一种皮肤外用的重组人神经肽y纳米乳及其制备方法

专利名称：一种皮肤外用的重组人神经肽y纳米乳及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医药保健领域，特别地涉及一种皮肤外用的重组人神经肽Y纳米 乳及其制备方法。
背景技术：
随着人们物质生活的提高，很多人开始追求更高层面上的需求，美容整形就满足 了人们心理高层次的需求。美容整形的现状是百花齐放、日新月异，其未来的发展更是前景 广阔。就今天的百花齐放来说，就是人们在增进人体美的手段上不断进行摸索，推陈出新。乳房是女性的象征和体形美的标准之一，随着人类文明的发展，隆乳术日益盛行， 新的方法不断涌现。回顾隆胸术的百年史，用于丰胸的材料了经过了液态的乳房假体、固 态的乳房假体以及自体组织这三个阶段的发展，与之相应的出现了注射隆胸、假体隆胸和 自体脂肪隆胸这三种现今流行的隆胸手段。I、注射隆胸因为注射隆胸注入的是液体，会 与身体组织相容，出现问题后不可能完全取出，无论取出多少，剩下5%和50%同样会对身 体有伤害，只是伤害的程度大小。此外，注射隆胸常伴发的并发症有①感染，表现为发热、 发炎；②局部硬结、乳房变小；③注射的材料有游走现象；④有可能导致乳腺癌；⑤局部隐 痛；⑥局部肌肉收缩功能损害。II、植入假体优点是一次到位，如果出现问题可完全取出， 缺点是要开刀，有切口，可能有排异反应，手感变硬，乳房变形。植入假体也不是终身的，一 般12年至15年后假体会出现破裂现象，需要更换。III、自体脂肪移植其优点是没有刀口， 没有排异反应；缺点是能采用这种方法的人要求比较胖，要有一定脂肪，要多次注射才能完 成，且有10%的人会出现包块现象，导致和乳腺癌不易区别。一般移植自体的脂肪存活率在 50 %左右，如果注射量过大，会出现脂肪无菌性坏死，导致乳房进一步感染，甚至乳腺坏死， 也容易出现脂肪纤维化，即局部硬结现象。纵观现有的各种整形丰胸技术中，自体脂肪移植被受人们的关注。自体脂肪来源 于自身组织，组织相容性好，无过敏反应，加之其能去除多余的脂肪填充凹陷的特点，使全 身脂肪能够合理“调配”，显示了它作为软组织充填材料的强大优势。虽然目前移植后的脂 肪仍然存在着吸收率高、疗效不稳定的缺点，但在临床中已积累了许多经验和观点。应用自体脂肪颗粒移植治疗组织缺损和发育不良历史悠久。Neuber于1893年成 功进行脂肪游离移植。自体脂肪颗粒注射移植治疗小乳症，即于身体脂肪丰厚部位，借助 吸脂技术，吸取一定数量和大小的脂肪颗粒，经漂洗、纯化后注射移植于乳房内或乳腺后间 隙；移植后乳房体积增大，弹性增加，手感和外形改善；同时，减去其他部位堆积的脂肪，重 塑体形。因此，自体脂肪颗粒移植隆乳将成为整形外科一个新兴的发展方向。此外，自体 脂肪来源丰富，取材简便，组织相容性优于人工组织替代品和异体异种材料，无免疫排斥反 应，是理想的组织填充材料。同时，吸脂隆乳术能减去其他部位堆积的脂肪，修整身体曲线， 重塑体形。采用注射移植具有创伤轻、痛苦少、遗留瘢痕小的优点，临床应用越来越广泛。但由于脂肪组织对缺血和创伤的耐受力较差，目前自体脂肪颗粒移植成活率较 低，移植后成活率不高。由于对于部分并发症的产生原因尚不了解，不当的操作会造成严重
4的并发症。如失明、中枢神经损伤、感染、血肿、肉芽肿、起皱、麻木、注射后局部硬结、液化、 坏死、纤维囊性化、水肿等。在自体脂肪移植隆乳术产生的并发症方面，临床实践表明，隆 乳的脂肪液化吸收率高达30%以上，大量的自体脂肪移植还可以产生囊肿和纤维钙化，形 成硬结，对乳腺肿块的自查有一定影响。同时，一次注射量大，常易形成中心坏死液化。因 此，自体脂肪移植用于隆乳需要慎重，应由具备熟练技术的医生操作。如果有一种方法或 技术可以通过自体脂肪的增殖来达到隆乳的效果，那就可以避免自体脂肪移植所带来的缺 陷如脂肪组织对缺血和创伤的耐受力较差，自体脂肪颗粒移植成活率较低，移植后成活率 不高，又可避免自体脂肪移植产生囊肿和纤维钙化，形成硬结等。2007年美国科学家最近研制出一种转移身体局部脂肪的药物。在对老鼠的研究中 发现，该药物能帮助把脂肪转移到身体的其他部位，比如胸部。这项研究基于神经肽Y。神 经肽Y (Neurop印tide Y，简称NPY)是由36个氨基酸组成的神经递质，其多肽分子结构中C 端有一酪氨酰胺残基，对维持神经肽Y生物活性至关重要，N端一个酪氨酸残基，则与稳定 神经肽Y结构和结合神经肽Y受体密切相关。神经肽Y基因通过转录、翻译在神经细胞内 完成复制、并经轴索输送至神经末梢并与去甲肾上腺素共存于交感神经的分泌囊泡。而神 经肽Y受体则属于G蛋白偶联受体家族成员，其受体亚型介导信息传导均与G蛋白偶联有 关。神经肽Y在合成和释放后必须通过与神经肽Y受体结合后才能发挥其应有的生物学作 用，同样，神经肽Y受体也只有在神经肽Y配体作用后才能通过与抑制性G蛋白(Gi)偶联 抑制腺苷酸环化酶活性，最终动员或抑制Ca2+释放。即神经肽Y在受到某些刺激原作用后 加快、加大合成与分泌和释放，并迅速通过神经肽Y特异性受体发挥促肾上腺释放因子、促 肾上腺皮质激素、黄体生成激素、生长激素等的合成与分泌，并直接影响着人体血管收缩、 血压升高、摄食行为、激素分泌、心血管功能、调节体温、生物节律、应激反应、性行为和情绪 等多种生物学功能。这一研究的领导者、乔治敦大学医学中心生理学和生物物理学系教授左菲亚说 “在美国，60%的人患有不同程度的肥胖症。这个领域里有两种不同的观点，一种认为肥胖 的原因在于吃太多富含糖和脂肪的食物，或者说‘舒适’食物，也就是自己喜欢吃的东西。另 一种认为，压力会导致肥胖。比如说人们在生病时，他们往往会承受更多的压力，这些压力 催生了人体内的荷尔蒙，而荷尔蒙又导致了肥胖。，，研究者尝试解释肥胖这一问题的根源，他们通过4年的研究，找到了一个压力可 以促进体重增加的机制，这一机制可以解释那些长期有压力的人的体重增加比他们应该增 加的体重(根据吸收的卡路里计算而来)要更多的原因。研究小组观察了老鼠在荒野中遭 遇到各种类型长期压力的影响，例如在一个两周的期限内每天有一个小时站在冰冷的污水 坑里面，或者与一只好斗的老鼠打架，同时他们在实验中依据一个正常的菜单和一个高脂 肪高糖的菜单给实验鼠喂食。最终的结果是喂食正常菜单的受压力动物没有增加体重，但 喂食高脂肪菜单的有压力动物大大增加了体重一与作为对照组的那些没有压力的动物相 比，尽管吃一样的食物，增加的脂肪却是后者的2倍。“如果考虑进化优点的话，这个发现就 很有意义如果你可以在艰难时期贮藏脂肪，你就有贮备可以转化为能量以进行下一场战 斗，”左菲亚说，“同样的机制可能也会发生在人类身上。长期积累的紧张因素，例如和你上 司意见不合，或者长期照顾一个有病的小孩，或者一直处于"公路愤怒症"(即由于堵车 等原因而导致的急躁和愤怒)，长时间拖延这种状态就有可能演变为高卡路里食物的放大
