专利名称：人源抗狂犬病毒Fab抗体及其与纳米粒子交联的方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种纳米粒子交联的人源抗狂犬病病毒Fab 抗体的制备及应用。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus)引起的一种人兽共患自然疫源性疫病。人 和动物一旦发病死亡率高达100%。全球每年约有55，000人死于狂犬病，主要集中在亚非 拉发展中国家。人类患者多因病畜咬伤而感染，出现以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等为主要 特征的中枢神经系统感染疾病。该病流行广、宿主多，几乎所有温血动物都能被感染，以各 种哺乳动物为主要宿主，是一种危害非常严重的人畜共患急性传染病，是迄今为止人类病 死率最高的急性传染病，也是人类尚未能有效控制的疫病之一，因此研制狂犬病的防治药 品相当重要。1975年Kohler和Milstein创立B淋巴细胞杂交瘤技术以来，鼠源性单克隆抗体 作为第二代抗体，在医学和生物学领域得到了广泛应用。抗狂犬病病毒单克隆抗体(MAbs) 的研制为解决这一问题提供了新的思路。但是鼠源单克隆抗体对人体有免疫原性，易产生 人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody，HAMA)，可诱发过敏反应，且不能有效激活 人体的生物效应功能，半衰期较短，影响单克隆抗体的治疗效果，其自身局限性极大地限制 了作为预防制剂在人体内的应用。80年代中期以来出现了第三代抗体_基因工程抗体，包括利用DNA重组技术对已 有的鼠源性单抗进行“人源化”和“小型化”改造，以及利用噬菌体抗体库技术筛选、克隆新 型单克隆抗体。1991年Winter等创立噬菌体抗体库技术，以大肠杆菌为宿主菌，丝状噬菌 体为表达和展示载体，使抗体及编码抗体的DNA，共同存在于宿主菌中。应用该技术，不需经 细胞融合，甚至不需要进行免疫，即可制备全人源、高特异性的抗体，可直接应用于体内治 疗，减少毒副作用的发生。噬菌体抗体库技术的发展依赖以下三项技术的发展(1)PCR技术的发展，使人们 可以用一组引物克隆出免疫球蛋白的全套可变区基因，特别是RT-PCR的出现，使克隆出具 有转录活性的可变区基因变得简捷、有效；(2)大肠杆菌分泌有结合能力的免疫球蛋白分 子片段获得成功，抗体分子的抗原结合部位由轻链和重链的可变区组成，依赖于复杂的立 体构象，一般淋巴细胞内这一立体构象主要是在粗面内质网形成，而大肠杆菌的周质腔可 提供类似粗面内质网的环境，可变区分子在细菌信号肽的引导下分泌到周质腔，进行立体 折叠、二硫键形成和肽链的双体化，最终形成具有抗原结合活性的抗体分子片段，这使在原 核细胞中表达抗体库筛选特异性抗体成为可能；(3)噬菌体展示技术的建立，即肽链与噬 菌体外壳蛋白(蛋白III或蛋白VIII)融合表达在噬菌体的表面，通过“吸附-洗脱-扩 增”，可筛选到靶分子的配体肽链，尤其是噬菌体随机展示文库技术的建立和发展，促使了 噬菌体抗体库技术的产生。
在抗狂犬病被动免疫制剂研究领域，科学家进行了多年探索，值得关注的是 (1) 1989年Schumacher等制备了多株针对RV糖蛋白、核蛋白的鼠源单克隆抗体，但因来源 于鼠，难以应用于临床；(2)2001年，Ray K等成功利用噬菌体抗体库筛选出具有中和活性 的抗狂犬病病毒糖蛋白的单链抗体；(3) 2004年，闭兰等从半合成噬菌体抗体库筛选出狂 犬病病毒G蛋白的人单链抗体A12，具有完全中和病毒能力；(4) Bakke等研究小组，先是通 过体外和体内中和效价试验的等鉴定出一株高中和活性、高亲和性并且对各型毒株均有作 用和逃逸突变体的CR57，又通过噬菌体展示技术筛选到一株抗体，然后直接混合使用这两 株MAbs，并同HRIG进行比较试验，结果表明，MAbs与HRIG在暴露后预防中的作用相仿，且 与多株狂犬病毒有良好的交叉反应性，证明了重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体的实际可 用性；(5)TadasUkeAnd0等也报道了从Fab噬菌体抗体库中筛选到两株具有中和活性的抗 体EP5G3和GD2D12,并用RFFIT法对抗体的中和活性鉴定；(6) 2009年Houimel M等也报 道了从重组免疫抗体库中筛选到三株Fab抗体。