专利名称：利用反义iap寡聚物和化疗剂治疗增生性疾病的制作方法
利用反义IAP寡聚物和化疗剂治疗增生性疾病本申请是申请日为2004年10月29日、申请号为200480039601. 8 (国际申请号为 PCT/CA2004/001900)、发明名称为“利用反义IAP寡聚物和化疗剂治疗增生性疾病”的发明 申请的分案申请。
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本发明涉及癌症及其它增生性疾病的治疗。一种细胞死亡的方式被称为凋亡，或程序性细胞死亡。凋亡通常是发育和维持健康组织的正常部分。这一过程可能发生的很快，以至于难以检测到。现在已经知道凋亡路径在胚胎发育，病毒致病，癌症，自身免疫紊乱，神经变性疾 病和其它疾病中起关键性的作用。凋亡反应衰竭牵涉到癌症，自身免疫紊乱，例如红斑狼疮 和多发性硬化的发展和病毒感染，其中病毒感染包括那些与疱疹病毒，痘病毒和腺病毒相 关的病毒感染。近年来，凋亡在癌症中的重要性已经变得明朗。在二十世纪七十年代后期促生长 致癌基因的鉴定引起了对细胞增殖几乎普遍的聚焦关注，使细胞增殖支配癌症生物学研究 多年。长期存在的信条一直认为，抗癌症治疗应优先靶向相对于”正常细胞"的快速分裂 的癌细胞。这种解释并不全然令人满意，因为一些生长迟缓的肿瘤容易治疗，而许多快速分 裂的肿瘤类型却对抗癌治疗具有极强的抵抗力。现在癌症领域的发展已经通向了癌症生物 学的新模式，在新模式中认为不能执行正常路径的程序性细胞死亡导致了肿瘤形成。正常 细胞可以通过各种生长因子从邻近细胞接受连续的反馈，当从该环境中移出时，正常细胞 会"自杀"。由于某种原因，癌细胞会忽视这些命令，继续不适当的增殖。现在相信许多癌 症治疗，包括放疗和许多以前认为通过使细胞受损起作用的化疗，实际上是通过触发凋亡 起作用。虽然这种抗性的决定因素现在仍在调查中，但正常细胞类型和癌细胞类型都显示 出对凋亡触发信号广泛的敏感性。许多正常细胞对半数致死剂(sub-lethal)量的放射线 或细胞毒性化学制剂的反应是出现暂时的生长延滞，而附近的癌细胞此时则会发生凋亡。 在给定剂量出现的差异效果为成功的抗癌治疗提供了决定性的治疗窗。因此，肿瘤细胞对 凋亡的抗性以癌症治疗失败的主要原因出现并不令人惊讶。已经鉴定了几种有效的能抑制凋亡的内源性蛋白质，包括哺乳动物中的Bcl-2和 IAP蛋白家族。IAP家族的某些成员可直接抑制终末效应器——胱冬酶(caspases)，即参与 执行细胞死亡的casp-3和casp-7，以及关键的线粒体起始胱冬酶——casp-9, casp-9对介 导癌症化疗诱导的细胞死亡很重要。IAPs是唯一已知的内源胱冬酶抑制剂，因此在调节凋 亡中起重要作用。已经假设IAPs促进了一些癌症的发展，而且在MALT淋巴瘤中已经鉴定出涉及一 个特别IAP(cIAP2/HIAPl)的假设的表示原因的染色体易位。近来在患有急性髓性白血病 的患者中已经显示升高的XIAP，预后差和存活时间短之间存在相关性。而且，XIAP在NCI 小组的许多肿瘤细胞系中都呈高度过量表达。因此，需要改进的癌症治疗方法，特别是那些能够诱导癌细胞发生凋亡，并不考虑这种细胞中提供的抗凋亡信号的治疗方法。发明概述通常，本发明描述了有用的诱导细胞内凋亡的方法。本发明的方法在治疗癌症及其它增生性疾病方面有用。本发明描述了一种通过施用反义IAP核碱基(nucleobase)寡聚物和化疗剂治疗 患有增生性疾病，例如癌症的患者的方法。可同时或在彼此相距28天内施用(例如，在21 天内，14天内，7天内，1天内或1小时内)化疗剂和反义IAP核碱基寡聚物，施用的总量足 以治疗患者。反义IAP核碱基寡聚物会减少产生的IAP蛋白的量，使通常表达IAP的细胞 发生凋亡。通过提供特定地与一种或多种编码IAP的多核苷酸杂交的核碱基寡聚物就可以 实现这一点。核碱基寡聚物与IAP多核苷酸(例如RNA，DNA)的特异性杂交会干扰IAP多 核苷酸的正常功能，因此会降低产生的IAP蛋白的量。通过特定地与靶目标杂交调整靶核 酸功能的核酸分子一般被称为"反义治疗分子"。可以使用任何能降低IAP表达水平的反义IAP核碱基寡聚物，一方面，核碱基寡聚 物长度为八到三十个碱基，并包括选自SEQ ID NOs :1-99，143，147，151，163-260，287，289 和300-460的序列的至少八个连续碱基。在某些实施例中，核碱基寡聚物包括选自SEQ ID NOs :1-99，143，147，151， 163-260，287，289和300-460的序列核碱基寡聚物。希望是由上述的一个或多个SEQ ID NOs.组成(或基本由其组成)。例如，核碱基寡聚物可以包括选自SEQ ID NOs 97,98,99, 143，147，151，287 和 289，SEQ IDNOs 300-389，或 SEQ ID NOs 390-460 的序列。在一个特 别合乎需要的实施例中，本发明描述了具有十一个DNA残基的核碱基寡聚物，其中在DNA 残基两侧都侧接了四个2' -0-甲基RNA残基，核碱基寡聚物由下列序列中的一个组成 5' -AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3‘ (SEQ ID NO 155) ；5' -ACACGACCGCTAAGAAACA-3‘ (SEQ ID NO 16) ； 5 ‘ -ACAGGACTACCACTTGGAA-3 ‘ (SEQ ID NO 157)； 5 ‘ -UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3 ‘ (SEQ ID NO 27) ；5 ‘ -GCUGAGTCTCCATATUGCC-3 ‘ (SEQ ID NO 141) ；5 ‘ -UCGGGTATATGGTGTCUGA-3 ‘ (SEQ ID NO 41) ；5 ‘ -AAGC ACTGCACTTG⑶CAC-3‘ (SEQ ID NO 47) ；5' -CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3‘ (SEQ ID NO 51)； 5' -ACCCTGGATACCATTUAGC-3‘ (SEQ ID NO 63) ；5' -U⑶CAGTACATGTTGGCUC-3‘ (SEQ ID NO: 161)禾口 5' -UGCACCCTGGATACCAUUU-3‘ (SEQ ID NO 151)。在另一个实施例中，反义IAP核碱基寡聚物的长度可达30碱基，并包括选自SEQ ID NOs 461-490的序列的至少八个连续碱基。能够与化疗剂结合施用的其它反义IAP核碱基寡聚物是那些在高严谨条件下能 与编码IAP多肽的多核苷酸杂交的寡聚物，其中IAP多肽选自NAIP(Bircl)，HIAPl (cIAP2， API2, MIHC, hITA), HIAP2(cIAPl, MIHB)， XIAP(hILP, hILPl, MIHA, API3)，存活蛋白 (survivin) (TIAP, MIHD, API4)，livin (KIAP, ML-IAP, cIAP3, HIAP3)禾口 hILP2 (Ts—IAP， TIAP)。