5器ο进一步的研究，就是从分子水平上寻找压力导致肥胖的化学机制。研究者找到了 这一机制发生作用的两个主力参与者神经肽Y及其受体Υ2。当然，它们都与压力有关。但 以往的研究认为，它们更可能是在大脑发生作用。为了选择性地增加他们测试中的老鼠的 脂肪，研究人员把神经肽Y打在一个特定的区域一腹部。他们发现，在压力过程中神经肽 Y受到刺激，导致老鼠腹部开始堆积脂肪，出现苹果形的肥胖和代谢综合征。肥胖都出现在 实验鼠的腹部区域，并且与以往科学家对神经肽的了解不同的是，神经肽Y在脂肪组织中 工作，而不是在大脑中工作。这意味着，通过调整身体各部位神经肽Y的浓度分布，人们可 以选择性地控制脂肪在身体各部位的生长。而另一方面，神经肽Y要发生作用还必须借助 于神经肽Υ2受体的帮忙。通过阻断Y2R，神经肽Y将不再发生作用，从而在这一局部产生减 肥效应。研究人员说，这些发现的最快临床应用，是美容和重新整形外科手术；长期来说， 则可以更好地控制代谢综合征，该综合征集合了增加病人诱发心脏病、中风和糖尿病几率 的危险因素。根据2004年美国疾病控制中心资助的一项研究，2000年大约有6000万美国人 受到代谢综合征的影响，其中相当一部分最终导致肥胖。这四年里实施的无数不同的实验， 证实了起码在老鼠身上它是可行的；最近的引导数据则说明了在猴子身上也有一个相似的 机制。左菲亚说，“通过对神经肽Y和Y2R的控制，我们可以减少老鼠腹部的脂肪，还可以减 少它们肝脏和骨骼肌上的脂肪，并帮助控制胰岛素的抵抗、葡萄糖不耐性、血压和炎症。阻 断Y2R的作用可能对人类会起同样的效果，但需要更多的研究来证明它。我想我们的研究 可以帮助人们减肥，同时也会对整个生命科学做出贡献”。“目标性地增加脂肪对恢复面部青春、丰满乳房、臀部和嘴唇增厚手术，以及面部 重新整形是十分有用的，”乔治敦大学医院的整形外科副教授斯特芬说，“利用这项研究中 那些试验的注射剂会让脂肪移植变成可能，并且成本相对低廉，还不会引起永久性的排异 反应。给予神经肽Y可以增加目标地增加脂肪而阻断Y2R的结果则是消除了局部的脂肪。 这是首个被描述为完好的机制，能够不动手术而有效地增加或消除脂肪。”当然，这里所说 的“脂肪转移” “脂肪消除”是一种间接的转移和消除，即增加一些身体部位的神经肽Y，使 之接受身体的多余能量；同时阻断减肥的目标部位的Y2R作用，使之不再接受多余脂肪，已 堆积的脂肪在得不到补充的情况下将很快消耗掉。这个发现不仅对于减肥有很大的作用， 对于整容和修复手术中填充人体组织的手术也将具有很大的帮助，比如丰胸。研究人员发 现，将包含神经肽Y的小球注入老鼠或猴子的皮肤后，老鼠和猴子就会变胖。这一技术将为 减肥、吸脂、脸部年轻化手术以及丰胸术提供新的方法，并且在未来可能替代各种整容和修 复手术。对于需要丰胸和乳房再造的女人来讲，这能很好的改善她们身体的优美曲线。总而言之，通过对神经肽Y及其受体Υ2的操作，既可削弱由肥胖引起的负面影响 比如心脏病和糖尿病等；又能帮助把脂肪转移到身体的其他部位如胸部、臀部等，不仅给想 通过健康方式减肥，又爱美的女士带来佳音，而且该研究成果也将为整形外科医生提供新 的手段。但神经肽Y作为一种多肽药物，在体内容易降解，半衰期较短，必须频繁给药，这 给患者带来不变。因此，发展相应的神经肽Y制剂及给药方式是药剂学面对的挑战。神经 肽Y多肽药物稳定性差，这和多肽药物本身的结构有关，也和神经肽Y多肽制剂和给药方式有关。1.引起多肽不稳定的自身原因(1)脱酰胺反应在脱酰胺反应中，Asn/Gln残基水解形成Asp/Glu。非酶催化的 脱酰胺反应，与环境条件和多肽的结构有关。提高PH值、升高温度都将有利于脱酰胺反应 的进行。在-Asn-Glu-结构中的酰胺基团更易水解，位于分子表面的酰胺基团也比分子内 部的酰胺基团易水解。(2)氧化多肽溶液易氧化的主要原因有两种，一是溶液中有过氧化物的污染，二 是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中，Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分 压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。(3)水解多肽中的肽键易水解断裂。由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断 裂，尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽键。(4)形成错误的二硫键二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的 二硫键，导致三级结构改变和活性丧失。(5)消旋除Gly外，所有氨基酸残基的α碳原子都是手性的，易在碱催化下发生 消旋反应。其中Asp残基最易发生消旋反应。(6) β -消除β -消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。Cys、Ser、Thr、 Phe、Tyr等残基都可通过β-消除降解。在碱性PH下易发生β -消除，温度和金属离子对 其也有影响。(7)变性、吸附、聚集或沉淀变性一般都是与三维结构以及二级结构的破坏有 关。在变性状态多肽往往更易发生化学反应，活性难以恢复。在多肽变性过程中，首先形成 中间体。通常中间体的溶解度低，易于聚集，形成聚集体，进而形成肉眼可见的沉淀。蛋白 质的表面吸附是其储存、使用过程中遇到的另一个问题，如IL-2在进行灌注时会吸附在管 道表面，造成活性损失。2.给药途径对多肽药物的影响吸收是指药物透过人体的皮肤或粘膜进入到组织间隙，经毛细血管或毛细淋巴管 回流到血液循环的过程。因给药部位不同，造成药物吸收过程和进入循环后流经的脏器也 不同。这是药物制备要考虑的重要方面。(1)静脉注射药静脉注射药则直接进入血液循环，但是药物需要经肺循环和体 循环动脉到达靶部位而发挥作用，存在严重的副作用而且需频繁给药引起病人痛苦。(2) 口服给药多肽类药物分子量大，脂溶性差，难以透过生物膜，一般只能注射 给药。但注射给药、尤其是那些需要频繁给药的药物，对病人来说是及其不便的。因此有必 要进行多肽的非注射给药途径研究。但是正常情况下，大多数肽类药物很少或不能经胃肠 道吸收。其主要原因有①多肽分子量大，脂溶性差，难以通过生物膜屏障；②胃肠道中存 在着大量肽水解酶和蛋白水解酶可降解多肽；③吸收后易被肝脏消除；④存在化学和构象 不稳定问题。目前研究的重点放在克服前两个障碍，既如何提高多肽的生物膜透过性和抵 抗蛋白酶降解这两个方面。使用吸收促进剂来提高生物膜通透性是目前研究中采用的主要 方法。大量研究还表明吸收促进剂具有多肽特异性。提高生物膜通透性的其它方法还有 ①多肽与VB12连接，通过受体介导吸收；②用脂肪酸修饰多肽，提高脂溶性。克服多肽口 服吸收酶的途径有①用PEG修饰多肽，抵抗酶解；②使用酶抑制剂；③应用微粒制剂；④应用纳米粒制剂；⑤应用生物粘附性颗粒。直径为IOOnm的PEG纳米粒在肠道中能大部分 被吸收，突破酶障和膜障。美国药物开发公司应用Technosphere技术制备降钙素的口服制 剂，在狗体内的绝对生物利用度达26 %。