专利名称：一种人类和哺乳动物细胞游离表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA，特别是一种人类和哺乳动物细胞游离表达载体。
背景技术：
基因治疗技术是随着DNA重组技术的成熟而逐渐发展起来的，是当代医学和生物学的一个新的研究领域。基因治疗是通过一定方式将正常基因或有治疗作用的DNA序列导入靶细胞以纠正基因的缺陷而发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的。自从20世纪90年代初首次成功进行基因治疗的临床试验以来，迄今已完成了数千例基因治疗临床试验。作为一种分子药物治疗形式，基因治疗为许多遗传性和获得性疾病提供一种新的治疗方式。从早期单基因遗传病的治疗，目前已扩展到对人类健康威胁严重的多基因疾病，包括遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、代谢性疾病，以及感染性疾病(如AIDS、乙型肝炎)等。
载体(vector)是将外源基因导入宿主细胞的运载工具。基因治疗载体系统包括病毒与非病毒两种。目前大多数临床基因治疗仍采用转染率较高的病毒载体，外源基因整合到宿主的染色体上，存在着潜在的致癌性、自身免疫原性和/或造成细胞病理改变等。和病毒载体相比，非病毒载体虽然有很多优点，但其转染效率低，持续表达时间短，大多为瞬时表达，如要稳定持久地表达，载体必须整合到宿主细胞染色体上，载体的随机整合会引起插入突变或导致转基因的沉默。此外，目前所用的基因治疗表达载体都包含原核质粒的序列，如在大肠杆菌中起复制起始作用的DNA序列、在细菌中筛选阳性克隆的抗药性基因标志等，这些DNA序列便于插入真核基因后能在大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。但是这些原核质粒序列在真核宿主细胞并不具备任何功能，并且基因治疗导入宿主细胞后对患者存在潜在的危险，如由于抗药性抗性基因失控导致的随机分布、某些未知表达信号激活等。因此，构新型、高效、安全的基因治疗表达载体，是基因治疗中亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种安全性能好、效率高的人类和哺乳动物细胞游离表达载体。本发明的技术方案是，其特征在于所述载体的多克隆位点下游和上游分别含有人源性的MAR和有治疗作用的外源基因DNA片段且只含有真核表达元件的表达载体。此载体可作为基因治疗的应用。本发明与现有技术比较具有安全性能好、效率高的显著优点。
图1是pEGFP-Cl初始载体结构图，载体购自clontech公司，其上带有启动子CMV和EGFP基因。 图2使中间载体pE丽构建流程图，其中MCS位点含有Bgl 11 、 Xho I 、 Sac I 、 Hindi 11 、EcoRI、 Pstl、 Sail (Accl)、 Kpnl(Asp7181) 、 SacII、Apal(Bspl201) 、 Xmal、 Smal、 BamHI。
图3是游离性表达载体pEVW的构建流程图，其中MCS位点含有Bgl 11 、Xho1 、 Sacl 、
3HindlII、EcoRI、Pstl、 SalI(AccI)。 图4是pEVWN载体的结构图，HindlII/SalI酶切pEVW及P-hNGF基因片段，连接，载体大小为6919bp。
具体实施例方式
pEGFP-Cl载体为人类及哺乳动物细胞的表达载体，其上含有增强型绿色荧光蛋白(Enhance green fluorescent protein gene， EGFP)基因，EGFP基因为报告基因，其主要作用是为了在宿主细胞中容易检测目的基因的表达。因此本发明中首先将EGFP基因删除，替换为一段新合成的含CMV启动子和多克隆位点(multiple cloning site，MCS)的DNA序列。此外，pEGFP-Cl载体含有kan/Neo筛选标记及原核表达调控元件，这些筛选标记及原核表达调控元件在载体的克隆、筛选具有重要作用，但基因治疗导入宿主细胞后对患者存在潜在的危险因素。因此，本发明引入了一个新的ClaI酶切位点，使构建的pEVW载体具备2个相同的Clal酶切位点。在载体构建、克隆完成后，利用Clal酶切位点酶切pEVW载体，删除原核质粒元件，然后用T4DNA连接酶连接，纯化后用于人类的基因治疗。