在本发明的方法中使用的核碱基寡聚物可以包括至少一个修饰键(例如硫代磷 酸酯，磷酸甲酯，磷酸三酯，二硫代磷酸酯或phosphoselenate连接)，修饰的碱基(例如 5-甲基胞嘧啶)，和/或修饰的糖部分(例如2'-氧-甲氧乙基或2'-氧-甲基)。在 一个实施方案中，寡聚物是嵌和寡聚物(例如，包含通过硫磷酰或磷酸二酯键连接在一起的DNA残基的寡核苷酸，其中DNA残基的两侧都侧接了至少一个，两个，三个或四个通过硫磷酰连接在一起的2'-氧-甲基RNA残基)。另一个方面，本发明描述了增强细胞内凋亡的方法。这些方法包括同时或在彼此 相距28天内给细胞施用反义IAP核碱基寡聚物和化疗剂的步骤，施用的总量足以增强凋 亡。细胞可以在体外(ex vivo)或在活体内。在一个实施方案中，细胞是癌细胞(例如人 癌细胞)，淋巴或骨髓来源的细胞。癌症可以是，例如急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急 性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性髓单核细胞性白血病、急性单核细胞 性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、骨髓发育不良综合征、慢性淋 巴细胞性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、何杰金(Hodgkin's)病、Waldenstrom氏巨球 蛋白血症、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、 淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠 癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳 头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细 胞瘤、胚胎癌、Wilm氏瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经 胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神 经瘤、少突神经胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑(脊)膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤或成视网膜 细胞瘤。治疗癌症时，同时也施用一种或多种另外的化疗剂，生物效应调节剂和/或化学致 敏剂是可取的。希望的情形是施用核碱基寡聚物的28天内施用一种或多种这些制剂。
可以通过相同或不同的途径来施用化疗剂和核碱基寡聚物。可以使用任何能使目 的位点药物达到有效量的给药途径，特别可取的途径是静脉内施用和瘤内施用。另一方面，本发明描述了包括化疗剂和反义IAP核碱基寡聚物的药物组合物，其 中化疗剂和反义IAP核碱基寡聚物的总量加在一起足以治疗患有增生性疾病(例如癌症) 的患者。如果需要，药物组合物可以更进一步地包括另外的组分(例如胶态分散系统)。本发明也描述了通过给患者施用化疗剂和催化RNA分子，或编码这种催化RNA分 子的表达载体来治疗患有增生性疾病，例如患有癌症，淋巴组织增生紊乱的患者的方法，其 中化疗剂和催化RNA分子可同时施用，或在彼此相距28天内施用，它们的总量加在一起足 以治疗患者。在可取的实施例中，催化RNA分子包括，在其结合臂中，至少八个连续的相当 于反义IAP核碱基寡聚物的碱基(例如表2，3，7，8和9中的任何一个的碱基序列)。希望 的RNA分子可以位于锤头状基序中，也可以位于发夹结构，δ肝炎病毒，组I内含子，VS RNA 或RNaseP RNA基序中。本发明也描述了通过给患者施用化疗剂和具有21-29个核碱基的双链RNA分子 来治疗患有癌症或淋巴组织增生紊乱的患者的方法，其中至少八个连续的核碱基相当于反 义IAP核碱基寡聚物(例如表2，3，7，8和9中的任何一个的碱基序列)。可同时或在彼此 相距28天内施用化疗剂和双链RNA分子，使用的总量加在一起足以治疗患者。另一方面，本发明也描述了通过给患者施用化疗剂和具有50-70个碱基的双链 RNA分子来治疗患有癌症或淋巴组织增生紊乱的患者的方法，其中RNA分子具有一个长度 为21-29个碱基的第一域，碱基包含相当于反义IAP核碱基寡聚物(例如表2，3，7，8和9 中的任何一个的碱基序列)的至少八个连续的核碱基；与第一域互补的第二域以及位于第一域和第二域之间，使第一域和第二域能形成双链RNA分子的环状域。可同时或在彼此相距28天内施用化疗剂和双链RNA分子，施用的总量加在一起足以治疗患者。本发明也描述了几种试剂盒。这种试剂盒包括(i)长度为八到三十个核碱基之间 的反义IAP核碱基寡聚物；(ii)化疗剂；和(iii)给患有增生性疾病的患者施用化疗剂和 反义IAP核碱基寡聚物的说明书，其中化疗剂和反义IAP核碱基寡聚物的总量加在一起足 以治疗增生性疾病。本发明的另一个试剂盒包括(i)长度为八到三十个碱基之间的反义IAP核碱基寡 聚物；(ii)给患有增生性疾病的患者施用化疗剂和反义IAP核碱基寡聚物的说明书，其中 化疗剂和反义IAP核碱基寡聚物的的总量加在一起足以治疗增生性疾病。然而本发明的另一个试剂盒包括(i)本发明的组合物(如上所述)；(ii)给患有 增生性疾病的患者施用组合物的说明书，其中组合物的量足以治疗增生性疾病。“核碱基寡聚物"指包括至少八个通过连接基团连接在一起的核碱基形成的链 的化合物。天然和非天然的寡核苷酸，修饰或未修饰的，以及寡核苷酸模拟物，例如肽核酸 (PNA)，锁核酸(locked nucleic acids) (LNA)和阿拉伯核酸(arabinonucleic acid) (ANA) 都包括在该定义的范围内。在本发明的核碱基寡聚物中可以使用多种核碱基和连接基团， 包括下文标题为"寡核苷酸及其它核碱基寡聚物"的部分中详细描述那些核碱基和连接 基团。“蛋白质"或"多肽"或"多肽片段"指不论是否发生了翻译后修饰(例如糖 基化作用或磷酸化作用)的任何超过两个氨基酸的链，它构成天然多肽或肽的全部或一部 分，或者构成非天然多肽或肽。凋亡指细胞死亡的过程，在该过程中，濒死细胞显示出一组容易表征的生物化学 标志，包括细胞膜起泡，细胞体皱缩，染色质凝缩和DNA梯状条带(laddering)。‘‘ IAP基因〃指具有至少一个BIR域，通过其它胞内或胞外递送方法供给 时能调整(抑制或增强)细胞或组织凋亡的多肽的编码基因(例如，参见美国专利 No. 5，919，912)。在优选实施例中，IAP基因是与人或鼠XIAP，HIAPl或HIAP2 (美国专利 No. 6，156，535中对每一个都进行了描述)中的至少一个具有大约50%或更高核苷酸序列 同一性(例如至少85%，90%或95%)的基因。