除环孢菌(环肽)外，至今还未见多肽口服制剂的临床应用报道。据称Cortecs 公司的降钙素口服制剂已进入III期临床研究，有望称为第一个真正的多肽口服制剂。(3)直肠给药有研究在5-甲氧基水杨酸钠存在下，胰岛素由直肠吸收后到达大 循环的途径。直肠给药后切开胸导管取淋巴管，测定淋巴液和血中胰岛素，与具有完整胸导 管时比较，血中胰岛素量降低很多，而淋巴液中含量甚高，证明胰岛素在直肠吸收后主要经 淋巴系统进入血液循环。(4)鼻腔给药鼻腔部位存在丰富的毛细血管和淋巴管，鼻腔粘膜上皮与血管壁 紧密相连，上皮细胞间间隙较大，毛细血管内皮具有空隙。所有毛细血管的基底膜呈漏孔 状。小静脉内膜虽完整，但其基底膜以及平滑肌细胞呈高度多孔性。药物可以有两种方式 穿过粘膜，一是通过水溶性细胞间隙；二是通过粘膜中的脂质载体通道。由于细胞间隙的直 径一般为0. 4-0. 8nm，只有直径大于0. 7nm的生物分子不能自由通过细胞间隙。这具有较 高的渗透性利于药物吸收，药物可直接进入血液循环，避免肝脏首过效应与胃肠道相比，鼻 腔粘膜处的PH值和酶对多肽、蛋白质破坏性要小，低分子量的药物及易被吸收进入血液循 环。对分子量教大的多肽，如降钙素、胰岛素等，在合适的吸收促进剂帮助下，也可被吸收， 但生物利用度较低。鼻腔给药的方式有滴鼻给药法和喷雾给药法，采用后一方法可获得相 对较高的生物利用度。(5)肺部给药肺的吸收表面积有140m2，血流量达5000ml/min，蛋白酶活性相对 于胃肠道较低，不存在肝脏首过效应。肺泡壁比毛细血管壁通透性好。(6)眼部给药眼结膜含有丰富的毛细血管网和丰富的毛细淋巴管网，眼部给药 与皮下和肌肉注射一样吸收迅速，可以避免肝脏首过效应，眼组织与其它组织或器官相比， 对于免疫反应更不敏感。3.提高多肽稳定性的途径(1)定点突变通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽 稳定性的残基，可提高多肽的稳定性。(2)化学修饰多肽的化学修饰方法很多，研究最多的是PEG修饰。PEG是一种水 溶性高分子化合物，在体内可降解，无毒。PEG与多肽结合后能提高热稳定性，抵抗蛋白酶的 降解，降低抗原性，延长体内半衰期。选择合适的修饰方法和控制修饰程度可体质或提高原 生物活性。(3)添加剂通过加入添加剂，如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类，可以提 高多肽的稳定性。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围，因而提 高了多肽的稳定性。在冻干过程中，上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多 肽的天然构象，而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。此外表面活性剂如SDS、Tween, Pluronic，能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。(4)冻干多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β -消除、水解等都需要水参与， 水还可以作为其它反应剂的流动相。另外，水含量降低可使多肽的变性温度升高。因此，冻 干可提高多肽的稳定性。
(5)其它剂型的改造也是肽类药物制剂研究的方向。应用微粒、纳米乳系统作为 载体是目前多肽药物研究中的方向之一。目前国外一些生物技术制药公司与相关的研究公 司利用各自的优势进行合作，研究开发进展较快。近年来对多肽的非注射途径给药研究虽取得一些进展，但面临的困难仍很多。几 乎所有多肽药物的粘膜传递都需要渗透促进剂，其种类繁杂，存在的问题是如何降低其刺 激作用、长期使用是否影响上皮完整性以及如何提高功效成分通过生物膜等问题。随着生物技术的发展，肽类药物日益受到重视，尤其是基因重组技术的发展使得 这些药物能大规模、产业化生产。然而肽类药物在实际应用中受到一定的限制，这是由于肽 类药物容易被各种蛋白酶迅速降解，而且半衰期短，通常采用静脉频繁给药方式，使用不方 便，同时肽类药物穿过生物屏障的能力弱，这些是因为肽类药物的弱扩散作用和低分配系 数。为了解决这些问题，对于肽类药物的安全而有效的静脉给药以及局部给药，人们迫切希 望提供一种的新的载药系统。近年来出现的纳米乳载体系统具有很好的应用前景。纳米乳也称微乳 (microemulsion, ME)，由油相、水相、表面活性剂及助表面活性剂组成的，只要四相的组成 适当，即可形成均勻透明或略显乳光的液体，为热力学稳定体系。按结构可分为水包油(0/ W)型、油包水(W/0)型和双连续型纳米乳。因为纳米乳作为载体具有良好的局部给药和透 皮特性，所以从20世纪90年代开始，纳米乳作为透皮给药系统的研究成为药剂学研究的热 点。纳米乳粒径小，具有良好的透皮性和稳定性，其透皮给药系统优于普通的乳剂。纳米乳 所具备的很多特性使其非常适合做成透皮制剂，它粒径小易被皮肤吸收、具有很好的皮肤 触感、视觉、实用效果等。因此，纳米乳载体系统在透皮外用制剂方面是有极大发展前景的 运载工具，纳米乳的分散相可载入功效成分，能维持较高的功效成分浓度，提高了纳米乳与 皮肤间的功效成分浓度梯度，可以大大增加功效成分的稳定性和透皮速率。而纳米乳体系作为药物的载体，是一种新型的药物输送和控制体系，其包封和释 药的机制是通过将活性物质包裹于纳米乳滴内部或纳米乳滴中，利用纳米乳滴的小尺寸特 点，使得肽类药物穿透组织间隙并被细胞吸收，进而可通过人体的毛细血管，也可以通过生 物膜屏障。并且纳米乳载体能提高肽类药物的稳定性和生物利用度，是多肽和蛋白类药物 的优良运输载体，有着独特的优势。

发明内容
本发明的目的是针对背景技术中存在的缺点和问题加以改进、创新，提供一种皮 肤外用的重组人神经肽Y纳米乳及其制备方法。神经肽Y分子量大，亲水性高，半衰期短， 脂溶性差，局部用药时不能有效地穿过生物膜，而目前采用静脉给药途径，存在严重的副作 用而且病人治疗痛苦。口服给药也容易被胃肠道的蛋白水解酶降解、生物利用度低和不易 通过生物膜等，其临床的应用受到很大限制，而目前运载多肽类药物的体系严重缺乏，迫切 需要开发新的给药载体以满足需求。为此，对于肽类药物的给药途径，国内外学者一直致力 于非注射给药剂型的研发。本发明可大大提高重组人神经肽Y的稳定性；提高重组人神经肽Y的生物活性，延 长半衰期，不需频繁给药；改变了神经肽Y肽类药物的传统给药载体，方便，而且减少了风 险和由其产生的副作用；另外纳米乳的粘滞性，高分散性延长了药物与粘膜的接触时间，使
9药物能更好地通过皮肤屏障，可以很长时间维持治疗浓度，生物利用度高。
本发明一种皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳，由重组人神经肽Y、海藻糖、肉豆 蔻酸异丙酯、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油-3- 二油酸酯、蒸馏水组成的液_液分散体 系，其特征是由下述重量百分比的原料制成重组人神经肽Y海藻糖肉豆蔻酸异丙酯辛酸癸酸聚乙醇甘油酯 聚甘油-3- 二油酸酯