结合以下实施例具体说明本发明所述载体pEVW的构建过程与应用。
本发明实施例中所使用的质粒载体pEGFP-Cl(质粒图谱如图1所示)购自clontech公司，所使用的菌株E.coli DH5 a购自天根生化科技(北京)有限公司，所使用
的试剂均为市售商品。 实施例1 :中间载体pE丽构建 (l)PCR扩增以下DNA片段。设计以下PCR引物Pl :5' -CTCACATGTTCTATCGATTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTG-3'(下划线为Pcil酶切位点；斜体为Clal酶切位点)，P2 :5'-TCGAGATCTGCTAGCGGATCTGACGGTTCACT-3'(下划线为Bgl11酶切位点)。
(2)以pEGFP-Cl为模板，PCR扩增上述片段，PCR反应体系为10X扩增缓冲液10 ii 1 ， 4种dNTP混合物各200 ii mol/L，引物各50pmol，模板DNA 1 ii g， Taq DNA聚合酶5U，Mg2+1. 5mmol/L，加双或三蒸水至100 ii 1。 PCR条件采用程序如下95 °C 3min，94。C 40s，58。C 30s，72。C 40s，30个循环，72°C 3min。 PCR产物1. 0%琼脂糖凝胶电泳，进行胶回收，用紫外分光光度计测0D260值。生物公司测序，结果扩增出的DNA片段大小为668bp，测序结果与Genbank登录的pEGFP-Cl的CMV启动子完全一致。 (2)Pcil/Bg111酶切上述合成片段及pEGFP-Cl，酶切体系如下 凝胶回收DNA片段，T4DNA连接酶连接，转化E. coliDH5 a ，提取质粒，酶切鉴定，构
建中间载体pE丽(图2)。 实施例2 :P-干扰素MAR的克隆及鉴定 根据Axygen血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取人外周血基因组DNA，根据GenBank报道的P -干扰素MAR (Genbank no :M83137. 1)序列设计如下引物，P1 :5' -ACT￡GTACCTCGCCACGCACAAGATCAAT-3'(下划线为Kpnl酶切位点)，P2 :5' -CGAGGATCCAGCGGGAACATCACTGCAAA-3'(下划线为BamHI酶切位点)。PCR扩增P -干扰素MAR， PCR反应体系为:10X扩增缓冲液10iil，4种dNTP混合物各200iimol/L，引物各50pmol，模板DNA 1 y g，Taq DNA聚合酶5U， Mg2+1. 5mmol/L，加双或三蒸水至100 ii 1 。
PCR条件采用程序如下95 °C 3min，94。C 40s，56。C 30s，72。C 40s，30个循环，72°C 3min。 PCR产物1. 0%琼脂糖凝胶电泳，进行胶回收，用紫外分光光度计测0D260值。生物公司测序，结果扩增出的DNA片段大小为2200bp，测序结果与GenBank登录的P -干扰素MAR完全一致。 实施例3 :游离性表达载体pEVW的构建 (1)酶切反应Kpnl/BamHI酶切P -干扰素MAR及pE丽载体，采用常规的酶切方法和琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收MAR片段及pE丽线形载体。(2)目的基因与载体的连接酶切后的pEVW质粒DNA和目的DNA按1 : 5 (摩尔比)进行连接，反应体系10 y L，T4DNA连接酶1 iU， 16。C过夜反应；(3)重组载体的提取在感受态E. coliDH5 a菌中加入连接产物进行转化，接种在卡那霉素阳性平皿37t:过夜，挑选单菌落，37t:摇菌300r/min过夜，采用SDS碱裂解法提取重组载体质粒；取5 iil重组载体DNA用Kpnl/BamHI双酶切鉴定，测序，结果证明构建的表达载体pEVW正确。 