优选的测定同一性的序列区域是编码至少 一个BIR域和锌指域的区域。哺乳动物IAP基因包括分离自任何来源的哺乳动物的核苷酸 序列。优选的哺乳动物是人。“ IAP蛋白〃或〃 IAP多肽〃指IAP基因编码的多肽或其片段。IAP多肽包括 NAIP(Bircl)，HIAPl (cIAP2, API2, MIHC, hITA)，HIAP2(cIAPl, MIHB)，XIAP(hILP, hILPl, MIHA, API3)，存活蛋白(survivin) (TIAP, MIHD, AP14)，livin(KIAP, ML-IAP, cIAP3HIAP3) 和 hILP2(Ts-IAP，TIAP)。“ IAP生物活性〃指IAP多肽在体内或体外产生的任何活性。“增强凋亡"指增加给定的细胞群体(例如癌细胞、淋巴细胞、成纤维细胞，或任 何其它细胞)中发生凋亡的细胞的数量。应理解在一个给定的测定方法中，增强凋亡的化 合物产生的凋亡增强程度会发生变化，但本领域技术人员能够确定统计学上显著的凋亡水 平变化，而该变化能鉴定出IAP限制的能增强凋亡的其它核碱基寡聚物。优选地，"增强 凋亡"指相对于未施用本发明的核碱基寡聚物，但其它处理的方式实质上相似的情形，发生凋亡的细胞数目增加10%，更优选增加25%或更多，最优选增加至少一倍。监测的样品优选是那些通常凋亡不充分的细胞样品(即癌细胞)。这里描述了检测凋亡水平变化(即 增强或减弱)的方法。抑制靶基因(例如，IAP)表达的核碱基寡聚物指相对于未处理的对照组，能减少 至少大约5%的靶mRNA的量或靶mRNA编码的蛋白质的量的寡聚物，更优选减少至少大约 10%，25%，甚至50%。测量mRNA和蛋白水平的方法为本领域所熟知；在这里描述了示例 性方法。‘‘杂交〃指互补碱基之间的氢键连结，可以是Watson-Crick，Hoogsteen或反向 Hoogsteen氢键连结。例如腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢键形成配对的互补碱基。“增生性疾病"指由于不适当的高水平细胞分裂，不适当的低水平凋亡或两者引 起或导致的疾病。癌症是增生性疾病的一个实例，癌症的实例包括但不限于白血病(例 如急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、急 性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia)、急性髓单核细胞性白血病、急 性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性 白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(何杰金氏病，非何杰金氏病)、Waldenstrom氏巨球 蛋白血症、重链疾病以及实体瘤，例如肉瘤和癌(如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉 瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、 Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌(pancreatic cancer)、乳腺癌(breast cancer)、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、 乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚 胎癌、Wilm氏瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、 星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少 突神经胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑(脊)膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤或成视网膜细胞瘤)。 淋巴组织增生紊乱也被认为是增生性疾病。优选地，本发明的方法中使用的核碱基寡聚物存在于一般不经受足够凋亡的细胞 中时能够增强凋亡和/或降低IAP mRNA或蛋白水平。相对于对照，增加量优选为至少10%， 更优选为25%，最优选为1倍或1倍以上。本发明的方法中使用的合乎需要的核碱基寡聚 物包括大约8-30个碱基。在某些实施方案中，至少八个连续的碱基来源于选自SEQ ID NOs 1-99，143，147，151，163-260，287，289，300-490的序列。本发明的核碱基寡聚物也可 以包含，例如，与编码IAP多肽的多核苷酸互补的另外的20，40，60，85，120或更多个连续的 碱基。核碱基寡聚物(或其一部分)可以包含修饰的骨架。硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，及 其它修饰的骨架本领域已经公知。核碱基寡聚物也可以包含一个或多个非天然连接。“患者"指任何动物(例如人)。可以利用本发明的方法，组合物和试剂盒进 行治疗的非人患者包括马、狗、猫、猪、山羊、兔子、仓鼠、猴子、豚鼠(guinea pigs)、大鼠、小 鼠、蜥蜴(lizard)、蛇、羊、牛、鱼和鸟。“化疗剂"指用来杀死癌细胞或减慢癌细胞生长的试剂。因此，细胞毒性剂和细 胞生长抑制剂都被认为是化疗剂。示例性化疗剂有紫杉烷类(taxanes)(例如，紫杉醇、 多西它赛(doxetaxel)、RPR109881A, SB-T-1213, SB-T-1250, SB-T-101187, BMS-275183, BRT 216、DJ-927、MAC-321、IDN5109 和 IDN5390)、长春花生物碱(vinca alkaloids)(例如，长春花新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、脱乙酰长春花碱(vindesine)、长春氟宁(vinflunine)、长春瑞滨(vinorelbine)和脱水长春碱(anhydrovinblastine)) 、 多拉司它汀(dolastatins)(多拉司它汀-10、多拉司它汀-15、ILX651、T2T-1027、 symplostatin 1、symplostatin3 和 LU103793)、隐藻素(cryptophycins)(例如，隐藻素 1 和隐藻素52)、埃博霉素(印othilones)(例如，埃博霉素A、埃博霉素B、脱氧埃博霉素B和 ±矣博霉素 B 内酉先胺)、艾槽素(eleutherobin)、discodermolide、2_印i-discodermolide、 2-des-methyldiscodermolide>5-hydroxymethyldiscodermolide、19-des-aminocarbonyl discodermolide、9 (13) -cyclodiscodermolide 和 Iaulimalide0 其它的化疗剂列见下表 1。“生物效应调节剂"指能促进或恢复免疫系统抵抗病原体能力的试剂。一些，但 不是全部的生物效应调节剂可以减慢癌细胞的生长，因此也被认为是化疗剂。生物效应调 节剂的实例有干扰素(α，β，Y)、白细胞介素_2、利妥昔单抗(rituximab)和曲妥单抗 (trastuzumab)。