0. 0003% 0. 0006%
3% 5% 15% 25% 32% % 12% 蒸馏水
45% 52%上述原料的总重量百分比为100%。本发明所述皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳，其特征是由下述优选重量百分比 的原料制成重组人神经肽Y0. 0005%海藻糖2%肉豆蔻酸异丙酯10%辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 30% 聚甘油-3- 二油酸酯
10%蒸馏水47.9995%上述原料的总重量百分比为100%。本发明的另一目的是提供一种皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳的制备方法①重组人神经肽Y水溶液配制根据配方量将重组人神经肽Y和海藻糖溶于蒸馏 水，将此溶液作为水相(I )；②用分析天平准确称取配方量的肉豆蔻酸异丙酯，置于另一个经过洗消过的三角 烧瓶之中并用记号笔清楚标记为油相(II )；③按照事先已设计好的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(S)聚甘油-3- 二油酸酯(C)油酸酽
曰？
=3 1的比例，分别准确称取配方量的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油-3-. 并将这两者原料置于第三个经过洗消过的洁净三角烧瓶之中；加盖，并将此三角烧瓶迅速 置于液体快速混合器上，充分混合均勻，使之形成乳化剂/助乳化剂(S/C)混合物，3-5min 后，关闭液体快速混合器，取下三角烧瓶，并用记号笔清楚标记为S/C混合物(III)；④按照油相(II ) S/C混合物(III)水相(I ) = 10% 40% 50%的比 例，先分别取水相(I )、s/c混合物(III)置于第四个经过洗消过的洁净三角烧瓶之中；⑤将上述水相(I )、S/C混合物(III)两液相充分混合后，再在室温25°C条件下 或者自然室温中，将其放入超声振荡器中震荡并超声2min左右，或者在室温25°C条件下或 者自然室温中，启动定时恒温磁力搅拌器，以200rpm ^mirT1的转速磁力搅拌5min，然后，再 在此容器中直接加入油相(II )，并将整个体系在超声振荡器中超声5min左右，或者在室温 25°C条件下或者自然室温中，启动定时恒温磁力搅拌器，以200rpm · mirT1的转速磁力搅拌 20min ；⑥关闭超声振荡器或者定时恒温磁力搅拌器，取下三角烧瓶，观察其外观如是清
10亮无色、流体性和分散性好、有明显可见乳光者，即为皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳；⑦将此皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳迅速分装于不同规格的避光玻璃容器 之中，迅速加盖，包装，并置于4°C冰箱中密闭保存即可。本发明的组方原则本发明皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳是由神经肽Y、肉豆蔻酸异丙酯、辛酸癸 酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油-3- 二油酸酯、蒸馏水组成的液_液分散体系。神经肽Y由36个氨基酸组成的多肽，它属于胰多肽家族，分子量为4215。其N端和 C端各有一个酪氨酸残基和酪氨酰胺残基，C端的酰基化对神经肽Y的生物活性至关重要，N 端的酪氨酸残基与稳定神经肽Y的三级结构和结合神经肽Y受体密切相关。X射线晶体结 构图像显示神经肽Y有2个相互逆平行的螺旋区，1个富含脯氨酸的螺旋和1个α _螺旋， 2个螺旋区都有两性电离的特点，2个螺旋之间借疏水键维持其稳定的三级结构。当某种因 素造成分子三级结构发生改变时神经肽Y的生物活性便消失。其广泛分布于中枢神经的纹 状体、杏仁核、孤束核、下丘脑、海马、间脑及脊髓等，以及外周神经组织的颈上神经节、星状 神经节、腹腔神经节等交感神经节细胞中。此外神经肽Y也存在于组织、器官及腺体中，如 骨骼肌、血管、心、肝脏、脾脏、肺、肾上腺、甲状腺及颂下腺中，而胰脏和肾中较少。神经肽Y可作用于下丘脑，具有增强食欲，改变机体代谢环境，激活脂肪组织的脂 蛋白酶，促进脂肪的合成和储存等作用。中枢神经系统是摄食行为的重要调节者，调节能量 代谢的部位多集中在下丘脑。下丘脑中神经肽Y是一种很强的食欲刺激剂，对机体能量摄 入、贮存和消耗及能量平衡起重要作用。神经肽Y能帮助把脂肪转移到身体的其他部位，比如胸部。神经肽Y可以帮助身体 储存脂肪。研究人员将神经肽Y制成的小球植入猕猴的皮肤下，结果发现，小球的周围都长 出了脂肪。神经肽Y有助于美容手术，如让一个上了年纪的人脸颊上丰满起来等。控制神 经肽Y将为整形外科医生提供新的手段，如"可以把臀部的脂肪转移到胸部或面颊"。进 而很好的改善身体的优美曲线。与传统的自体脂肪移植相比，这种方法的并发症会更少。神经肽Y药物在实际应用中受到一定的限制，这是由于肽类药物容易被各种蛋白 酶迅速降解，而且半衰期短。为此我们在组方中加入海藻糖，它对生物大分子具有非特异性 保护作用，它能有效地保护肽类药物的结构，使肽类药物在异常情况下免受损伤，大大提高 了神经肽Y在体外的稳定性。对海藻糖的介绍如下。海藻糖(trehalose, a-D-glucopyranosyl-a-glucopyranoside)是由两个葡萄糖 基分子通过半缩醛基缩合而成的非还原性双糖，在自然界中广泛分布，尤其是那些具有较 强抗脱水作用的生物体，这些生物体甚至在丧失了身体99%水分的情况下仍能生存。1832 年Wigger从黑麦的麦角菌中首次分离得到海藻糖。由于海藻糖化学性质稳定、安全无毒、 甜味适中、并且在高温、冷冻、干燥失水、高渗透压等不良环境下可保护生物体的组织和大 分子的功能和活性，使得海藻糖在食品、医药工业、化妆品和农业等领域有着广阔的应用前
旦
