. :9 (苏胺醯基-脯胺醯基(Threonyl-Prolyl) 7 氨基酸肽)，and 10) Thr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cys, SEQ ID NO. :10(苏胺醯基-苏胺醯 基全部D-脯胺醯基7氨基酸肽)。肽1(SEQ ID NO . 1)包含前胃泌素的氨基端模拟肽(-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-G Iy-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn),碳末端间隔子-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (SEQ ID NO. :7)连接到该前胃泌素原残基88-101的N末端.肽2 (SEQ ID NO. :2)包含 huG17 的 11 个氨基酸(pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-β Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-，用 β 亮氨 酸代替了亮氨酸的 huG17 的同源物，间隔子-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-D-Pro-Cys，(SEQ ID NO. :7)连接到huG17抗原模拟肽的氨基酸残基86的C末端.肽1(SEQ ID NO. :3)包含 抗原模拟肽同源物的上述11个氨基酸(除了用缬氨酸代替了 β亮氨酸外，其余与肽2中 的相同)，-Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys，(SEQ ID NO. 8)连接到上述前胃泌素原的氨 基酸残基86的C末端。肽i(SEQ IDN0. 4)包含huG17的11个抗原模拟肽(pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly(与肽 2 中的相 同，除了用亮氨酸代替了缬氨酸)，间隔子(-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys ；SEQ ID N0. 7)连接到该人前胃泌素原的氨基酸残基79的C末端。肽^iSEQ ID NO. 5)含有huG17的 15 个抗原模拟肽 gly-huG17 Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly，间隔子-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys ； (SEQ IDN0. 7)连接到该人前胃泌素原 的氨基酸残基79的N末端，形成huG17的甘氨酸延伸型模拟肽；肽^iSEQ ID NO. 6)包含 para-nitrophenylalanine修饰的甘氨酸_huG17的15个免疫模拟氨基酸Trp-Ile-Glu-G lu-Glu-Glu-Glu-Ala-pN02-Phe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly,间隔子-Ser-Ser-Pro-Pro-Pr o-pro-Cys (SEQ ID NO. 7)连接到该人前胃泌素原的氨基酸残基79的N末端，形成huG17 的甘氨酸延伸型模拟肽。ltl(SEQ ID NO:. 1)包含前胃液素的抗原模拟肽(-Gly-Trp-Me t-Asp-Phe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn)，羧基端间隔子(SEQID N0. 8)连接到该人前胃泌素原的氨基酸88-101肽段的N末端，形成人前胃液素模拟肽。I在优选的方法中，每一个多肽通过末端的半胱氨酸残基端利用异(基)双功能 试剂被偶联到免疫载体破伤风类毒素(TT)的氨基，该双功能试剂在一端含有琥珀酰亚胺 酯，另一端含有马来酰亚胺。为了完成上述多肽1和2与载体连接，多肽的半胱氨酸首先要 被还原。多肽干粉用PH7-9含有5-50摩尔过量二硫苏糖醇(DTT)的0. IM的PBS缓冲液溶 解。然后真空冻干保存直至使用。
采用异(基)双功能试剂ε -maleimidocaproic酸N-羟基琥珀酰亚胺酯 (epsilon-maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester, ^MCS“)处理破伤风类 毒素(TT)使之被激活，按每IO5相对分子量的TT大约25个游离氨基的比例加入异(基) 双功能试剂.采用超滤的方法进行破伤风类毒素的纯化。回收的纯化的TT的最终浓度应 大于5-40mg/ml。采用色谱法进行纯度测定(SEC HPLC)，Lowry法进行蛋白浓度测定，(水 合)茚三酮法测定游离的氨基。通过商业途径获得多肽(Biosyn Corp, USA)，已知其还原程度及含量的肽用于与 载体偶联。多肽经TCEP (tris (2-carboxyethyl) -phosphine-HCl)进行还原，然后该混合物 用于偶联。Ellmans分析可用于进行游离氢硫化物基团(sulfhydral)的检测。