专利名称：柯里拉京在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种化合物柯里拉京(Corilagin)，尤其是涉及一种柯里拉京在制备 抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肿瘤(tumor)是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤(Malignant Tumor, cancer) 是目前危害人类健康最严重的一类疾病。根据我国卫生部公布的资料，2006年我国恶性肿 瘤在农村和城市人口中死亡率均居第一位。并且恶性肿瘤的危害性还在日益增加。目前， 我国常见的10大恶性肿瘤为肺癌、胃癌、食管癌、肠癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、恶性 淋巴瘤、鼻咽癌。在诸多恶性肿瘤中，肝癌、卵巢癌是最难治疗的一类，患者的死亡率常年居 高不下，5年存活率很低，因此它们都成为了抗肿瘤药物研发的热点。肝癌(hetatocellular carcinoma, HCC)禾口卵巢癌(Ovarian cancer)均是临床 上治疗难度大的恶性肿瘤，迄今仍缺乏理想的治疗药物。其早期一般无临床症状，很难发 现，而一旦出现典型的临床表现，通常已经属于中晚期，发生了侵袭转移，患者死亡率非常 高。其中，肝癌，俗称“癌中之王”，属于中医肝积、肥气、癥积、膨胀、癖黄等范畴，恶性程度 高，发展迅速，自然生存期短，5年生存率仅为14% 30%。全世界每年新发现的恶性肿瘤 病人42. 5%发生在中国，且年龄多为40 50岁。而卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之 一，发病率仅次于子宫颈癌和乳腺癌而列居第三位。但因卵巢癌致死者，却占各类妇科肿瘤 的首位，对妇女生命造成严重威胁。到目前为止，就国内外临床资料统计，其5年生存率仅 25% 30%。柯里拉京又称诃子次鞣素、鞣料云实素等，化学名为1-0-没食子酰-3，6-0-六羟 基联苯二甲酰-D-葡萄糖，是从大戟科叶下株属植物中分离一种鞣质，由于鞣质在早 些年代常被看作是植物中的无效成份，因而在天然药物研发过程中，都希望去除得越彻底 越好，导致迄今国内外对柯里拉京的而研究较少，主要集中在抗病毒、抗血脂、抗血压、抗 凝血等方面。目前，国内仅有的7个公开专利(CN101461816A、CN1709901A、CN1695647A、 CN1695627A、CN1197641A、CN101461831A、CN101613382A)涉及到柯里拉京的制备、抗乙型肝 炎、胃酸过多等方面的研究；且在抗肿瘤药物的研究方面，未见关于药理学和分子机制的国 内专利。
发明内容
本发明的目的在于提供柯里拉京在制备抗肿瘤药物中的应用。所述柯里拉京又称诃子次鞣素、鞣料云实素等，是从大戟科叶下株属植物中分离 出的一种鞣质，所述柯里拉京(Corilagin)的化学名为1_0_没食子酰-3，6_0_六羟基联苯 二甲酰-3 -D-葡萄糖，其分子式为C27H22018，结构式如下 所述抗肿瘤药物包括抗肿瘤生长药物或抗肿瘤侵袭转移方面的药物等。所述抗肿瘤药物可为口服药剂或注射药剂等。所述注射可为静脉注射、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射等。本发明所述柯里拉京可以采用中国专利CN1197641A或CN1709901A中公开的方法 制备。实验表明，柯里拉京具有很好的抗肿瘤效果，不管是在体外肿瘤细胞实验，还是对 体内肿瘤动物模型都有很好的疗效。所述柯里拉京是一种具有抗肿瘤药效的新化合物，可 用于制备抗肿瘤药物。本发明以肝癌和卵巢癌为模型，研究柯里拉京在体外的细胞水平、分子水平上 对肝癌细胞Be 17402、SMMC7721及卵巢癌细胞Hey、SK0V3ip的增殖，凋亡、细胞周期阻滞 和相关信号传导通路中蛋白的分泌情况等作用效果，以及在裸鼠体内对高转移肝癌细胞 MHCC97-H的生长、转移的作用效果，揭示柯里拉京干预肿瘤侵袭转移和血管生成的信号传 导机制，确定抗肿瘤的作用靶点，建立柯里拉京作为药物治疗恶性肿瘤生长和侵袭转移的 有效策略。本发明所涉及的抗肿瘤药物，可以是柯里拉京按照常规的药物制剂工艺，制备成 一种适合临床上使用的药物制剂，并具备良好的抗肿瘤生长和侵袭转移疗效。