ο海藻糖对生物体和生物大分子具有非特异性保护作用，它能有效地保护细胞膜和 蛋白质的结构，使生物体在异常情况下，如高温、干燥、高渗透压、冷冻时仍保持细胞内湿 润，防止细胞因失水而造成养分的损失和细胞的损伤。而且体外海藻糖同样具有稳定生物 膜和蛋白质结构的特性。其作用机制有以下几种学说。①水替代学说生物体中的蛋白质、核酸、脂质和其他大分子物质周围，均被一层水膜包围并保护着。该层水膜是维持这些物质 的结构和功能不可缺少的基础。在干燥过程中，海藻糖能够替代水分子，与蛋白质和膜脂质 形成氢键，取代由水分子形成的氢键，从而抑制膜脂质的融合及蛋白质的变性。②玻璃态学 说海藻糖具有较高的玻璃态转变温度，容易以玻璃态形式存在。当生物分子干燥时，海藻 糖紧密地包住相邻的分子，形成一种在结构上与玻璃状的冰相类似的碳水化合物玻璃体， 其扩散系数很低，分子运动和分子变性非常微弱，能够使生物分子维持一定的空间结构。玻 璃态的形成不仅可以防止冷冻过程中冰晶的产生，还可以稳定蛋白质的结构。③优先排阻 学说糖类能够在于燥和溶液条件下对蛋白质起一定的稳定和保护作用。海藻糖与其他一 些小分子糖类一样，不直接与蛋白质结构相互作用，而是优先与水结合，使它们从蛋白质分 子中的溶剂化层中排除出来，导致蛋白质的溶剂化层半径缩小，分子结构更趋紧密，构象更 稳定，从而抵御外界极端环境的影响III。由于海藻糖的水化体积比蔗糖、麦芽糖大2. 5倍， 因此，分子排阻效应更明显，在较低浓度下就能实现蛋白质的优先排阻，产生比其他双糖更 强的稳定效果。④多种机制协同作用学说=Crowe等的研究表明，单纯玻璃态形成并不能发 挥海藻糖的保护作用，只有在玻璃态形成与水分子替代作用的协同作用时才能更好地发挥 海藻糖的保护作用。海藻糖具有独特的保护生物分子的功能，是生物分子的特效保护剂和组织细胞的 稳定剂，它将为医用生物制品，如血液制品、酶、菌苗、疫苗、病毒、激素、细胞膜、单克隆抗 体、载药脂质体、抗血清、外科手术所需贮存的皮肤、器官、重组人体蛋白、离体细胞和组织 等的干燥保存、运输和使用带来极大的方便，且具有其它种类的保护剂都达不到的保护效^ ο所以本发明以纳米乳作为给药载体形成重组人神经肽Y。可以把重组人神经肽Y 包裹在乳滴核中，使重组人神经肽Y免受PH、温度、光照、氧浓度等对神经肽Y稳定性的影 响，另外组方中海藻糖可以作为重组人神经肽Y的稳定剂，保证了长距离运输重组人神经 肽Y仍可保持相当高的活性。所以在双重的保护下，重组人神经肽Y生物活性可以得到很 好的保护。本发明的分析鉴定1.本发明的肉眼外观观察皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳外观清凉无色、流 体性和分散性好、有明显可见乳光者。2.本发明纳米乳粒径大小、分布测定采用马尔文测定方法，取皮肤外用的重组 人神经肽Y纳米乳2ml注入测试杯中，通过粒径分析仪测定纳米乳粒子的粒径大小和分布。 纳米乳粒子的平均粒径为在IOOnm以下，粒径分布在10 IOOnm之间。3.本发明纳米乳类型的鉴定采用染色法鉴定纳米乳的类型的主要原理是通过 苏丹红(油性染料)和亚甲蓝(水溶性染料)在纳米乳中红色或蓝色的扩散快慢来判断纳 米乳的类型水溶性染料在0/W纳米乳扩散快，因为0/W纳米乳连续相为水相，水溶性染料 在水相比在油相扩散快，同样道理，油溶性染料在W/0纳米乳扩散快。经鉴定本发明皮肤外 用的重组人神经肽Y纳米乳是0/W纳米乳。4.本发明的稳定性鉴定本发明制备的重组人神经肽Y纳米乳热力学稳定性好， 手外环境影响小，可很好地保护重组人神经肽Y的生物活性。另外本发明纳米乳本身具有 防腐性能，不需要添加防腐剂，就有很好的防腐能力，保质期长。
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①对在不同温度条件下的稳定性实验取皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳产 品，置于玻璃磨口扁形瓶中，同时置于0°C、4°C、25°C、40°C、60°C、80°C温度下30天，按0、5、 10,15,30天取样。经过测定相关指标，本发明在不同温度条件下稳定性很好。②对光照的稳定性实验取皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳产品，置于玻璃磨 口扁形瓶中，同时置于日光灯和自然光下连续照射30天，按0、5、10、15、30天取样。经过测 定相关指标，本发明对光的稳定性很好。③高速离心实验取皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳产品，并置于高速离心机 所配套的离心管中，以10000-16000rpm · mirT1的速度离心30min，没有发现皮肤外用的重 组人神经肽Y纳米乳分层，说明皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳稳定。④神经肽Y生物活性的测试分别按照本发明的制备方法制备出的和传统的液体 制剂制备方法，在完全相同的条件下将同种具有生物活性的神经肽Y分别配制成皮肤外用 的重组人神经肽Y纳米乳和神经肽Y液体制剂，在完全相同的存放条件下分别于放置30天 前后分别测定神经肽Y活性，结果发现，皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳中的神经肽Y的 生物活性明显高于普通液体制剂中的神经肽Y，说明本发明能更好地保持神经肽Y肽的生 物活性。综上所述，本发明具有以下有益效果1.本发明用纳米乳系统作为药物的载体，是一种新型的药物输送和控制体系，其 包封和释药的机制是通过将活性物质包裹于纳米乳滴内部或纳米乳滴中，利用纳米乳滴的 小尺寸特点，使得肽类药物穿透组织间隙并被细胞吸收，进而可通过人体的毛细血管，也可 以通过生物膜屏障。并且纳米乳载体能提高肽类药物的稳定性和生物利用度，是多肽和蛋 白类药物的优良运输载体，有着独特的优势。2.本发明的皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳稳定性大大提高。本发明以纳米乳 作为载体形成重组人神经肽Y纳米乳，可以把重组人神经肽Y包裹在乳滴核中，使重组人神 经肽Y免受PH、温度、光照、氧浓度等对其的影响。所以本发明热力学稳定性好，可显著地提 高其稳定性，大大延长其有效期。3.本发明提高了重组人神经肽Y的生物利用度。本发明改变了 NPY肽类药物的给 药载体，而且减少了静脉注射所带来的风险和由其产生的副作用，本发明纳米乳的粘滞性， 高分散性延长了药物与粘膜的接触时间，使药物能更好地通过生物屏障，可以很长时间维 持治疗浓度，生物利用度高。4.本发明的皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳组方中的海藻糖可以作为神经肽 Y生物活性物质的稳定剂，保证了长距离运输神经肽Y仍可保持相当高的活性，大大降低神 经肽Y的贮存及运输成本。5.本发明制备的重组人神经肽Y纳米乳，其分散性、流动性、均勻性、稳定性、透皮 吸收性、与皮肤接触的面积增大、作用时间延长等共同影响，使的本发明皮肤外用的重组人 神经肽Y纳米乳的应用效果将会更加明显。6.本发明制备的皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳中的重组人神经肽Y生物活 性可以得到明显的提高。由肉豆蔻酸异丙酯、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油-3-二油酸 酯、蒸馏水组成的纳米乳液-液分散体系，可以把重组人神经肽Y包裹在纳米乳滴核中，使 重组人神经肽Y免受PH、温度、光照、氧浓度等对神经肽Y稳定性的影响，另外本发明组方中海藻糖可以作为重组人神经肽Y的稳定剂，保证了长距离运输重组人神经肽Y仍可保持相 当高的活性。