“化学致敏剂"指使肿瘤细胞对化疗效应更敏感的试剂。“淋巴组织增生紊乱〃指淋巴系统的细胞(例如，T细胞和B细胞)出现异常增 殖的紊乱。“核酶"指具有酶活性，对靶RNA分子具有位点特异性和切割能力的RNA。核酶 可用于降低多肽的表达。例如 Turner et al (Adv. Exp. Med. Biol. 465 :303_318，2000)和 Norris et al (Adv. Exp. Med. Biol. 465 :293_301，2000)描述了利用核酶降低多肽表达的方法。“报告基因"指编码表达可以被测定的多肽的基因；这种多肽包括但不限于葡糖 醛酸酶(GUS)、荧光素酶、氯霉素转乙酰酶(CAT)和β-半乳糖苷酶。“启动子"指足以指导转录的多核苷酸。“操作性连接"指当适当的分子(例如，转录活化蛋白质)连接到第二多核苷酸 上时，第一多核苷酸靠近指导第一多核苷酸转录的第二多核苷酸。从下文中描述的优选实施例和权利要求书可以明显看出本发明的其它特征和优
点ο本发明还涉及1. 一种治疗患有增生性疾病的患者的方法，所述方法包括给所述患者施用(i)长度为八到三十个核碱基之间的反义IAP核碱基寡聚物；和(ii)化疗剂，两者总量加在一起足以治疗患者。2.项1所述的方法，其中在彼此相距28天内施用所述的反义IAP核碱基寡聚物和 所述的化疗剂。3.项2所述的方法，其中在彼此相距24小时内施用所述的反义IAP核碱基寡聚物 和所述的化疗剂。4.项3所述的方法，其中在彼此相距1小时内施用所述的反义IAP核碱基寡聚物 和所述的化疗剂。5.项4所述的方法，其中同时施用所述的反义IAP核碱基寡聚物和所述的化疗剂。6.项1-5任一项所述的方法，其中所述的核碱基寡聚物包含从SEQ IDNOs :1_99，143，147，151，163-260，287，289和300-460组成的群组中选择出来的序列的至少八个连续
核碱基。7.项6所述的方法，其中所述的核碱基寡聚物包含从SEQ ID NOs =97,98,99,143，147，151，287，289和300-460组成的群组中选择出来的序列的至少八个连续核碱基。8.项7所述的方法，其中所述的核碱基寡聚物基本上由从SEQ ID NOs =97,98,99, 143，147，151，287，289和300-460组成的群组中选择出来的序列组成。9.项8所述的方法，其中所述的核碱基寡聚物由从SEQ ID NOs :97，98，99，143， 147，151，287，289和300-460组成的群组中选择出来的序列组成。10.项1-9任何一项所述的方法，其中所述核碱基寡聚物是寡核苷酸。11.项10所述的方法，其中所述的寡核苷酸包含至少一个修饰键。12.项11所述的方法，其中所述的修饰键选自由硫代磷酸酯，磷酸甲酯，磷酸三 酯，二硫代磷酸酯和phosphoselenate键组成的组。13.项1-9任何一项所述的方法，其中所述核碱基寡聚物包含至少一个修饰的糖 部分。14.项13所述的方法，其中修饰的糖部分是2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基。15.项1-9任何一项所述的方法，其中所述核碱基寡聚物包含至少一个修饰的碱基。16.项15所述的方法，其中所述的修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。17.项1-9任何一项所述的方法，其中所述核碱基寡聚物是嵌合的核碱基寡聚物。18.项17所述的方法，其中所述的核碱基寡聚物包含通过硫代磷酸酯键连接在一 起的DNA残基，其中所述的DNA残基的每侧侧接了至少一个2'-氧-甲基或2'-氧-甲
氧乙基RNA残基。19.项18所述的方法，其中所述的DNA残基的两侧都侧接了至少三个2'-氧-甲 基或2'-氧-甲氧乙基RNA残基。20.项19所述的方法，其中所述的DNA残基的两侧都侧接了四个2'-氧-甲基 或2'-氧-甲氧乙基RNA残基。21.项18所述的方法，其中所述的RNA残基通过硫代磷酸酯键连接在一起，而且所 述的RNA残基通过硫代磷酸酯键连接到所述DNA残基上。22.项18所述的方法，其中所述的核碱基寡聚物包含通过磷酸二酯键连接在一起 的DNA残基，其中所述的DNA残基的两侧分别侧接了至少两个通过硫代磷酸酯键连接在一 起的2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA残基。23.项22所述的方法，其中所述的DNA残基的两侧都侧接了至少三个2'-氧-甲 基或2'-氧-甲氧乙基RNA残基。24.项1-5任一项所述的方法，其中所述的核碱基寡聚物包含i^一个DNA残基，DNA 残基两侧都侧接了四个2'-氧-甲基RNA残基，所述核碱基寡聚物由下列序列中的一个组 成5' -AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3‘ (SEQ ID NO 155)；5' -ACACGACCGCTAAGAAACA-3‘ (SEQ ID NO 16)；
5' -ACAGGACTACCACTTGGAA-3' (SEQ ID NO : 157)；5' -UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3' (SEQ ID NO 27)；5' -GCUGAGTCTCCATATUGCC-3' (SEQ ID NO : 141)；5' -UCGGGTATATGGTGTCUGA-3' (SEQ ID NO 41)；5' -AAGCACTGCACTTG⑶CAC-3' (SEQ ID NO 47)；5' -CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3' (SEQ ID NO 51)；5' -ACCCTGGATACCATTUAGC-3' (SEQ ID NO 63)；5' -U⑶CAGTACATGTTGGCUC-3' (SEQ ID NO : 161)；和5' -UGCACCCTGGATACCAUUU-3' (SEQ ID NO : 151)，所述残基通过硫代磷酸酯键连