图 1 为本发明 MTT 测定 72h柯里拉京 Chang-liver、Bel7402、SMMC7721、Hey 细胞增 殖的抑制效果。在图1中，横坐标为柯里拉京浓度(P g/mL)，纵坐标为细胞抑制率(％ ) ;A 柯里拉京对Chang-liver、Bel7402、SMMC772172h的细胞增殖的抑制效果； Chang-liver， ■ Bel7402，▲ SMMC7721 ；B 柯里拉京72h对N0E001细胞增殖的抑制效果；C 柯里拉京72h 对Hey细胞增殖的抑制效果。图2为本发明所述柯里拉京对卵巢癌细胞Hey的细胞周期阻滞作用。在图2中纵 坐标Number为检测器所检测到的细胞数量，横坐标Channel (FL2-A)为检测器中细胞DNA 含量；图(a)、(b)、(c)分别为对照组中24h、48h、72h流式结果；图(A)、(B)、(C)分别为柯 里拉京处理细胞24h、48h、72h后的流式结果。图3为本发明所述柯里拉京对SK0V3ip细胞中TGF-0 /PI3K/Akt/Snail信号通 路的影响。在图3中，A 柯里拉京对SK0V3ip细胞内AKT和pAKT的作用；No treat 没有 药物处理；A-treated 短叶苏木酚酸乙酯处理《-treated 柯里拉京处理；B 柯里拉京对SK0V3ip细胞内TGF-3的作用；C 柯里拉京对SK0V3ip细胞内Snail的作用。图4为本发明柯里拉京对裸鼠体内肿瘤生长的抑制作用。在图4中，(a)为阴性对 照组，(b)为阳性对照组，(A)为10mg/kg柯里拉京组，⑶为20mg/kg柯里拉京组，(C)为 30mg/kg柯里拉京组。
具体实施例方式以下实施例通过柯里拉京在体内外对肝癌和卵巢癌的抑制效果，以及在分子水平 上阐述的抗肿瘤机理来说明本发明，但并不代表本发明只限于该实施例。对福建闽南地区的民间偏方和中医验方中涉及的45科114种南药，通过活性跟 踪进行大规模的筛选，最终筛选出8科12种具有明显抗癌效果的中草药，通过综合评价发 现叶下珠(Phyllanthus urinaria L.)和珠子草(Phyllanthus niruri L.)两种大戟科 植物最具潜力。继续对该两种植物中抗癌活性成分进一步研究发现，其中主要的抗肿瘤 活性成分为单一化合物，呈白色针晶状粉末，从质谱和元素分析推出该化合物为柯里拉京 (Corilagin,分子式为 C27H22018)。实施例1柯里拉京在体外对肝癌细胞和卵巢癌细胞以及正常细胞的抑制效果实验材料细胞株、培养液、药品人肝癌细胞Be 17402、SMMC7721、人卵巢癌细胞 Hey、人正常肝细胞Chang-liver以及人正常卵巢上皮细胞N0E001购自中国科学院上海细 胞生物学研究所；培养基RPMI 1640购自GIBC0公司，胎牛血清购自Hyclone公司，青霉 素、链霉素购自上海生工公司；3-(4，5_ 二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(简称为 MTT)、二甲基亚砜(简称为DMS0)等购自Sigma公司或国内其他公司。实验方法将一组浓度为0、6. 25、12. 5,25,50,100,200 u g/mL的柯里拉京分别作 用细胞 Bel7402、SMMC7721、Hey、Chang-liver 和 N0E00172h，再用 MTT 法测定。具体方法 如下(1)取对数生长期细胞，0. 25%胰酶消化，用细胞培养液制成5 X 104个/mL单细胞悬 液接种于96孔板，每孔100 y L ；⑵培养24h后，吸去细胞培养液，分别加入100 u L对照 组培养液及含柯里拉京的实验组培养液，每组4个重复孔；(3)继续培养72h后，吸去培养 液，每孔加人200 u L MTT (0. 5mg/ml)，再继续培养4h ； (4)吸去上清，加200 u L DMS0,振荡 lOmin，使结晶充分溶解，在酶标仪上读取490nm处吸光度(0D)值。根据光吸收值计算人参 皂苷IH901处理后的细胞相对存活率。结果表明，柯里拉京对肿瘤细胞Bel-7402、SMMC7721和Hey的抑制作用都极为显 著(图 1)。其 72h 的 IC5Q 分别达到 19. 67 u g/mL、17. 0 u g/mL、13. 56 u g/mL,且呈现浓度-效 应依赖关系。而对正常细胞Chang-liver、N0E001的毒副作用很低，IC5(1达到100. g/mL， 92. 22y g/mL。实施例2柯里拉京对卵巢癌细胞Hey的细胞周期的阻滞作用将Hey细胞接种于60mm培养皿中，加入17 i g/ml柯里拉京共同培养24h、48h、 72h(方法同实施例1)，并做好对照。经过含0. 1 % RNaseA的5mg/ml PI避光处理lOmin 后，用流式细胞仪检测。结果表明，在24h至72h，对照组的G0/G1期从48. 88%下降到39. 29%，而柯里拉 京组从54. 85%上升到71. 75% (图2)。由此可见，柯里拉京能够使得卵巢癌细胞Hey的细 胞周期阻滞在G0/G1期，并且呈时间-效应依赖性。柯里拉京对卵巢癌细胞Hey的细胞周