所以在双重的保护下，重组人神经肽Y生物活性可以得到很好的保护。7.安全性得到提高。近年来对多肽的非注射途径给药研究虽取得一些进展，但面 临的困难仍很多。几乎所有多肽药物的粘膜传递都需要渗透促进剂，而其种类繁杂，存在刺 激粘膜和影响皮完整性的问题。而本发明制备的产品不需要添加渗透促进剂就具有渗透作 用，使应用的安全性得以提高。8.而本发明的配制成分精简、成本低廉、制备工艺简单、实际操作容易、制备高效 快速、不需要特殊仪器设备、节省原材料、降低环境污染、低碳环保。本发明的制备注意事项1.产品配制时所用的容器必须按照规定严格清洗和消毒，最好采用强酸浸泡后水 冲，再清水洗涤干净，后用蒸馏水浸泡晾干，再置于烘箱高温消毒干燥后备用；另外，在进行 产品配制时，所用容器均要特别注意防止含有杂质或金属离子及微生物等污染，以免影响 产品质量和稳定性。2.重组人神经肽Y为丁克祥教授神经肽Y研究团队自行设计合成的功效成分，其 设计和合成非常不易，因此，在配制时应及时与丁教授沟通联系，以便该课题组能完成足够 量的重组人神经肽Y合成与制备。3.严格按照上述剂量和方法进行配制。在进行该产品配制时，应根据上述流程顺 序添加，其添加剂量务必要求准确无误，而且，在其它原料的添加上，一定要等上一种加入 的原料充分溶解后才能再加入下一种原料，以免出现浑浊，影响整个纳米乳体系的配制。4.在配制外用重组人神经肽Y纳米乳时需要选择和确定S/C质量比(km值)，而 确定S/C质量比(km值)1、2、3、4，是需要进行滴定水油两相的二元液试验并通过伪三元相 图分析后才能最后确定，只有在确定并计算出得到最大的纳米乳区域的km值，才是较为理 想的km值。上述制备方法已通过试验确定Km值为3，但在实际进行产品配制时，表面活性 剂(S)和助表面活性剂按此比例仍须在进行混合后还要再充分混勻，以免影响配制效果和 质量。5.由于液态溶液的比重或密度不同的关系，在进行产品配制时，所选配制容器的 容量一定要稍大于实际配制的产品量，如配制IOOg产品，需要选择150-200mL的配制容器， 这样既便于各成分充分混合和溶解，也便于超声震荡或者搅拌混勻，而不至于往外溢出。6.空白纳米乳本身虽具有一定的抑制细菌生长的特点，本产品配方中未有另外添 加防腐剂，故在进行产品配制时，除配制容器必须进行严格清洗和消毒外，具体配制时也应 严格按照操作规程，尽可能在无菌条件下并按照无菌操作要求进行操作，避免该纳米乳样 品受到污染，影响产品质量。7.配制完成的样品务必用避光包装，并尽可能置于阴凉干燥通风避光处保存，要 远离火源或热源。另外，产品平时使用后，无须置于低温或冰箱保存，但务必加盖密封严实， 放置于自然室温避光保存即可。8.本品可能对皮肤有刺激性，如使用部位出现明显反应请立即暂停使用；在实际 使用过程中，切勿将本品弄入眼内；皮肤受伤、有伤口或红肿不得使用、使用后如有持续红 肿，应停止使用；婴儿和儿童不得使用；皮肤敏感者，使用前应做皮肤敏感性测试，测试完 全无刺激性反应方可使用。
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9.重组人神经肽Y为肽类物质，因此该固态原料需要-20°C左右冷藏较为适宜，临 用临配，且每次配制量不宜太大，配制重组人神经肽Y水溶液后，尽量现配现用，如用不完， 应置于2-8°C冰箱短期保存。10.重组人神经肽Y纳米乳放入冰箱后会出现浑浊，但恢复室温后能自行形成纳 米乳，不影响使用。


图1.重组人神经肽Y的诱导表达。图2.重组人神经肽Y的亲和层析纯化。图3.重组人神经肽Y纯化生的Western Blot鉴定。图4. 一种皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳的制备工艺流程及技术路线。
具体实施例方式实施例1 为了克服动物来源神经肽Y的免疫源性和纯度不高的稳定，本研究团队 在前期根据Gene bank中收录的NPY基因序列，设计该基因上下游序列，经过PCR反应合成 NPY的cDNA，然后与pET28a+载体重组，筛选阳性克隆和DNA序列分析鉴定，DNA序列分析 显示克隆的DNA片段是人NPY基因。且所克隆的基因共编码36个氨基酸，分子量为4. 2KD， 与GenBank中NPY基因序列同源性达100%。重组神经肽Y的制备1材料和方法1.1 材料E. coli BL21 (DE3)、含有测序正确的重组质粒pET28a_NPY的保存菌均由本室保 存；蛋白marker购自TaKaRa公司；鼠抗人Anti-6XHis抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记 的山羊抗小鼠IgG均购于天根生化科技有限公司；镍离子亲和层析预装柱及化学发光显色 试剂购于QIAGEN公司；蛋白电泳仪、电转移仪(Bio-Rad公司)；cientz-IID超声细胞粉碎 机为宁波新芝科器研究所产品；其它所用试剂均为国产分析纯试剂。1.2 方法1.2. 1重组人NPY融合蛋白的诱导表达用接种环沾取少量含有重组质粒pET28a_NPY的保存菌，于LB (Kan+)平板上划线， 37°C倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种于5ml LB (Kan+)液体培养基，37°C振荡培养过 夜。次日取培养过夜菌液500 μ 1再接种于50ml选择性LB液体培养基中，振荡培养至0D600 值达0. 6。吸取Iml后加入IPTG，终浓度为lmmol/L，37°C继续诱导培养4h。取加IPTG前 和后的菌液各lml，12000rpm离心5min，收集菌体沉淀，并于沉淀中加50 μ 1蒸馏水，混勻 后再加2 X SDS-PAGE上样缓冲液50 μ 1，混勻，沸水浴5min，12000rpm离心lOmin，每个样品 取20 μ 1上样于15%的SDS-PAGE胶上电泳，电泳结束后取考马斯亮兰R250染色2h，然后 脱色，拍照记录结果。1.2. 2包涵体的释放据上所述，在2000ml的摇瓶中装500ml的LB液体培养基扩大诱导规模。将诱导表 达菌液，4°C以5000rpm离心15min，收集菌体沉淀；加入25mlPBS，吹打充分悬浮菌体沉淀，40C 12000rpm离心30min，弃去上清，依此反复冲洗菌体沉淀3次；加入细胞裂解液25ml， 吹打使菌体沉淀均勻悬浮；将菌体沉淀悬浮液置-20°C冷冻，再于室温融化，如此反复冻融 3次；4°C 12000rpm离心细菌冻融液30min，弃去上清，在沉淀中加入超声裂解液25ml，吹 打混勻；置冰上对细菌冻融液进行超声处理，IOmin/次，处理时间30min ；超声处理后，于 40C 12000rpm离心30min，弃去上清，沉淀为菌细胞裂解沉淀物.1.2. 3包涵体的提纯于菌细胞裂解沉淀物中加入含4mol/L尿素的包涵体提纯液25ml，吹打混勻，室温 静置30min，12000rpm离心30min，反复3次，即得到包涵体沉淀物。