接在一起。25.项1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂破坏微管。26.项1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂稳定微管。27.项1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂是紫杉烷。28.项27所述的方法，其中所述的紫杉烷是紫杉醇、多西它赛(doxetaxel)、 RPR109881A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT216、DJ-927、MAC-321、 IDN5109 或 IDN5390。29.项1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂是长春花生物碱。30.项29所述的方法，其中所述的长春花生物碱是长春新碱、长春花碱、脱乙酰长 春花碱、长春氟宁、长春瑞滨和脱水长春花碱。31.项1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂是多拉司它汀(dolastatin)。32.项31所述的方法，其中所述的多拉司它汀是多拉司它汀-10、多拉司它汀-15、 ILX651、TZT-1027、symplostatin 1、symplostatin 3 或西马多丁(cemadotin)。33.项1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂是隐藻素(cryptophycin)。34.项33所述的方法，其中所述隐藻素是隐藻素1或隐藻素52。35.项1-25任何一项所述的方法，其中所述化疗剂是埃博霉素(印othilone)。36.项35所述的方法，其中所述埃博霉素是埃博霉素A、埃博霉素B、脱氧埃博霉素 B或埃博霉素B内酰胺。37.项1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂是艾榴素(eleutherobin)、 discodermolide、2-epi-discodermolide、2-des-methyldiscodermolide、 5-hydroxymethyldiscodermolide>19-des-aminocarbonyldiscodermolide> 9 (13)-cyclodiscodermolide 或 Iaulimalide038.项1-24任何一项所述的方法，其中所述化疗剂是一种选自表1的药物。39.项1-38任何一项所述的方法，其中所述增生性疾病是癌症。40.项39所述的方法，其中所述癌症是急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、 急性髓细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性髓单核细 胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、 骨髓发育不良综合征、慢性淋巴细胞性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、何杰金氏病、 Waldenstrom氏巨球蛋白血症、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、 血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管 癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、Wilm氏瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、 膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体 瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑(脊)膜瘤、黑色素瘤、成 神经细胞瘤或成视网膜细胞瘤。41.项1-40任何一项所述的方法，更进一步地包含给所述患者施用化学致敏剂。42.项1-41任何一项所述的方法，更进一步地包含给所述患者施用生物效应调节 剂。43.权利1-42任何一项所述的方法，更进一步地包含给所述患者施用第二化疗 剂。44. 一种组合物，包含(i)长度为八到三十个碱基之间的反义IAP核碱基寡聚物；和(ii)化疗剂，两者总量加在一起足以治疗患有增生性疾病的患者。45.项44所述的组合物，其中所述的核碱基寡聚物包含从SEQ ID NOs =1-99,143, 147，151，163-260，287，289，和300-460组成的群组中选择出来的序列的至少八个连续碱基。46.项45所述的组合物，其中所述的核碱基寡聚物包含从SEQ ID NOs =97,98,99, 143，147，151，287，289和300-460组成的群组中选择出来的序列的至少八个连续碱基。47.项46所述的组合物，其中所述的核碱基寡聚物基本上由从SEQ IDNOs =97,98, 99，143，147，151，287，289和300-460组成的群组中选择出来的序列组成。48.项47所述的组合物，其中所述的核碱基寡聚物由从SEQ ID NOs =97,98,99, 143，147，151，287，289和300-460组成的群组中选择出来的序列组成。49.项44-48任何一项所述的组合物，其中所述核碱基寡聚物是寡核苷酸。50.项49所述的组合物，其中所述的寡核苷酸包含至少一个修饰键。51.项50所述的组合物，其中所述的修饰键选自硫代磷酸酯，膦酸甲酯，磷酸三 酯，二硫代磷酸酯和phosphoselenate键组成的组。52.项44-48任何一项所述的组合物，其中所述核碱基寡聚物包含至少一个修饰 的糖部分。53.项52所述的组合物，其中修饰的糖部分是2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基。54.项44-48任何一项所述的组合物，其中所述核碱基寡聚物包含至少一个修饰 的碱基。55.项54所述的组合物，其中所述的修饰的碱基是5_甲基胞嘧啶。56.项44-48任何一项所述的组合物，其中所述核碱基寡聚物是嵌合的核碱基寡 聚物。57.项56所述的组合物，其中所述的核碱基寡聚物包含通过1硫代磷酸酯键 连接在一起的DNA残基，所述的DNA残基的两侧分别侧接了至少一个2 ‘-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA残基。58.项57所述的组合物，其中所述的DNA残基的两侧都侧接了至少三个 2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA残基。59.项58所述的组合物，其中所述的DNA残基的两侧都侧接了四个2 ‘-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA残基。60.项57所述的组合物，其中所述的RNA残基通过硫代磷酸酯键连接在一起，而且 所述的RNA残基通过硫磷酰键连接到所述DNA残基上。61.