5期阻滞作用参见表1。表 1 实施例3柯里拉京对SK0V3ip细胞中TGF_ ^ /PI3K/Akt/Snail信号通路的影响细胞接种将人卵巢癌细胞SK0V3ip混勻于10% FBS RPMI 1640接种于60mm培 养皿中，每个皿的细胞数为3.5 X105个。加药将细胞依次加入32iig/mlA药，17iig/ml C药。12h后饥饿将培液换成RPMI 1640无FBS，药浓度同前。36h后将每组的两皿细胞中的一皿分别加入表皮生长因子EGF(浓度为20 y g/ ml)，作用lOmin后提蛋白。Western blot检测pAkt及Akt 用Bradford法蛋白定量法使每孔蛋白总量为 20 u g，分别用pAkt (p473)和Akt抗体检测(CST公司，兔抗，抗体浓度1 1000)。结果表明，柯里拉京能够通过对TGF-0 /PI3K/Akt/Snail这一个与肿瘤生长和侵 袭转移密切相关的信号通路的研究发现，柯里拉京能够明显抑制SK0V3ip细胞内TGF-3 / PI3K/Akt/Snail信号通路，其主要是抑制TGF-0 1的分泌，并呈剂量效应(图3A)，还能 明显降低Akt的磷酸化(图3B)，进而降低卵巢癌细胞中Snail的表达(图3C)，这样就 能够通过TGF-0/PI3K/Akt/Snail的信号通路，下调E钙粘蛋白(E-cadherin)的分泌。 而 E-cadherin 能够加快上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的过程，使得细胞失去细胞极性和细胞间连接，细胞外基质成分发生降解，细胞变得具 有迁移性，能够从上皮游离下来并迁移到不同的部位，最终促进肿瘤侵袭转移。因此降低 TGF-^/PI3K/Akt/Snail蛋白的表达，就能够抑制肿瘤的侵袭转移。实施例4柯里拉京对BALB/c裸鼠体内成瘤实验的抑制效果BALB/c裸鼠25只，4_ 6周，体重20 25g，雌雄约各一半，分为5组，每组5只。 每只裸鼠右侧背部皮下注射0. 2mL的1 X 107个/mL MHCC97-H单细胞悬液。腹腔注射给药， 0. 2mL/次，隔天注射一次，共计12次。以生理盐水为阴性对照，环磷酰胺CTX为阳性对照，肝癌MHCC97-H裸鼠模型结果 显示，在抑制肿瘤生长方面，柯里拉京与阳性对照的CTX的效果相当，30mg/kg柯里拉京抑 制效果为35. 19%，而25mg/kg CTX的抑制效果为32. 01% (图4)；而在抑制肿瘤侵袭转移 方面，柯里拉京用药组中，只有20mg/kg柯里拉京用药组中有2只裸鼠发生轻微转移，其他 13只没有发现肝转移，侵袭转移的抑制效果高达86. 7%，相对于阴性对照组和阳性对照组都100%发生肝转移。柯里拉京对裸鼠体内肿瘤生长和侵袭转移的抑制作用参见表2。表 2 与阴性对照组比较，*P < 0. 05/*P < 0. 01 ；+表示有肝转移现象发生，/表示无肝 转移现象发生。
权利要求
柯里拉京在制备抗肿瘤药物中的应用，所述柯里拉京的化学名为1-O-没食子酰-3，6-O-六羟基联苯二甲酰-β-D-葡萄糖，其分子式为C27H22O18，其结构式如下FSA00000187995300011.tif
2.如权利要求1所述的柯里拉京在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述抗肿瘤 药物包括抗肿瘤生长药物或抗肿瘤侵袭转移方面的药物。
3.如权利要求1所述的柯里拉京在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述抗肿瘤 药物为口服药剂或注射药剂。
4.如权利要求3所述的柯里拉京在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述注射为 静脉注射、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。
全文摘要
柯里拉京在制备抗肿瘤药物中的应用，涉及一种化合物柯里拉京。所述柯里拉京的化学名为1-O-没食子酰-3，6-O-六羟基联苯二甲酰-β-D-葡萄糖，其分子式为C27H22O18。所述抗肿瘤药物包括抗肿瘤生长药物或抗肿瘤侵袭转移方面的药物等。所述抗肿瘤药物可为口服药剂或注射药剂等。所述注射可为静脉注射、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射等。实验表明，柯里拉京具有很好的抗肿瘤效果，不管是在体外肿瘤细胞实验，还是对体内肿瘤动物模型都有很好的疗效。所述柯里拉京是一种具有抗肿瘤药效的新化合物，可用于制备抗肿瘤药物。
文档编号A61P35/00GK101879173SQ20101022572
公开日2010年11月10日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者吴美爱, 明艳林, 童庆宣, 郁茵华, 郑国华, 郑志忠, 金鸿雁, 陈良华 申请人:厦门华侨亚热带植物引种园