破伤风类毒 素的激活首先用活化缓冲液将纯化的TT稀释到5-50mg/ml，然后将需要量的TT转移至玻 璃瓶，加入EMCS(50-90mg/ml 二甲基甲酰胺(DMF)到TT溶液中，EMCS/TT的摩尔比率决定 了活化水平。进行超滤以纯化活化物。最后经过浓缩，使蛋白浓度大于5-50mgTT/ml。将浓 缩后的TT采用色谱法(SEC HPLC)进行纯度测定，Lowry法进行蛋白浓度测定，Ellman' s 法测定TT的活性水平。多肽-TT的偶联首先计算与Maleimido-TT反应所需要的多肽的 量，然后将多肽加入到M-TT溶液中，多肽-TT偶联物经过超滤的方法进行纯化，纯化后过滤 除菌。采用色谱法(SEC HPLC)进行纯度测定，Lowry法进行蛋白浓度测定，氨基酸分析法 确定交联的比率。多肽G18和G21通过EMCS与TT形成的的偶联物再经4°C G50S印hadex低压层析 分离纯化，采用0. 1-05M的碳酸铵平衡。洗脱液经冷冻干燥后低温保存备用。偶联物可以被称为多肽免疫组合物，其含量可通过本领域公知的多种方法，如重 量增加、氨基酸分析等进行测定。按照该方法制备的G18和G21与TT的偶联物，经氨基酸分 析法测定，每IO4-IO6MW的TT含有10-30摩尔的多肽，所有的偶联物适合作为免疫原去免疫 动物。同样地，经相同方法制备的G18和G21与DT的偶联物，-采用huG17为基础经ELISA 方法对抗体的结合情况进行了分析。实施例2实施例1中的多肽-TT交联物乳化后进行免疫，乳化物制备方法如下交联物与佐 剂在水相中的浓度是在最终乳化物中浓度的2倍。，交联物溶解在pH为6. 5-8的PBS中，使 最终浓度达5-12mg/ml。将水相与油相介质按1 1 (体积/体积)混合形成包含最终免疫 原的乳化物。各种类型的本领域技术人员公知的油状介质都可使用。其中有一种油相介质 是由20-60份角鲨烯、70-30份角鲨烷、2-12份司盘80、0. 6-2份单硬脂酸铅、0. 1-1份吐温 80和0. 2-1. 2份吐温40混合而成。水相与油相可以用本领域技术人员公知的任何方法混 合并形成乳化剂的混合物。乳化剂在储存过程中必须稳定(如在几周到几个月的保藏期不 能出现明显的油相和水相分离的现象)，另外，其粘稠度也要一致，以便可用可接受的皮下注射针注射。含有免疫原的水相的油状介质按1 1(V/V)的比例，通过中间由一个18号针头 大小的针状物(乳胶管)联通的两个玻璃注射器进行乳化，需要使水相与油状介质的混合 物反复通过针管50次。乳化好的免疫原随即吸入一次性注射器内用于给动物免疫。实施 例4所使用的免疫原最终浓度是交联物hG18-TT为1-5. Omg/ml实施例3正如在实施例1和2中描述的那样，我们用实施例1中的肽G18和G21分别与TT和DT连接构建了交联物，然后用肽G18免疫原(图1A，1B)和肽G21免疫原(图1C，1D)分 别免疫6只小鼠。实施例4正如在实施例1和2中描述的那样，我们用实施例1中的交联物G18和G21分别 与TT和DT连接构建了交联物，然后用肽G18TT免疫原免疫4只家兔(图2A)，用肽G21TT 免疫原免疫4只家兔(图2B)。图1和图2的ELISA实验结果显示，从对不同动物免疫应答诱导潜能及诱导产生 的抗体维持情况看，免疫原1和2(实施例1和实施例2)是有效的。实施例5正如在实施例1和2中描述的那样，我们用交联物G18和G21分别与TT和DT连 接构建了两种交联物，然后用免疫原G18TT和G21TT分别免疫了 6只小鼠。在抗体滴度达 到高峰时(42天)，所有小鼠腹腔植入每2. Ocm携带50，OOO个人胃癌细胞(BCG-823)的中 空纤维管，植入的纤维管壁口径小于500KD，所以宿主细胞，如CTL和NK细胞等无法渗入，使 人肿瘤细胞在有免疫活性的小鼠体内存活。5天后取出植入的纤维管，MTT法计数活细胞， 并与植入非免疫小鼠的对照组进行比较。按照实验计划，给有些小鼠注射一次顺_ 二氯二 氨络钼(cisplatin，CP)，剂量10mg/kg ；或注射一次5-氟尿嘧啶(5-FU)，剂量为20mg/kg ； 或将两者联合注射(CP+5-FU，FUP) —次，两种药物剂量均为10mg/kg。实验结果见图3。根据使用抗胃泌素/前胃液素(免疫原G18和G21)抑制人胃 癌细胞生长，以及在传统化疗基础上由免疫原诱导产生足够的抗体反应可知，免疫原1和 2(实施例1和2中制备的)是有效的。图3为人胃癌细胞(BCG-823)生长抑制率。(相对于未经药物处理的阴性对照(绿 色柱)细胞，G18TT或G21不与化疗药联用或与化疗药联用对人胃癌细胞(BCG-823)生长 抑制作用)，其中，CP为cisplatin (即顺-二氯二氨络钼)，5FU为5-氟尿嘧啶，FCP为CP 和5FU的联合。与未处理的阴性对照细胞相比，G18TT与G21TT对人胃癌细胞的生长抑制 达到60%。实施例6用在实施例1和实施例2中已描述的方法，我们构建了与实施例1中列举的相似 的包含G18a，G18b，G20，G20-a和G21抗原肽的耦合抗原，所有抗原与破伤风毒素进行了交 联。然后我们用Gla8TT，G18bTT，G20TT和G20aTT分别免疫6只小鼠，并对这些抗原诱导产 生抗体的能力与G21抗原肽进行了比较。(图4A-D)如上所示，G18-a, G_18_b，G20和G20_a免疫原诱导产生的抗胃泌激素抗体与G21 相当，或优于已报道的G17DT。