以上报道的人源化或全人源抗体取得了突 破性成就，对将来替代血源性RIG奠定了良好的基础，但是上述制备的抗体仅通过RFFIT法 或FAVN法证明具有中和活性，未在动物模型上进行进一步研究；或虽经动物实验，但需要 开发成可应用于临床使用的药物还需要很多工作要开展。近年来，将小分子药物接入大分子载体，特别是纳米级聚合物粒子，制成纳米分子 前药，具有小尺寸效应、表面、界面效应、靶向作用及缓释作用等优势，不仅可以提高药效， 还可以减轻不良反应，这就为生物制药研究提供了一个新的研究途径。利用纳米微粒制成 特殊药物或新型抗体，可方便地实现抗原或抗体分子的固定化进行局部定向治疗等，目前 较广泛应用于肿瘤医学、靶向治疗等方面。申请人检索了国内外文献，目前尚未见纳米化抗 体在狂犬病暴露后预防领域的发明专利或研究的报道。
发明内容
发明目的本发明针对本领域技术空白，提供一种人源抗狂犬病毒Fab抗体及其 与纳米粒子交联的方法和在制备治疗动物及人狂犬病暴露后药物中的应用。技术方案人源抗狂犬病毒Fab抗体，所述抗体的VH链具有SEQ ID NO. 1所示的 氨基酸序列，并且所述抗体的\链具有SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。上述的人源抗狂犬病毒Fab抗体，所述抗体的VH链具有SEQ ID NO. 2所示的核苷 酸序列。上述的人源抗狂犬病毒Fab抗体，所述抗体的八链具有SEQ ID N0.4所示的核苷 酸序列。上述抗狂犬病毒Fab抗体在制备动物及人狂犬病暴露后治疗药物中的应用。人源抗狂犬病毒Fab抗体与纳米粒子交联的方法，制备步骤为钙纳米粒子的制 备12. 5mmol/L CaCl2、12. 5mmol/LNaH2P04和15. 6mmol/L枸橼酸钠等体积混合，室温磁力 搅拌20-48h ；超声仪内超声处理l_3h ；在4°C条件下10，OOOrpm离心15min ；超声沉淀用 PBS悬浮得钙纳米粒子悬浮液；纳米交联纯化的Fab抗体加入上述悬浮液，所述抗体在悬 浮液中的浓度为45mg/L ；4°C条件下，磁力搅拌5-10h ；在4°C条件下10，OOOrpm离心15min ； 离心沉淀用双蒸水悬浮即为所交联的人源抗狂犬病毒Fab抗体钙纳米粒子。上述制备得到的纳米粒子交联抗狂犬病毒Fab抗体在制备动物及人狂犬病暴露后治疗药物中的应用。有益效果本发明通过噬菌体抗体展示技术筛选出一株高亲和力的针对狂犬病病 毒糖蛋白的人源抗狂犬病毒抗体Fab，该抗体通过间接酶联免疫吸附法、免疫印迹、间接免 疫荧光、免疫共沉淀及质谱等对抗体和抗原反应的特异性进行鉴定，结果表明Fab抗体能 够与狂犬病病毒结合；质谱分析表明其结合的蛋白为是狂犬病病毒糖蛋白。本发明制备磷酸钙纳米粒子，并对纳米粒子进行表征；磷酸钙纳米粒子与上述 制备的Fab抗体进行交联，获得纳米化抗体Fab-CPNPs。结果表明，纳米粒子平均直径为 260nm,与Fab抗体交联率获得的纳米化抗体Fab-CPNPs的交联率为55%。Fab抗体及其 纳米化抗体Fab-CPNPs通过快速荧光灶抑制试验(RFFIT)和荧光抗体中和试验(FAVN) 对抗体中和活性进行鉴定，结果表明RFFIT和FAVN法测得Fab抗体的中和效价分别为 200. llIU/mg和177. 7IU/mg ；将该抗体制备成纳米化抗体Fab-CPNPs后，用RFFIT和FAVN 法测得中和效价分别为246. 12IU/mg和307. 7IU/mg，其中和活力得到进一步提高。本发明制备的抗狂犬病病毒的Fab抗体及其纳米化抗体Fab-CPNPs通过狂犬病 病毒标准攻毒株CVS-24攻击昆明鼠，同时给予疫苗联合不同剂量的Fab抗体或纳米化 Fab-CPNPs抗体对小鼠进行暴露后预防实验，结果表明仅给予疫苗预防，不能提供足够的 保护；不同剂量的Fab、Fab-CPNPs对狂犬病暴露后的小鼠具有一定的保护作用；且8IU/kg 的Fab-CPNPs或40IU/kg的Fab提供的保护作用与WHO推荐的20IU/kg的HRIG存活率相 当(62. 5% )；统计学分析表明，40IU/kg 的 Fab 组、32IU/kg 及 40IU/kg 的 Fab-CPNPs 组的 存活率显著高于对照组(P < 0. 05)；而lmg/kg的Fab与lmg/kg的Fab-CPNPs注射剂量， 注射未攻毒昆明鼠组的存活率为100%，该结果表明抗体Fab或Fab-CPNPs是安全的。制备 的纳米化抗体在狂犬病暴露后治疗领域具有潜在的应用前景。