1.2. 4包涵体的裂解于包涵体沉淀物中加入包涵体裂解液25ml，吹打混勻，室温静置6h，使包涵体充 分裂解，2000rpm离心30min，收集上清液，即为包涵体裂解物。1.2. 5变性蛋白的复性将收集的包涵体裂解物上清液加入到处理过的透析袋中，扎紧透析袋两端；将透 析袋整体浸没于蛋白复性液，在4°C条件下透析；复性液中的尿素浓度从7m0l/L-lm0l/L依 次递减，在每个尿素浓度梯度复性液中透析3-4h。每次更换不同尿素浓度复性液之前，需要 将透析袋内的样品吸出，在4°C 12000rpm离心30min，再把上清液加入透析袋内，重新扎紧 进行透析；透析完毕后，将样品取出，4°C 12000rpm离心30min，再将上清液加入透析袋，在 4°C预冷的PBS中透析20h ；取出透析好的样品，4°C 12000rpm离心30min，收集上清液即为 复性产物。-70°C保存。1.2. 6复性产物的纯化①上样将复性产物缓慢加于已用PBS缓冲液平衡的镍离子亲和层析预装柱中， 加样所用的流速要控制在lmL/min以内；②冲洗PBS洗涤除去未结合蛋白，冲洗流速应控 制在5mL/min以内；③洗脱分别用含50、100、150mmol/L咪唑PBS缓冲液洗脱融合蛋白，流 速5mL/min。纯化后取20 μ 1上样于15%的SDS-PAGE胶上电泳。1. 2. 6 纯化产物 Western blot 检测取纯化后产物20 μ 1上样于15%的分离胶SDS-PAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素 膜上膜上，进行Western blot印迹分析。一抗为鼠抗人Anti-6 XHis (1 1000稀释)，二 抗为辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG抗体(1 5000稀释)，采用化学发光法显影，于X 光片上曝光。2 结果2. 1 诱导 pET28a_NPY 表达 NPY 结果pET28a-NPY表达的NPY在N端有非NPY的36个氨基酸的融合蛋白，其中有6个组 氨酸的tag(HiS-tag)，目的蛋白NPY有36个氨基酸组成，由于设计NPY引物时在编码NPY 第36个氨基酸的碱基后紧接着插入了一个终止密码子，因此，pET28a-NPY表达的NPY在C 端的最后一个氨基酸为目的蛋白NPY的第36个氨基酸。即pET28a-NPY表达的完整融合蛋 白由72个氨基酸组成，分子量约小于10KD。pET28a-NPY经IPTG诱导结果见图1，在低于 IOKD的位置有明显的诱导蛋白表达，NPY重组菌在IPTG诱导前几乎无表达。2. 2融合蛋白纯化后的鉴定NPY蛋白在含150mmol/L咪唑PBS缓冲液可以完全被洗脱，分别进行15 %的SDS-PAGE电泳鉴定(图2)。2. 3纯化蛋白的Western Blot结果用化学发光法显影，X光片曝光后可见一清晰条带，表明目的蛋白得到有效表达和 纯化，如图3示。我们利用DNA重组技术克隆了 NPY基因，且将其与pET28a载体连接后表达于DE3 中。即以BL21(DE3)/pET228a+作为表达体系。pET_28a表达载体在N端含有His-Tag寡聚 组氨酸链，因此，表达出的融合蛋白在多种情况下都可以便利地和经济地进行纯化。我们所 设计的NPY融合蛋白N端为36个氨基酸组成的非目的蛋白，其中包含一个His-tag，其后 的目的NPY蛋白也有36个氨基酸。即pET28a-NPY表达的融合蛋白共由72个氨基酸组成， 分子量约IOKD左右。用6Xhis-tag抗体进行western blot鉴定，表明有大量融合蛋白产 生。其分子量与NPY融合蛋白相符。实施例2 皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳制备技术1)配制主要原料⑴空白纳米乳原料及来源①肉豆蔻酸异丙酯(IPM)为上海 润捷化学试剂有限公司或者上海国药集团化学试剂有限公司产品，含量> 98% )，原料购 买电话021-52511155。②辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)为法国GATTEF0SSE公 司产品，代理商上海森君化工制药辅料有限公司，原料购买电话021-51611173。③聚甘 油-3-二油酸酯(Plurol Oleique CC497):为法国GATTEF0SSE公司产品，代理商上海森 君化工制药辅料有限公司，原料购买联系电话021-51611173。④蒸馏水实验室自制。(2)皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳中主要功效成分及本样品原料来源神经 肽Y (本课题组自行设计、合成并制备)。2)配制主要器材及软件分析天平、电子天平、液体快速混合器、定时恒温磁力搅 拌器、超声震荡仪、石英管玻璃双重蒸馏水器、一定规格的容器、烧瓶、烧杯、吸管、滴定管 等。另外，还有分析软件Origin 7. 0图形分析系统(美国Microcal公司)。3)完整配方组成及精确用量(以配制IOOg为例)神经肽Y纳米乳的配方组成及 用量肉豆蔻酸异丙酯10g，辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯30g，聚甘油-3-二油酸酯10g，海藻 糖2g，神经肽Y水溶液48g，共计100g。4)重组人神经肽Y纳米乳的具体制备方法及实施举例(*以配制IOOg为例，如需 要扩大配制，可以依此类推)①重组人神经肽Y水溶液配制将0. 0005g神经肽Y和2g海藻糖溶于47. 9995g 蒸馏水。将此溶液作为水相50g( I )。②用分析天平准确称取IOg重量的肉豆蔻酸异丙酯，置于另一个经过洗消过的 50mL三角烧瓶之中并用记号笔清楚标记为油相(II )10g。③按照事先已设计好的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(S)聚甘油-3- 二油酸酯(C) =3 1的比例，分别准确称取30g辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和IOg聚甘油-3-二油酸酯， 并将这两者原料置于第三个经过洗消过的IOOmL洁净三角烧瓶之中；加盖，并将此三角烧 瓶迅速置于液体快速混合器上，打开液体快速混合器，并将其调至II档，充分混合均勻，使 之形成乳化剂/助乳化剂(S/C)混合物，3-5min后，关闭液体快速混合器，取下三角烧瓶，并 用记号笔清楚标记为S/C混合物(III )40g。④按照油相(II ) S/C混合物(III)水相(I ) = 10% 40% 50%的比