项57所述的组合物，其中所述的核碱基寡聚物包含通过磷酸二酯键连接在一 起的DNA残基，其中所述的DNA残基的两侧分别侧接了至少两个通过硫代磷酸酯键连接在 一起的2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA残基。62.项61所述的组合物，其中所述的DNA残基的两侧都侧接了至少三个 2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA残基。63.项44所述的组合物，其中所述的核碱基寡聚物包含i^一个DNA残基，DNA残基 两侧都侧接了四个2'-氧-甲基RNA残基，所述核碱基寡聚物由下列序列中的一个组成5' -AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3‘ (SEQ ID NO 155)；5' -ACACGACCGCTAAGAAACA-3‘ (SEQ ID NO 16)；5' -ACAGGACTACCACTTGGAA-3‘ (SEQ ID NO 157)；5' -UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3‘ (SEQ ID NO 27)；5' -GCUGAGTCTCCATATUGCC-3‘ (SEQ ID NO 141)；5' -UCGGGTATATGGTGTCUGA-3‘ (SEQ ID NO 41)；5' -AAGCACTGCACTTG⑶CAC-3‘ (SEQ ID NO 47)；5' -CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3‘ (SEQ ID NO 51)；5' -ACCCTGGATACCATTUAGC-3‘ (SEQ ID NO 63)；5' -U⑶CAGTACATGTTGGCUC-3‘ (SEQ ID NO 161)；禾口5' -UGCACCCTGGATACCAUUU-3‘ (SEQ ID NO 151)，所述残基通过硫代磷酸酯键连
接在一起。64.项44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂破坏微管。65.项44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂稳定微管。66.项44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂是紫杉烷。67.项66所述的组合物，其中所述的紫杉烷是紫杉醇、多西它赛(doxetaxel)、 RPR109881A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT216、DJ-927、MAC-321、 IDN5109 或 IDN5390。68.项44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂是长春花生物碱。69.项68所述的组合物，其中所述的长春花生物碱是长春新碱、长春花碱、脱乙酰 长春花碱、长春氟宁、长春瑞滨和脱水长春花碱。70.项44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂是多拉司它汀 (dolastatin)071.项70所述的组合物，其中所述的多拉司它汀是多拉司它汀-10、多拉司它 汀-15、ILX651、TZT-1027、symplostatin 1、symplostatin 3 或西马多丁(cemadotin)。
72.项44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂是隐藻素(cryptophycin)。73.项72所述的组合物，其中所述隐藻素是隐藻素1或隐藻素52。 74.项44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂是埃博霉素(印othilone)。75.项74所述的组合物，其中所述埃博霉素是埃博霉素A、埃博霉素B、脱氧埃博霉 素B或埃博霉素B内酰胺。76.项44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂是艾榴素(eleutherobin)、 discodermolide、2-epi-discodermolide、2-des-methyldiscodermolide、 5-hydroxymethyldiscodermolide>19-des-aminocarbonyldiscodermolide> 9 (13)-cyclodiscodermolide 或 Iaulimalide077.项44-63任何一项所述的组合物，其中所述化疗剂是一种选自表1的药物。78. 一种增强细胞凋亡的方法，所述方法包括使所述细胞与项44-77任何一项所 述的组合物接触。79.项78所述的方法，其中所述细胞在活体内。80.项78所述的方法，其中所述细胞是在活体外。81.项78-80所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。82.项81所述的方法，其中所述癌细胞是人癌细胞。83. —种试剂盒，包括(i)长度为八到三十个碱基之间的反义IAP核碱基寡聚物；(ii)化疗剂，和(iii)给患有增生性疾病的患者施用所述反义IAP核碱基寡聚物和所述化疗剂的 说明，施用剂量足以治疗所述的增生性疾病。84. —种试剂盒，包括(i)长度为八到三十个碱基之间的反义IAP核碱基寡聚物；和(ii)给患有增生性疾病的患者施用所述反义IAP核碱基寡聚物和所述化疗剂的 说明，施用剂量足以治疗所述的增生性疾病。85. —种试剂盒，包括(i)项44-77任何一项所述的组合物；和(ii)给患有增生性疾病的患者施用所述组合物的说明，施用剂量足以治疗所述的 增生性疾病。附图简述
图1A-1L是显示相对于总蛋白，反义XIAP寡核苷酸对XIAP蛋白表达的影响的图 (图1A、1C、1E、1G、1I和1K)。图IB、ID、IF、1H、IJ和IL是显示与模拟转染结果相比较的， 用于将上述XIAP蛋白质结果标准化的每一个寡核苷酸转染的总蛋白浓度值的图。图2A-2C是显示单独或联合使用的各种反义XIAP寡核苷酸对XIAPRNA (图2A)和 蛋白质(图2B)的影响的图。图2C是显示与模拟转染结果相比较的，用于将图2B中显示 的XIAP蛋白质结果标准化的每一个寡核苷酸转染的总蛋白浓度值的图。图3和4图是显示31nM(图3)或63nM(图4)的4X4混合骨架(MBO)FG8或E12 寡核苷酸的影响的图。在一天，或连续两天或三天里用125nMMB0s和Lipofectamine 2000 转染H460肺癌细胞18小时。在标明的时间处收集用于蛋白质印迹分析的样品。实施光密度扫描，参照GAPDH将XIAP蛋白水平标准化，并与设置为100%的模拟对照进行比较。