四
图lFab抗体基因的三轮PCR扩增产物分析，泳道1为VH ；泳道2为V k ；泳道3为 VA ；泳道4为CH1 ；泳道5为CK ；泳道6为CA ；泳道7为Fd ；泳道8为LK ；泳道9为LA ；泳 道10为Fab。图2phage_ELISA测定噬菌体抗体，22株抗体阳性。图 3SDS-PAGE (A 图)及 Western-blot (B 图)分析纯化的 Fab 抗体。图4ELISA鉴定Fab与狂犬病病毒CTN株蛋白结合情况。图5Fab的Western blot分析，泳道1为BHK-21细胞裂解物与Fab不能结合，泳 道2为CTN株狂犬病病毒粒子与Fab结合情况。图6Fab结合蛋白的肽质量指纹图谱。图7Fab的间接免疫荧光检测，Fab能够与感染病毒的BHK-21细胞结合出现荧光 (左)，而不能与未感染的BHK-21细胞结合(右)。
五具体实施例方式以下结合实例对本发明作进一步的描述，实施例仅用于对本发明进行说明，并不 构成对权利要求范围的限制，本领域技术人员可以想到的其他替代手段，均在本发明权利 要求范围内。
实施例1 一 .全人源抗狂犬病病毒Fab噬菌体抗体库的构建1.人源Fab基因的扩增取45位狂犬病疫苗免疫健康志愿者的外周血淋巴细胞提取总RNA，逆转录成 cDNA，用人源抗体的特异性引物(参照 Carlos F. Barbas III, Dennis R. Burton, Jamie K.Scott, Gregg J. Silverman. Phage display :A laboratory manual, lrd ed. New York Gold spring harbor laboratorypress，2004)扩增 VH、VK、VA 基因，同时以质粒 pComb3XTT 扩增CH1、CK，以pComb3X入为模板扩增CA ；再经过三次重叠PCR制备Fab基因片断；上述 PCR产物分别经琼脂糖凝胶电泳回收，经过凝胶回收试剂盒纯化后，获得约为1600bp Fab 片段，见图1。2.抗狂犬病病毒噬菌体抗体库的建立将Fab片断与pComb3XSS经Sfi I酶切、纯化并连接。连接产物通过10次电转化 导入宿主菌Ecoli.XLl-Blue，加入辅助噬菌体VCSM13过夜培养后，上清经PEG8000/NaCl沉 淀，制备抗狂犬病病毒Fab噬菌体抗体库。经计算，所构建的全人源抗狂犬病Fab噬菌体抗 体库的库容为约6.7X108。二.噬菌体抗体库的特异性富集筛选1.用于抗体库富集筛选的狂犬病病毒的制备采用灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒(纯度99%以上，武汉病毒所张爱华惠 赠)及其糖蛋白。2.噬菌体抗体库的特异性富集筛选用灭活的狂犬病病毒CTN株病毒粒子(5 u g/mL) 50 u L/孔，封闭处理后加入新鲜 的噬菌体抗体库，每孔100 u L，37°C湿盒孵育lh ；PBST缓冲液洗涤96孔板(第一轮洗涤10 次，以后每轮洗涤20次)，以去除未结合的噬菌体抗体；100 u L/孔甘氨酸-盐酸溶液(pH 2.2)洗脱lOmin，洗脱特异性结合的噬菌体抗体，加入50i!LlmOl/L Tris中和，使其保持 在pH 7.0左右；450iiL洗脱液感染及4mL对数生长期E. coli XLl_Blue混合，37°C水浴 30min ；力口 4mL SBU. 6u L Amp 于菌液中，37°C振摇 lh ；力口 2. 4ii L Amp 于菌液中，37°C振摇 lh ；力卩 lmL VCSM13、91mL SB 溶液、46yL Amp 于菌液中，37°C振摇 3h ；加 50 ii L KanUOOu L IPTG于菌液中，37°C振摇过夜；次日3，000g，4°C离心15min，转移上清至清洁无菌的锥形瓶 中，加50mLPEG/NaCl，冰上放置lh ；4°C、15000g离心15min，弃上清，控干离心管，以2mL含 1%BSA重悬沉淀，将重悬液转移至2mL EP管中，最高速度离心5min，转移上清至1. 