对模拟肽及抗原肽间隔子进行改进制备的免疫原，通过对肽免疫原与没有用模拟肽和间隔子的免疫原的免疫原性进行的测试，我们发现免疫效果均较差，因此，我们对免疫 模拟肽及间隔子进行了修改和完善。本发明引用的参考文献为1.专利文献US40693131978.6 Woodhour et al.US42017701980.5 StevensUS43849951983.3 StevensUS45267161985.7 StevensUS46910061987.9 SteyensUS48944431990.1 Greenfield et al.US50230771991.6 Gevas et al.US51208291992.6 Pierschbacher et al.US52565421993. 10 ChangUS54684941995.11 Gevas et al.W01997/028821 1997.7 Gevas et al.2.非专利文献Kothary, et al. " Identification of Progastrin-17 " , Biochem. Biophys. Res. Comm. 146 =884-888,1987. ·Larsson, " Characterization of Antral Gastrin Cells with Region-Specific Antiserum" , J. Histochem. Cytocem. 25 :1317_21,1977..Nemeth,J. " Development of a Sequence-Specific RIA by Using N-Terminal Gastrin l-13Antibody“ ，Chem. Abs. 98 :51653w,1983..Dockray, G. J. " Immunochemical Studies on Big Gastrin Using NH. sub. 2-Terminal specificAntiserums" , Chem. Abs. 94 :119200w,1981..Iwanaga, T. " Immunocytochemical Localization of the Different Gastrin Forms in the PyloricAntrum" , Biom. Res. 1 :316_320,1980..Cunningham, et al. " High-Resolution Epitope Mapping of hGH-Receptor Interactions. . . "，Science 244 :1081_1085，1989..Dockray, " Amino-terminal gastrin fragment in serum of Zollinger-Ellison Syndrome patients" , Gatroenterology 68 -.222-230,1975..Nemeth et al. " A Gastrin Aminoterminalis 1-13 Fragmensevel Kido-Kidolgozott, ..."，Izotoptechnika 25 =288-294,1982. ·ffendlberger,et al. " The synthesis of human big gastrin I and 32-leucine analog"，Chem. Abs. 92 :198749s，1980..Power, et al. " A novel gastrin-processing pathway in mammalian antrum"，Chem. Abs. 109 :67341z，1988..Dockray, et al. " Heptadecapeptide gastrin !measurement in blood by specificradioimmunoassay" , Gastroenterology 71:971-977,1976··
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权利要求
一种多肽免疫组合物，其包含一个模拟肽序列Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn SEQ ID NO.1，所述肽与免疫载体偶联，其中大写字母开头的氨基酸是L-型异构体，小写字母开头的氨基酸是D-异构体氨基酸，pGlu是焦谷氨酸。
2.一种多肽免疫组合物，其包含选自以下组的模拟肽肽pGlu-Gly-Pro-Trp-β -am inoLeu(β Leu)-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. 2 ；免疫原模拟肽 pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-P ro-Pro-pro-Cys,SEQ ID NO. :3 ；免疫原模拟肽pGlu-Gly-Pro-Trp-Val-Glu-Glu-Glu_Glu -Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys,SEQ ID NO. :4 ；免疫原模拟肽Cys-pro-Pro_Pr o-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly, SEQ ID NO. 5 ；免疫原模拟肽Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala_pN02-Phe-G Iy-Trp-Met-Asp-Phe-Gly SEQ ID NO. 6 ；每种肽均偶联一种免疫载体。