标明的百分比表示相对于特异性混杂(scrambled)对照的XIAP蛋白质下降的百分比。图5A-5D是显示反义XIAP寡核苷酸对细胞成活力的影响(图5A，5C和5D)，以及 阿霉素(adriamycin)存在时的化学致敏作用的图(图5B)。图6是显示寡核苷酸在体外介导H460细胞中特异性XIAP mRNA下调的图。图中描 绘的是单独用 Lipofectamine 2000 (LFA)处理，或用 Lipofectamine 2000 与 1. 20 Μ(μΜ) 的F3、G4、C5、AB6、DE4或D7 —起，或用各自的反极性(RP)或混杂的(SC)寡核苷酸对照处 理的H460细胞的XIAP mRNA水平。在转染6小时后实施实时RT-PCR，定量检测XIAPmRNA 的相对量。显示的所有数据都是从典型实验中获得的三重数据的均数士标准差(SD)。在 相同实验条件保持的未处理细胞(对照)中的XIAPmRNA水平被定为数值1。图7是显示用各种的PS-XIAP寡核苷酸转染后的H460细胞中的XIAPRNA水平的 图。用IuM的PS寡核苷酸和Lipofectamine 2000转染H460人肺癌细胞6小时。然后收 集细胞进行Taqman分析。图8是显示用4X4MB0s转染9小时后的H460细胞中的XIAP RNA水平的图。利用 62. 5nM至IuM的4X4MB0s和Lipofectamine 2000转染H460细胞9小时。然后收集细胞进 行Taqman分析。图9是显示用4X4MB0s转染24小时后的H460细胞中的XIAP蛋白质knockdown 的图。用IuM的IuM 4X4MB0s和Lipofectamine 2000转染H460细胞24小时。然后收集 细胞进行蛋白质印迹分析。实施光测密扫描，参照肌动蛋白将XIAP蛋白水平标准化，并与 设置为100%的特异混杂(sm、rm)对照进行比较。图10A和10B是显示反义寡核苷酸在体外介导H460细胞中的XIAP蛋白质特异性 下调的简图。其中描述了用Lipofectamine 2000单独(LFA)处理的H460细胞，或者用LFA 和1. 2uM XIAP寡核苷酸F3，G4或C5，或它们各自的寡核苷酸对照(RP，SC)处理的H460细 胞中的XIAP蛋白水平。采用免疫印迹来分析XIAP蛋白水平(图10A)，采用光密度法对蛋 白质含量进行定量(图10B)。参照细胞的肌动蛋白水平将XIAP水平标准化，并与未处理的 对照(CNT)水平进行比较。图1IA和1IB是显示XIAP寡核苷酸介导的胱冬酶活化效应的简图。其中显示了与 对照与相比，1. 2uM的XIAP寡核苷酸F3，G4或C5，或它们各自的RP和SC ODN对照对转染 的H460细胞中的前胱冬酶-3，PARP(全长(116kDa)和加工后的(85kDa))(图10A)的表达， 以及Bcl-2和Bax蛋白水平(图10B)的影响。通过蛋白质印迹分析(western blotting) 蛋白质的表达。参照细胞的肌动蛋白水平将Bcl-2和Bax蛋白水平标准化，并通过光密度 法进行定量。用两个或三个独立实验的平均数来显示Bcl-2/Bax的比值，对照细胞(CNT) 中的比值设置为1。图12A和12B是显示XIAP寡核苷酸特异性诱导凋亡的简图。测量用1. 2uM的XIAP G4AS寡核苷酸，G4SC寡核苷酸的处理的H460细胞或未处理的对照(CNT)中诱导的凋亡。 图12A显示了用碘化丙啶(propidiumiodide) (PI)染色和流细胞计数法测定的具有亚-GO/ Gl (凋亡的)DNA含量的细胞的百分比。图12B显示了 DAPI染色的寡核苷酸处理的H460细 胞的核形态学。箭头表示具有核DNA凝缩或断裂的特征性凋亡形态学的细胞。图13A是显示XIAP G4AS寡核苷酸处理对H460细胞成活力的影响的图。用浓度逐渐增加的单独的LFA，或LFA与G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸形成的寡核苷酸复合物处理细胞，在处理24小时后通过MTT法确定细胞成活力。数据代表三个独立实验的平均数 士 SD。图13B是显示存在或不存在阿霉素(DOX)，紫杉酚，vinorelbine (VNB)或依托扑沙 (Etoposide) (Etop)时，用0. 4uM的LFA，以及LFA与G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸的复 合物处理后通过MTT法测定的死亡的H460细胞的百分比的图。数据代表三个独立实验的 平均数士 SD。图14是显示用XIAP AS 2X2MB0s和长春瑞滨处理的小鼠体内H460肿瘤相对生 长的图。对携带皮下H460细胞异种移植的SCID-RAG2小鼠实施瘤内注射寡核苷酸，剂量为 50ug/g肿瘤质量。将这些治疗与施用长春瑞滨联合。图15是显示用XIAP AS PS寡核苷酸进行全身治疗的小鼠体内平均H460细胞肿 瘤大小的图。相对于对照，通过系统给药方式(I. P.)(腹膜内)给皮下植入了 H460细胞异 种移植物的SCID-RAG2小鼠施用XIAP AS PS寡核苷酸能降低肿瘤大小。图16是显示用XIAP AS PS寡核苷酸进行全身治疗的小鼠体内的MDA_MB_435/ LCC6人乳腺癌细胞(LCC细胞)肿瘤大小的图。相对于对照，通过系统给药方式(腹膜内) 给乳房脂垫内植入了 LCC6细胞异种移植物的雌性SCID-RAG2小鼠施用XIAP AS PS寡核苷 酸能降低肿瘤大小。图17是显示G4寡核苷酸对肿瘤生长和肿瘤XIAP蛋白水平的体内影响的简图。显 示了系统施用的裸XIAP G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸对雄性SCID-RAG2小鼠体内皮下 H460细胞异种移植物生长的抗肿瘤效力。所有数据用均数士SEM(η = 6只小鼠/组)表
7J\ ο图18A和18B是描述用G4AS寡核苷酸，G4SC寡核苷酸或单独的载体处理21天后， 通过蛋白质印迹分析和光密度法定量获得的SCID-RAG2小鼠体内的H460肿瘤异种移植物 中的XIAP蛋白质表达水平的简图。参照细胞肌动蛋白水平将XIAP水平标准化。所有数据 用均数士SD(n = 3)表示。图19A和19B显示系统施用15mg/kg的XIAP G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸21 天后，G4寡核苷酸对植入到SCID-RAG2小鼠体内的H460肿瘤的病理组织学的体内影响的显 微照片。图19A描绘了用苏木精和伊红染色的肿瘤切片。图19B是显示肿瘤切片中的泛素 表达的免疫组织化学图片。显示了有代表性的肿瘤显微照片。内在的比例尺标记为lOOum。图20A和20B是显示长春瑞滨(VNB)与XIAP寡核苷酸联合施用时，体内效力增强 的图。在SCID-RAG2小鼠体内确定了有或没有XIAP G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸时，长 春瑞滨对H460肿瘤异种移植物的抗肿瘤效力。图20A描述了单一试剂的抗肿瘤活性，图 20B描述了 VNB和G4寡核苷酸联合的抗肿瘤活性。用均数士SEM(η = 6只小鼠/组)表示 所有数据。图21是显示HIAPl寡核苷酸对HIAP1RNA水平的影响的图。图22Α和22Β是显示蛋白质印迹的密度计扫描的简图，该图显示了 HIAPl寡核苷 酸对细胞阻断放线菌酮诱导的HIAPl蛋白质上调的能力的影响。图23是显示HIAPl寡核苷酸对细胞毒性影响的图，其中利用总蛋白来进行测定。图24是显示验证HIAPl寡核苷酸APO 2序列特异性的图。