5mL Ep 管中；重复以上筛选步骤，共进行五轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选。以纯化的狂犬病病毒粒子包被ELISA板，对所制备的抗狂犬病病毒Fab抗体库进 行亲和筛选。经过5轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选过程，噬菌体抗体收获率提高了 6. 03X 102 倍。3. phage ELISA 检测将最后一轮筛选得到的洗脱液感染E.coli XLl-Blue感受态细菌后铺于LB培养 板上(含终浓度100 U g/mL Amp)，37°C培养过夜；次日在60管试管中加入SB培养基2mL (含 终浓度100 u g/mLAmp+1 %葡萄糖)，从LB培养板随机挑取60个菌落分别接种于试管中， 250rpm，37°C振摇8h ；每管再加终浓度为1 X 109pfu辅助噬菌体VCSM13超感染，250rpm，37°C振摇培养2h ；每管加终浓度为ImM IPTG和70 y g/mL Kan，250rpm，37°C振摇培养过夜； 次日将60管试管中培养液取lmL加入60管Ep管中，10000g、4°C离心lOmin，取上清进行 ELISA检测；以狂犬病病毒蛋白包板，phage上清为一抗，HRP-Anti_M13为二抗，以PBS溶液 做为空白对照，取其阳性。从5次筛选后得到的细菌集落中随机挑选60个克隆，扩增培养 后培养上清加入包被狂犬病病毒粒子的ELISA板孔中，再加入抗phage抗体，显色。结果表 明，在随机挑选的60个克隆中，有22株克隆与狂犬病病毒粒子结合，见图2。4. Fab抗体基因的序列分析将上述鉴定正确的菌株测序作进一步比对分析和验证。上述阳性克隆经测序分 析，获得4株序列不同的Fab抗体，分别命名为Fab092、Fab093、Fab094、Fab095。并经中和 试验测定，Fab094具有中和活性(下述，以下称Fab抗体)，对其作进一步深入研究。三.Fab抗体的可溶性表达及纯化1. Fab抗体的可溶性表达将噬菌体克隆转化入E. coli TOPI OF' 200 u L,加入SB培养基20mL，1 : 100接 种，37°C振摇培养过夜；将lOmL过夜菌液加至lOOOmL SB培养基，1 100转接E. coli T0P1 OF'，37°C振摇培养至OD600约为1. 0 ；加入终浓度为0. lmmol/L的IPTG，250rpm,对Fab 我们分别采用了 37°C、30°C、25°C、20°C振摇培养16h ；12, 000rpm、4°C离心lOmin，取培养上 清备用。离心沉淀用50mL PBS悬浮；将上述重新悬浮的溶液，超声裂解后，再次12，OOOrpm、 4°C离心lOmin ；离心上清用0. 22 P m无菌微孔滤器过滤除菌。对Fab我们分别采用了 37°C、 30°C、25°C、2(TC进行了表达，SDS-PAGE及Western-blot结果表明，25°C该抗体在裂解上清 及培养基中表达。2.抗体的纯化用上样缓冲液平衡Protein L亲和层析柱；将无菌超声上清加入Protein L亲和 层析柱；上样后，用缓冲液再次平衡Protein L亲和层析柱；用洗脱缓冲液洗脱结合的蛋 白，收集蛋白峰，并用PH 9. OTris-HCl中和洗脱溶液至中性；将上述洗脱液用lOKDa的超滤 管进行浓缩，并用PBS置换洗脱缓冲液，SDS-PAGE及Western-blot结果表明，25°C该抗体上 清在26kD和30kD左右有二条目的条带，确定抗体有可溶性表达，，同时，Western blot结 果还证实，在细菌培养上清中也有蛋白表达，见图3。四.Fab抗体的鉴定1.间接 ELISA灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒以5 u g/mL的浓度100 u L/孔包被ELISA板， 37°C湿盒作用2. 5h ；PBST洗3次，5min/次；拍干；用含5%脱脂乳的PBS封闭，37°C湿盒作 用2. 5h或37°C过夜；PBST洗3次，5min次，拍干；加入制备的纯化抗体Fab，同时设免疫志 愿者血清及正常未免疫血清为阳性和阴性对照，37°C湿盒作用90min ；PBST洗3次，5min/ 次，拍干；加入1 2000稀释的HRP标记的羊抗人抗体(Fab特异性)，37°C湿盒作用90min， 以TMB显色，设免疫志愿者血清及正常未免疫血清为阳性和阴性对照。