实施例4 :人神经生长因子13亚基(13 -hNGF)基因的克隆 根据人P-hNGF基因序列设计PCR引物，上游引物Pl :5 ' -GTCAAGCTTATGTCCATGTTGT-3 '(下划线为Hindi II酶切位点)，下游引物P2 :5' -CCTGTCGACTCAGCTCTTCTC-3'(下划线为SalI酶切位点)。 提取人外周血基因组DNA， PCR扩增P -干扰素MAR， PCR反应体系为10 X buffer10 ii 1， 4禾中dNTP混合物各200 ii mol/L，引物各50pmo1，模板DNA1 ii g， Taq DNA聚合酶5U，Mg2+1. 5mmol/L，加双或三蒸水至100 yl。 PCR程序如下95。C预变性5min，94。C变性30s，6(TC退火30s，72t:延伸60s，30个循环。琼脂糖凝胶电泳检测，结果片段大小正确，回收目的DNA然后送公司测序，测序结果表明成功克隆出人13 -hNGF基因片段。
实施例4 :表达载体pEVWN的构建 (1)酶切反应对pEVW质粒DNA和人P -hNGF基因片段分别进行HindiII和Sail双酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收DNA，用紫外分光光度计测0D260值。(2)目的基因与载体的连接酶切后的pEVW质粒DNA和人13 -hNGF基因片段按1 : 5 (摩尔比)进行连接，反应体系10 ii 1，T4DNA连接酶1 iil， 16。C过夜反应；(3)重组载体的提取在感受态E. coli DH5 a菌中加入连接产物进行转化，接种在卡那霉素阳性平皿37t:过夜，挑选单菌落，37t: 300r/min摇菌过夜，采用SDS碱裂解法提取重组载体质粒；取重组载体DNA用HindiII和Sail双酶切鉴定，测序，结果证明构建的表达载体pEVWN正确。
实施例5 :神经生长因子游离表达载体的产生 上述构建好的提取pEVWN质粒转化大肠杆菌E. coliDH5 a ，过夜培养，离心收集菌体，按常规质粒提取方法抽提纯化pEVWN质粒，测定0D260质粒浓度，测序鉴定产物正确性。Clal酶切删除原核表达调控片段，回收真核表达盒片段，T4DNA连接酶连接，测序鉴定产物正确性。 实施例6 :神经生长因子游离表达载体在基因治疗中的应用 取纯品质粒配制成针剂或制成口服胶囊，用于神经系统病变引起的疾病的治疗。质粒表达载体可在宿主细胞内表达神经生长因子，治疗各种颅脑损伤、脊髓损伤、外周神经损伤，如骨折、创伤。中枢神经系统缺血，缺氧，神经元退行性疾病变和神经组织移植的辅助治疗。大脑功能发育不全，中枢及周围神经系统营养不良，意识障碍，早老性痴呆，糖尿病性
5周围神经病变，化疗引起的末梢神经病变。本发明人类和哺乳动物游离表达载体可应用于治疗各类肿瘤的药物。
权利要求
一种人类和哺乳动物细胞游离表达载体，其特征在于所述载体的多克隆位点下游和上游分别含有人源性的MAR和有治疗作用的外源基因DNA片段且只含有真核表达元件的表达载体。
2. 权利要求1所述的一种人类和哺乳动物细胞游离表达载体，其特征在于此载体可作为基因治疗的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人类和哺乳动物细胞游离表达载体。本发明涉及一种DNA。本发明的目的是提供一种安全性能好、效率高的人类和哺乳动物细胞游离表达载体。本发明的技术方案是，所述载体的多克隆位点下游和上游分别含有人源性的MAR和有治疗作用的外源基因DNA片段且只含有真核表达元件的表达载体。本发明用于基因治疗。
文档编号A61K48/00GK101781662SQ20101011620
公开日2010年7月21日 申请日期2010年2月24日 优先权日2010年2月24日
发明者井长勤, 张俊河, 张秀华, 张继红, 李琴, 王天云, 王芳, 董卫华 申请人:新乡医学院