3.如权利要求1和2的多肽免疫组合物，其中所述的免疫载体选自由破伤风类毒素 (TT)，白喉类毒素(DT)，百日咳类毒素(PT)以及纯蛋白衍生物(Pure ProteinDerivative, PPD)组成的组。
4.如权利要求1或2的多肽免疫组合物，其中所述的免疫载体为破伤风类毒素。
5.包含有效量的权利要求1、2或3的多肽免疫组合物以及药学上可接受的载体的药物 组合物。
6.权利要求4所述的多肽免疫组合物，其中所述药学上可接受的载体包含具水相和油 相的乳液，其中油相是含角鲨烯、角鲨烷、聚山梨醇酯80、去水山梨糖醇单油酸酯(Sorbitan monooleate)及吐温40的油性赋形剂。
7.权利要求5所述的多肽免疫组合物，其中所述药学上可接受的载体包含具水相和油 相的乳液，其中油相是含角鲨烯、角鲨烷、聚山梨醇酯80、去水山梨糖醇单油酸酯(Sorbitan monooleate)、吐温40及单硬脂酸铝的油性赋形剂。
8.权利要求5、6或7的多肽免疫组合物，其中药学上可接受的载体包含具水相和油相 的乳液，其中油相是含角鲨烯、角鲨烷、聚山梨醇酯80、去水山梨糖醇单油酸酯(Sorbitan monooleate)、吐温40的油性赋形剂，其中水相和油相均包含佐剂，所述佐剂包含但不限 于去甲亚甲基双磷酸氢钠(Nor-MDP)，尔吉咪唑(Ergamisol)，西咪替丁(Cimetidine)， 咪喹莫特(Imiquimod)，尿酸(uric acid)，环化双鸟甘酸(cyclicdiguanylate)，苏氨 酰(基)-N_乙酰胞壁酰-L-丙氨酰(基)-D-异谷氨酰胺(threonyl-N-acetyl-muram yl-L-alanyl-D-isoglutamine)，异丙月Λ Ρ (Isoprinosine)，甘露聚It (mannan)，海藻H (trehalose) dimycolate, QS—21 或 α-半乳糖神经酷胺(alpha-galactosylceramide) (α -GalCer)或 α -葡糖苷(酯)酰鞘氨醇(alpha-glucosylceramide) ( α -GluCer)。
9.抗原模拟妝:Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly-Arg-Arg -Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn SEQ ID NO. :1。
10.抗原模拟肽:pGlu-Gly-Pro-Trp-β -aminoLeu ( β Leu) -GIu-GIu-GIu-GIu-GIu-Gl u-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. :2。
11.抗原模拟肽:pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-P ro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. :3。
12.抗原模拟肽:pGlu-Gly-Pro-Trp-Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-P ro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. :4。
13.抗原模拟妝:Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gl y-Trp-Met-Asp-Phe-Gly, SEQ ID NO. :5。
14.抗原模拟肽Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu_Ala-pN02-Ph e-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly, SEQ ID NO. :6。
15.间隔子模拟肽Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys，SEQID NO :7。(其中大写字母开 头的氨基酸是L型异构体，小写字母开头的氨基酸是D-异构体)，pGlu是焦谷氨酸，自然存 在于huG17激素的N-末端。
16.间隔子多肽Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys,SEQ ID NO. :8。
17.间隔子模拟Jft:Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. :9。
18.间隔子模拟肽Thr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cys，SEQID NO. :10。
全文摘要
一种新型改良的抗人类延伸型胃泌素免疫组合物，其包含一个21个氨基酸的多肽(SEQ ID NO1)或其它相关多肽(SEQ ID NO2-5)，以及免疫载体和具有特定化疗作用的药物组合物。
文档编号A61P35/00GK101797382SQ201010116229
公开日2010年8月11日 申请日期2010年3月3日 优先权日2010年3月3日
发明者戚胜美, 王宾, 理查德·阿斯旺 申请人:戚胜美