以P/N彡2. 1为阳 性判定标准。结果表明，Fab及志愿者血清能够与狂犬病病毒结合，而未免疫血清并不能与 病毒结合，见图4。2.免疫印迹 以灭活的狂犬病病毒CTN株纯化病毒、BHK-21细胞裂解物为电泳样品进行SDS-PAGE ；按常规方法将蛋白转印于NC膜上；取出硝酸纤维素膜，作好标记，放入平皿中， 用PBST (含5%脱脂奶粉)室温封闭过夜；PBST洗3次，5min/次；加入制备的纯化抗体Fab， 37°C湿盒作用90min ；PBST洗3次，5min/次；加入1 2000稀释的HRP标记的羊抗人抗体 (Fab特异性)，37°C湿盒作用90min ；PBST洗3次，5min/次；加入DAB显色，待出现条带后 双蒸水终止反应。结果表明，Fab能与狂犬病病毒结合(67KDa)，而不能与BHK-21细胞裂解 物结合，见图3-2。结果证实，Fab能够与狂犬病病毒粒子中的67KD的蛋白相结合，而不能 与培养该病毒的BHK-21细胞蛋白结合，见图5。3.免疫共沉淀取 150iiL rProteinG-Resin，6000rpm 离心 5min，弃上清加入 150ii L PBS 重悬；用 PBS 洗 2 次，后用 90 ii L PBS 重悬 rProteinG-Resin，加入 20 ii L Fab (lmg/mL)，4°C摇动 2h ； 用PBS洗Beads两次，加纯化的狂犬病病毒粒子20iiL(lmg/mL) ；4°C振摇过夜；将病毒-抗 体-rProteinG-Resin复合物，4°C，3000rpm离心5min，弃上清；用PBS重悬沉淀，4°C摇动 20min, 4°C、3000rpm离心5min，弃上清。重复用PBS再洗次，最后一次弃PBS，保留沉淀；加 入30ii L的1XSDS加样缓冲液到上一步骤的沉淀中，煮沸5min，4°C、6000rpm离心5min ； 取上一步骤离心所得上清，进行Western Blotting检测，一抗为商品化的鼠抗糖蛋白单克 隆抗体MAb C86307M(Meridian life science，US)，二抗为 HRP 标记的羊抗鼠 IgG，Western Blotting方法见前。4.质谱分析免疫共沉淀中与Fab相结合的目的条带对应的在SDS-PAGE凝胶上的条带抠出 进行质谱分析。将凝胶片溶解在0. 三氟乙酸(TFA)中，脱盐，用ZipTips浓缩。蛋 白溶液(0. 5 u L)与 0. 5 li L 白勺基石出液(5mg/mL a -cyano-4-hydroxycinnamic acid in 30% acetonitrile/0. 1 % TFA)混合，点样，自然干燥。样品进行了质谱分析(Bruker Daltonics, Leipzig, Germany)。在 MASCOT 数据库中搜索目的蛋白(http://www. matrix science, com ；Matrix Science，UK)。质谱分析显示，该抗体结合蛋白为狂犬病病毒糖蛋白， 见图6。5.间接免疫荧光检测将BHK-21细胞培养于6孔板中，使细胞附着板底上；24h后用Flury (军事医学 科学院军事兽医研究所扈荣良研究员提供)感染上述BHK-21细胞；同时设阴性对照孔， 即不感染病毒；感染72h后PBS清洗3次，分别加入经100倍稀释的Fab ；室温孵育2h，用 PBST (含0. 05%Tween 20的PBS)洗涤3次；加入FITC标记的抗人的二抗(1 100稀释)， 室温孵育 lh ；再用 PBST 洗涤 3 次，用 H0ECHST 33342(1 10000, Do jindo, Japan)染核；用 荧光显微镜在400倍放大倍数下观察，细胞显示强绿色荧光的判为阳性。结果显色狂犬病 病毒感染的细胞孔出现绿色荧光，而未被病毒感染的细胞孔没有出现绿色荧光，见图7。五.纳米化Fab-CPNPs抗体的制备1.钙纳米粒子的制备160mg CaCl2、160mg NaH2P04和160mg枸橼酸钠加入180mL双蒸水中，室温磁力搅 拌48h ；超声仪内超声处理lh ；在4°C条件下10，OOOrpm离心15min ；超声沉淀用PBS悬浮。2.纳米粒子的表征用透射电镜观察钙纳米粒子形态、直径。