17例，先分别取水相(I ) 50g、S/C混合物(III) 40g置于第四个经过洗消过的200mL洁净三 角烧瓶之中。⑤将上述水相(I )、S/C混合物(III)两液相充分混合后，再在室温25°C条件下 或者自然室温中，将其放入超声振荡器中震荡并超声2min左右，或者在室温25°C条件下或 者自然室温中，启动定时恒温磁力搅拌器，以200rpm ^mirT1的转速磁力搅拌5min，然后，再 在此容器中直接加入油相(II )10g，并将整个体系在超声振荡器中超声5min左右，或者在 室温25°C条件下或者自然室温中，启动定时恒温磁力搅拌器，以200rpm · mirT1的转速磁力 搅拌20min。⑥关闭超声振荡器或者定时恒温磁力搅拌器，取下200mL三角烧瓶，观察其外观 如是清亮无色、流体性和分散性好、有明显可见乳光者，即为IOOg皮肤外用的重组人神经 肽Y纳米乳。⑦将此IOOg皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳迅速分装于不同规格的避光玻璃 容器之中，迅速加盖，包装，并置于4°C冰箱中密闭保存即可。⑧按照国际或国内或企业相关标准和要求，从上述分装产品中随机抽样，首先采 用马尔文仪器检测该纳米乳样品的颗粒分布及粒径大小，在符合纳米乳的质量标准后，再 按照国家有关部门的具体要求，进行相关指标的系统检测；待判断或评价其完全符合国家 相关规定和标准及批准文号后，即可作为产品上市销售或在美容院内专用。本发明所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明 构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中工程技术人员对本发 明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技 术内容，已经全部记载在权利要求书中。
权利要求
一种皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳，由重组人神经肽Y、海藻糖、肉豆蔻酸异丙酯、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油 3 二油酸酯、蒸馏水组成的液 液分散体系，其特征是由下述重量百分比的原料制成重组人神经肽Y0.0003％～0.0006％海藻糖 1％～3％肉豆蔻酸异丙酯 5％～15％辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 25％～32％聚甘油 3 二油酸酯7％～12％蒸馏水 45％～52％上述原料的总重量百分比为100％。
2.根据权利要求1所述皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳，其特征是由下述优选重量百分比的原料制成重组人神经肽Y0. 0005%海藻糖2%肉豆蔻酸异丙酯10%辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯 30%聚甘油-3-二油酸酯10%蒸馏水47.9995%上述原料的总重量百分比为100%。
3.根据权利要求1和权利要求2所述的皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳，其特征在 于所述的皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳的制备方法包括以下步骤①重组人神经肽Y水溶液配制根据配方量将重组人神经肽Y和海藻糖溶于蒸馏水，将 此溶液作为水相(I )；②用分析天平准确称取配方量的肉豆蔻酸异丙酯，置于另一个经过洗消过的三角烧瓶 之中并用记号笔清楚标记为油相(II )；③按照事先已设计好的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(S)聚甘油-3-二油酸酯(C)= 3 1的比例，分别准确称取配方量的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油-3-二油酸酯，并 将这两者原料置于第三个经过洗消过的洁净三角烧瓶之中；加盖，并将此三角烧瓶迅速置 于液体快速混合器上，充分混合均勻，使之形成乳化剂/助乳化剂(S/C)混合物，3-5min后， 关闭液体快速混合器，取下三角烧瓶，并用记号笔清楚标记为S/C混合物(III)；④按照油相(II) S/C混合物(III)水相(I ) = 10% 40% 50%的比例，先 分别取水相(I )、S/C混合物(III)置于第四个经过洗消过的洁净三角烧瓶之中；⑤将上述水相(I)、S/C混合物(III)两液相充分混合后，再在室温25°C条件下或 者自然室温中，将其放入超声振荡器中震荡并超声2min左右，或者在室温25°C条件下或者 自然室温中，启动定时恒温磁力搅拌器，以200rpm ^mirT1的转速磁力搅拌5min，然后，再在 此容器中直接加入油相(II )，并将整个体系在超声振荡器中超声5min左右，或者在室温 25°C条件下或者自然室温中，启动定时恒温磁力搅拌器，以200rpm · mirT1的转速磁力搅拌 20min ；⑥关闭超声振荡器或者定时恒温磁力搅拌器，取下三角烧瓶，观察其外观如是清亮无色、流体性和分散性好、有明显可见乳光者，即为一种皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳；⑦将此一种皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳迅速分装于不同规格的避光玻璃容器 之中，迅速加盖，包装，并置于4°C冰箱中密闭保存即可。
4.根据权利要求3所制备出的一种皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳，其特征在于所 述的皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳的乳液滴粒径为10 lOOnm。
全文摘要
本发明提供一种皮肤外用的重组人神经肽Y纳米乳及其制备方法。本发明使重组人神经肽Y免受温度、光照、氧浓度等对其的影响，可长久保持重组人神经肽Y的生物活性。重组人神经肽Y纳米乳皮肤外用给药可避免注射给药给患者带来的副作用，还可避免口服给药容易被胃肠道蛋白水解酶降解、首过效应的问题，此外利用纳米乳的小尺寸特点，纳米乳的粘滞性，高分散性延长了与皮肤的接触时间，使得重组人神经肽Y容易穿透皮肤组织，克服了传统透皮制剂的透皮率小，生物利用度低的情况。另外本发明提供的重组人神经肽Y纳米乳制备方法可靠易行、制备工艺简单、实际操作容易、不需要特殊仪器设备、可降低环境污染、低碳环保，具有广阔的市场前景。
文档编号A61K9/107GK101897956SQ20101022576
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月13日 优先权日2010年7月13日
发明者丁克祥, 丁宇, 左夏林, 朱晓亮, 杨永鹏, 董萍 申请人:董萍;丁克祥