图25是显示HIAPl寡核苷酸化学致敏耐药SF295恶性胶质瘤的效应的图。发明详述 本发明描述了通过联合施用本发明的碱基(nucleobase)寡聚物和化疗剂，例如 细胞毒性剂，细胞生长抑制剂或生物效应调节剂来增强细胞凋亡的方法。希望的情形是同 时或彼此相距28天内施用两种试剂。在某些实施方案中，化疗剂是破裂或稳定微管的试 齐U。例如化疗剂可以是紫杉烷或长春花生物碱。如果需要，也可以施用化学致敏剂(即，使 增殖细胞对化疗更敏感的试剂)。可以用上述试剂的任何组合来形成药物组合物。这些药 物组合物可用来治疗增生性疾病，例如癌症或淋巴组织增生紊乱，或增生性疾病的症状。本 发明的核碱基寡聚物/化疗剂组合也可以与放疗联合，用于治疗癌症或其它增生性疾病。活化癌细胞的凋亡为改进患者对常规化疗或放疗的反应提供了可能有用的新途 径。就直接抑制胱冬酶和凋亡的能力来说，XIAP是IAP基因家族中最有效的成员。我们通过 反义(AS)寡核苷酸研究了 XIAP下调对非小细胞肺癌(NCI-H460)体外和体内生长的影响。 在培养的H460人肺癌细胞中，寡核苷酸G4AS被确定为最有效的化合物，通过实时RT-PCR 和蛋白质(western)印迹确定它能有效下调XIAP mRNA55%，下调蛋白水平达60%，浓度为 1. 2uM时能诱导60%的细胞死亡。相反，混杂的对照G4寡核苷酸几乎不能导致XIAP损失， 引起的细胞死亡也不到10%。前胱冬酶_3和PARP蛋白质的降解，以及显著的核DNA凝缩 和片断化已经显示用1. 2uM的G4AS处理可导致凋亡。而且，XIAPAS寡核苷酸可以使H460 细胞对阿霉素，紫杉酚，长春瑞滨和依托扑沙的细胞毒性影响敏感。在动物模型中，我们证 明通过腹腔内给药进行全身治疗时，15mg/kg的G4AS对SCID/RAG2免疫缺陷小鼠的异种移 植模型中的人H460肿瘤具有显著的序列特异性生长抑制效果。系统性施用AS ODN伴随着 肿瘤异种移植物中XIAP蛋白质下调85%。将15mg/kg的G4AS与5mg/kg的长春瑞滨结合 能显著抑制肿瘤生长，效果超过单独施用一种试剂的效果。这些研究表明XIAP的下调是肺 癌细胞的有效死亡信号，而且在体外能诱导凋亡，在体内能抑制肿瘤生长。这些研究支持 IAPs是治疗人非小细胞肺癌和其它实体瘤的适宜靶标的观点。治疗可以在通常实施癌症治疗的任何地方家里，医生的办公室，诊所，医院的门诊部 或者医院来提供这种治疗。治疗通常从医院开始，这样以便医生能够密切观察治疗的效果， 并作出任何必须的调整。治疗的持续时间取决于待治疗的癌症的种类，患者的年龄和状况， 患者疾病的分期和类型，以及患者的身体对治疗的反应。可以以不同的间隔(例如每日，每 周或每月)来给药。为了使患者的身体有构建健康新细胞和恢复体力的机会，可以采用包 括间断期的断续周期来实施治疗。依据癌症的种类和它的发展阶段，治疗可用于减慢癌症的扩散，减慢癌症的生长， 杀死或延滞(arrest)已经从原发肿瘤处扩散到身体其它部分的癌细胞，减轻癌症引起的 症状或防止癌症在第一位点出现。这里使用的术语〃癌症〃或〃赘生物〃(neoplasm)或〃赘生性细胞〃指以异常 方式增殖的细胞集合。癌症生长不受控制，而且呈进行性，在通常不引起或导致正常细胞增 殖停止的情况下会发生。为了给遭受细胞过度增殖引起的疾病折磨的患者施用化合物，可以利用常规的制 药实践来提供适当的配方或组合物。可以在患者出现症状之前就开始给药。可以采用任何适当的途径来给药，例如可以是肠胃外、静脉内、动脉内、皮下、瘤内、肌内、颅内、眶内、目艮用、心室内、肝内、囊内、鞘内、脑池内(intracisternal)、腹膜内、鼻内、气溶胶、栓剂或口服 给药。例如治疗的剂型可以是液体溶液或悬浮液形式；口服剂型可以是用片剂或胶囊形 式；鼻内剂型可以是粉剂、滴鼻剂或气溶胶形式。例 如 在“Remington :The Science and Practice of Pharmacy " Ed. A. R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins，Philadelphia, PA，2000 中已经找到本 领域制造这些剂型的公知方法。例如肠胃外给药的剂型可以包含赋形剂，无菌水或盐水，聚 二醇，例如聚乙二醇，植物油或氢化萘。也可以用生物相容性的可生物降解的丙交酯聚合 物，丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯_聚氧丙烯共聚物来控制化合物的释放。适合于IAP 调节化合物的其它可能有用的肠胃外药物递送系统包括乙烯_醋酸乙烯共聚物颗粒，渗透 泵，可植入的浸渍系统和脂质体。吸入剂的剂型可以包含赋形剂，例如，乳糖，或者是包含如 聚氧乙烯-9-月桂基醚，甘油胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或者是适合以滴鼻剂或凝胶 形式给药的油性溶液。可以给病人施用治疗有效量(例如，防止，消除或者减少病理状况的量)的这些制 剂来提供对疾病或状况的治疗。本发明的核碱基寡聚物的优选剂量可能取决于象紊乱的类 型和程度，特殊患者的总体健康状态，化合物赋形剂的组成和给药途径这样的变量。如上所述，如果愿意，可以将本发明的核碱基寡聚物治疗与治疗增生性疾病的治 疗方法(例如放疗、外科手术或化疗)联合使用。上述的任何使用方法中都希望通过静脉内给药来施用本发明的核碱基寡聚物，或 者将本发明的核碱基寡聚物应用到需要凋亡发生的位点(例如通过注射)。寡核苷酸及其它核碱基寡聚物至少两种寡核苷酸即具有磷酸二酯(PO)或硫代磷酸酯(PS)键的多聚脱氧核苷 酸会导致RNase H切割RNA。虽然2' -OMe-RNA序列对RNA靶呈现出高亲合力，但这些序 列不是RNase H的底物。可取的寡核苷酸是以包含寡聚脱氧核苷酸缺口的2‘修饰寡核 苷酸为基础的寡核苷酸，其中一些或全部核苷酸之间的键被改变为对核酸酶具有抗性的硫 代磷酸酯。膦酸甲酯修饰的存在增加了寡核苷酸对靶RNA的亲合力，因此降低了 IC5(I。这 些修饰也增加了修饰的寡核苷酸对核酸酶的抗性。应当理解本发明的方法和试剂可以和 任何可能发展的技术，包括共价闭合多反义(covalently-closed multiple antisense) (CMAS)寡核苷酸(Moon et al.，Biochem J. 346 :295_303，2000 ；PCT
发明者丹尼尔·麦克马纳斯, 乔恩·P·德金, 埃里克·拉卡西 申请人:艾吉拉医疗股份有限公司