粒径分析仪检测钙纳米粒子直径分布。结果35 %钙纳米粒子直径在220nm以内，85 %直径在440nm以内，99 %直径在900nm以内，长 径290nm，宽径240nm，平均直径为260nm。3.纳米化Fab-CPNPs抗体的制备将9mg纯化的Fab抗体加入上述悬液；4°C条件下，磁力搅拌8h，使纳米粒子与抗 体分子充分结合；在4°C条件下10，000rpm离心15min ；取离心上清，测量蛋白浓度，计算上 清中总蛋白质量；离心沉淀用双蒸水悬浮；即为所交联的Fab钙纳米粒子(Fab-CPNPs)。4. Fab-CPNPs的包装率的计算用以下公式计算Fab-钙纳米粒子(Fab-CPNPs)结合率结合率(％)=(总Fab的质量-离心上清中Fab的质量)/总Fab的质量X 100%。 经计算钙纳米粒子的荷载抗体的荷载率为55%。六.Fab及Fab-CPNPs体外中和活性分析1.快速荧光灶抑制试验(RFFIT)抗狂犬病血清标准品将国家抗狂犬病血清标准品稀释成效价为2. OIU/mL ；病毒的准备BSR细胞用胰酶消化，每2 3d传代一次；将该细胞稀释成约3X106 于3mL含3%牛血清的DMEM液中。加IX 106感染单位的CVS-11狂犬病毒于上述3mL的 细胞悬液中，混勻，37°C吸附15min，期间振摇细胞悬液一次，使其充分吸附。补加lOmLDMEM 培养液并接种培养瓶，待100%细胞感染后24h收获上清。收获的上清以5000r/min离心 lOmin，分装成每个小试管0. 5mL。冻存于_70°C备用；病毒的滴定取一管在-70°C冻存的毒种迅速溶解后用DMEM培养基做10倍系列 稀释(lO-LlO-8)。各稀释度取50 uL加入96孔培养，每孔加0. 2mL细胞(约5 X 104/0. 2mL)， 在含5%C02，37°C条件下培养20h。吸去上清，避免触碰细胞面，用丙酮固定细胞，进行免疫 荧光染色，并进行显微镜下荧光灶记数，要求病毒在每0. lmL中含104感染单位；取抗体Fab及Fab-CPNPs分别稀释成lmg/mL ；在96孔细胞培养板内加入10%灭 活胎牛血清的DMEM培养基100 u L ；将抗体Fab或Fab-CPNPs样品或标准品50 y L分别加入 96孔细胞培养板内；混合后再取50 y L混合液置于下一孔内；每孔加入50 y L能致80%细 胞感染的CVS病毒悬液；同时设空白孔对照，即不加入CVS病毒悬液，和病毒对照孔，即不加 入抗体，仅加入病毒；轻拍细胞板，混勻后在含5% C02，37°C条件下孵育lh，进行中和；取出 96孔细胞培养板，每孔加入1 X 106/mL的BSR细胞50 u L，轻拍细胞板，混勻后在含5% C02， 37°C条件下孵育24h ；细胞长成单层，取出96孔细胞培养板，将孔中培养液甩入消毒液的盆 中，在吸水纸上轻拍板子，吸去多余水分；每孔加入200 y L的PBS溶液，甩出拍干后，每孔加 入预冷的80%丙酮50 u L，室温固定30min，去掉丙酮，让各孔干燥；每孔加入工作难度的荧 光标记的鼠抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体50y L，37°C条件下孵育30min ；甩出液体，PBS 洗板2-3次；每孔加入80 %的甘油50 u L，待甘油布满孔底后，将培养板倒置于吸水纸上，吸 去多余甘油；在荧光显微镜下观察荧光情况；计算出能致50%细胞感染的样品及标准品的稀释度，通过Reed-Muench法计算 ED50，计算出样品的狂犬病中和抗体的效价。结果表明，用RFFIT检测Fab的中和效价为200. llIU/mg ；而用FAVN检测中和效 价为177. 7IU/mg0而Fab092、Fab093和Fab095与狂犬病病毒CVS-11中和效价为0。2.荧光抗体中和试验(FAVN)
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标准阳性参照血清的稀释取适量的标准阳性参照血清加入DMEM培养基中，稀释 成中和效价为0. 5IU/mL的标准参照血清；取抗体Fab及Fab-CPNPs分别稀释成lmg/mL ；在96孔细胞培养板内加入10%灭 活胎牛血清的DMEM培养基100 u L ；将抗体Fab或Fab-CPNPs样品或标准品50 y L分别加入 96孔细胞培养板内，同时做4个复孔；中和加入100TCID5(1的CVS-11于待测样品中，同时 设空白孔对照，即不加入CVS病毒悬液，和病毒对照孔，即不加入抗体，仅加入病毒；37°C、 5%C02培养箱中孵育lh;取生长单层的BHK细胞，经胰酶消化后，用含2 %小牛血清的DMEM培养基充分悬 浮，使细胞浓度调整为4X105个/mL，50 iiL/孔。(每孔约2X 104个细胞)；37°C，5%C02 培养箱中培养48h;取出细胞培养板，将培养基甩入污物盘，盘内预先盛有足量的的NaOH溶液； 洗板3次每次5min ；加入80%的预冷丙酮固定；弃掉丙酮，洗板3次，每次5min ；染色按 1 128的工作浓度，以PBS稀释荧光素标记的抗狂犬病毒核蛋白抗体，按2%的量加入 的伊文斯蓝溶液，混合均勻后，每孔滴加50y L，37°C湿盒内温育lh ；弃去荧光抗体溶液，以 PBS洗板3次，每次5min ；荧光显微镜下观察结果凡有不少于1个荧光细胞的孔，记为“ + ”， 无荧光细胞的记为“_”；根据Karber法公式计算出血清的ED5CI(50%终点稀释度)；结果判定免疫水平或 者抗体效价的测定是通过与0. 5IU参照血清的ED5(i值的比较而获得。如果待检样品的ED5(i <参照血清的ED5(1，那么此待检血清的效价< 0. 5IU/mL ；如果待检样品的ED50 >参照血清 的ED5(1，那么此待检血清的效价> 0. 5IU/mL。研究结果表明，用RFFIT检测Fab-CPNPs的中和效价为246. 12IU/mg ；而用FAVN检 测结果为307. 7IU/mg。而Fab092、Fab093和Fab095与狂犬病病毒CVS-11中和效价为0。七.Fab及Fab-CPNPs对狂犬病暴露后预防作用10-12g昆明雌性小鼠(清洁级)152只，随机分成19组，每组8只。1. Fab对狂犬病暴露后小鼠的预防作用第1-10组小鼠于0天前肢肌肉注射100LD50剂量的狂犬病病毒CVS-24株病毒 0. 05mL (染色确定)，第11组不注射狂犬病病毒，作为抗体Fab的安全性试验组别；在小鼠攻毒3h后，各组按如下方式进行预防处理第1组不做任何预防处理；第2 组在其攻毒的另一前肢注射狂犬病病毒疫苗，剂量为1头份/25kg ；第3组组在其攻毒部位 周围注射20IU/kg的人抗狂犬病免疫球蛋白(HRIG)，在其攻毒的另一前肢注射狂犬病病毒 疫苗，剂量为1头份/25kg ；第4组在其攻毒部位周围注射20IU/kg的抗体Fab，不注射狂犬 病疫苗；第5-10组在其攻毒部位周围分别注射0.5，2，8，20，32，40IU/kg的抗体Fab ；在其 攻毒的另一前肢注射狂犬病病毒疫苗，剂量为1头份/25kg ；第11组在其前肢注射200IU/ kg(lmg/kg)的抗体Fab，不注射疫苗作为安全性试验组。对昆明鼠进行暴露后预防处理后观察28d。第1组不做任何预防处理，存活率为 12. 5% (1/8)，说明本研究采用的狂犬病暴露模型是成功的；第2组仅给予疫苗预防，存活 率为25% (2/8)，表明仅注射疫苗不能提供足够的保护；第3组给予疫苗和20IU/kg的HRIG 进行预防，存活率为62. 5% (5/8)；第4组仅给予20IU/kg Fab-CPNPs进行预防，存活率为 25% (2/8)，表明单独使用抗体预防也不能提供保护；第5-10组给予疫苗联合0.5、2、8、20、32、40IU/kg 的 Fab 进行预防，其存活率分别为 37. 5% (3/5),37. 5% (3/8),37. 5% (3/8)、 37.5% (3/8), 50% (3/8), 75% (3/8)，表明疫苗联合不同剂量的Fab能够提供不同的保护 率；第11组不注射狂犬病病毒，仅注射Fab抗体，存活率均为100%。2. Fab-CPNPs对狂犬病暴露后小鼠的预防作用小鼠狂犬病暴露及预防方法如下第1-3组与Fab对狂犬病暴露后预防试验组第 1-3组，分别为不预防组、疫苗预防组、HRIG联合疫苗预防组；处理方式也与Fab相一致；第 12-18组小鼠于0天前肢肌肉注射100LD50剂量的狂犬病病毒CVS-24株病毒0. 05mL(染 色确定)，第19组不注射狂犬病病毒，作为抗体Fab-CPNPs的安全性试验组别；在小鼠攻 毒3h后，各组按如下方法进行预防处理第12组在其攻毒部位周围注射20IU/kg的抗 体Fab-CPNPs，不注射狂犬病疫苗；第13-18组在其攻毒部位周围分别注射0.5，2，8，20， 32，40IU/kg的抗体Fab-CPNPs ；在其攻毒的另一前肢注射狂犬病病毒疫苗，剂量为1头份 /25kg ’第19组在其前肢注射200IU/kg(lmg/kg)的抗体Fab-CPNPs，不注射疫苗作为安全 性试验组。对昆明鼠进行暴露后预防处理后观察28d。第1-3组与2. 2Fab对狂犬病暴露后 不预防组、疫苗预防组、HRIG联合疫苗预防组结果公用，即相一致；分别为第1组不作任何 预防组，存活率为12. 5% (1/8)，说明本研究采用的狂犬病暴露模型是成功的；第2组仅给 予疫苗预防，存活率为25% (2/8)，表明仅注射疫苗不能提供足够的保护；第3组给予疫苗 和20IU/kg的HRIG进行预防，存活率为62. 5% (5/8)；第4组仅给予20IU/kg Fab-CPNPs 进行预防，存活率为25% (2/8)，表明单独使用抗体Fab-CPNPs不能提供保护；第13-18 组给予疫苗联合0. 5、2、8、20、32、40IU/kg的Fab进行预防，其存活率分别为25% (2/5)、 50% (4/8),62. 5% (5/8),62. 5% (5/8), 75% (6/8), 75% (6/8)，表明疫苗联合不同剂量的 Fab-CPNPs能够提供不同的保护率；第19组不注射狂犬病病毒，仅注射Fab-CPNPs抗体，存 活率均为100%。表lFab联合疫苗对昆明鼠狂犬病暴露后预防实验结果。 表2Fab_CPNPs联合疫苗对昆明鼠狂犬病暴露后预防实验结果。
权利要求
人源抗狂犬病毒Fab抗体，其特征在于所述抗体的VH链具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，并且所述抗体的VL链具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的人源抗狂犬病毒Fab抗体，其特征在于所述抗体的VH链具有 SEQID NO. 2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的人源抗狂犬病毒Fab抗体，其特征在于所述抗体的\链具有 SEQID NO. 4所示的核苷酸序列。
4.权利要求1 3任一所述抗狂犬病毒Fab抗体在制备动物及人狂犬病暴露后治疗药 物中的应用。
5.人源抗狂犬病毒Fab抗体与纳米粒子交联的方法，其特征在于制备步骤为a.钙纳米粒子的制备12.5mmol/L CaCl2、12. 5mmol/L NaH2P04 禾口 15. 6mmol/L 枸橼酸 钠等体积混合，室温磁力搅拌20-48h ；超声仪内超声处理l_3h ；在4°C条件下10，OOOrpm离 心15min ；超声沉淀用PBS悬浮得钙纳米粒子悬浮液；b.纳米交联纯化的Fab抗体加入上述悬浮液，所述抗体在悬浮液中的浓度为45mg/L； 4°C条件下，磁力搅拌5-10h ；在4°C条件下10，OOOrpm离心15min ；离心沉淀用双蒸水悬浮 即为所交联的人源抗狂犬病毒Fab抗体钙纳米粒子。
6.权利要求5所制备得到的纳米粒子交联抗狂犬病毒Fab抗体在制备动物及人狂犬病 暴露后治疗药物中的应用。
全文摘要
人源抗狂犬病毒Fab抗体及其与纳米粒子交联的方法和应用，所述抗体的VH链具有SEQID NO.1所示的氨基酸序列，并且所述抗体的VL链具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。本发明制备的抗狂犬病病毒的Fab抗体及其纳米化抗体Fab-CPNPs通过狂犬病病毒标准攻毒株CVS-24攻击昆明鼠，同时给予疫苗联合不同剂量的Fab抗体或纳米化Fab-CPNPs抗体对小鼠进行暴露后预防实验，结果表明仅给予疫苗预防，不能提供足够的保护；不同剂量的Fab、Fab-CPNPs对狂犬病暴露后的小鼠具有一定的保护作用。制备的纳米化抗体在狂犬病暴露后治疗领域具有潜在的应用前景。
文档编号A61P31/14GK101863978SQ20101017382
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者冯振卿, 刘新建, 朱进, 林红, 管晓虹 申请人:中国人民解放军南京军区军事医学研究所