一种新型膜分子的抗炎作用、实施方法及用途的制作方法

专利名称：一种新型膜分子的抗炎作用、实施方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及整合素 aM(integrinaM, Itgam)在细菌感染性疾病中的效应、作用机制、实施方法和用途。
背景技术：
细菌感染是临床常见的疾病，可以导致机体局部和全身的感染性表现，甚至可以最终导致感染性休克、内毒素性休克以及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等严重后果，一旦重度感染导致出现休克或者多器官功能衰竭，则引起高死亡率( 50-80% )表现。常见的临床细菌感染，如大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌等均可以导致机体局部和全身的炎症反应，引起不同程度的感染性疾病的发生。对于细菌感染患者，医生一般采用大剂量抗生素“轰炸”，意欲“一举歼敌”，快速、 彻底杀灭病原体，但是往往忽略了另一方面，即在病菌死亡后会释放大量毒素，通过毒素来引起严重的系统性症状。诱发全身性炎症的毒素主要有两类内毒素(革兰阴性细菌细胞壁的脂多糖成分)和超抗原(包括革兰阳性细菌的肽聚糖/脂磷壁复合物、外毒素等毒素)。目前细菌感染导致的休克和多器官功能衰竭仍然是临床预防和治疗的重大挑战。人们对于机体识别外来微生物的分子机制并不完全了解，但是随着Toll样分子的发现，机体针对微生物所产生的天然免疫和继发的获得性免疫的细胞和分子生物学基础逐步得到了认识。Toll样受体(TLRs)是一类模式识别受体，广泛分布于免疫细胞，如树突状细胞和巨噬细胞表面，可以通过病原微生物特定的病原体相关分子模式识别抗原并激活相应的信号通路，启动天然免疫应答，构成机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线。TLRs是I型跨膜蛋白，属于HR(Toll/IL-l receptor)超家族成员，Toll蛋白最早发现在果蝇胚胎发育过程中，对背腹侧体轴细胞的形成起重要调控作用Hashimoto，C.等，Cell. 1988 ；52 269-279 ；Anderson, K. V.等，Cell. 1985 ；42 :791_798。Toll蛋白在物种进化上高度保守，目前为止在哺乳动物相继发现了 11种Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)Medzhitov，R.等，Nature. 1997 ；388 :394-397 ；Rock, F. L.等，Proc Natl Acad Sci USA. 1998 ；95 :588_593。不同的 TLR 识别不同病原体中相应的特定结构的分子，这些分子是一类大多数病原微生物所共有的组成性表达的分子，结丰勾 呆守，称为病原体才目关分子模式(Pathogenassociated molecular patterns,PAMPs) ；Μ 相应的受体则为模式识别受体(Patternrecognition rec印tors，PRRs)。天然免疫系统通过PRR识别病原体保守的PAMP，构成机体抗感染的第一道防线，同时对获得性免疫也具有重要的调节作用。人类TLRl、TLR2、TLR3和TLR6定位于4号染色体，其中TLR2识别革兰氏阳性菌成分细菌脂蛋白BLP等成分，并与TLR6协同作用识别PGN分子等，TLR3则识别病毒分子中双链 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)Takeuchi，0.等，Immunity. 1999 ；11 :443-451 ；
3Ozinsky, A.等，Proc Natl Acad Sci USA. 2000 ；97 :13766-13771 ；Alexopoulou, L.等， Nature. 2001 ；413 :732-738。人类TLR4和TLR5分别定位于9和1号染色体，相应识别革兰氏阴性菌细胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharid^LPS)和细菌鞭毛蛋白分子(flagelin)Poltorak Α. φ, Science. 1998 ；282 :2085-2088 ；Hayashi F. φ, Nature. 2001 ； 410 1099-1103；人类TLR7和TLR8基因定位于染色体Xp22，识别病毒分子中的单链 RNA(single-strandedRNA, ssRNAs)Heil，F.等，Science. 2004 ；303 :1526_1529；人类 TLR9定位于染色体3p21. 3，识别细菌和病毒DNA中的CpG基序或人工合成的CpG寡核昔酸(CpG oligodeoxynucleotides, CpG 0DN) [Hemmi, H.等，Nature. 2000 ；408 :740-745]； TLRll为TLRs家族新成员，主要表达于泌尿系统，在控制泌尿系统细菌感染的过程中发挥重要作用[Zhang D.等，Science. 2004 ；303 :1522_1526。目前研究发现，TLR不仅与机体的抗感染免疫密切相关，而且与很多种疾病的发生和进展具有因果关系。微生物在进入机体后可以快速激活机体的天然免疫系统，由巨噬细胞、树突状细胞(DC)等免疫细胞以及内皮细胞系统产生大量的炎性因子(如TNF α、IL-I 和IL-15、I型干扰素等)，一方面直接杀死和消除外来病原体，一方面诱导针对病原体的特异性获得性免疫。如果机体不能够及时有效地清除病原体，则机体就会产生慢性炎症 (如结核病、慢性肝炎、慢性肾炎以及慢性胃肠道疾病)，而且会引起机体免疫系统功能的紊乱，长期的慢性炎症可以引起继发的多种临床疾病Cook，D.N.等，Nat Immunol. 2004, 5:975-979。研究发现，多种自身免疫病、过敏性疾病、动脉粥样硬化、甚至包括多种肿瘤均与慢性炎症密切相关，其发病机制涉及TLRs的信号传导异常Cook，D.N.等，Nat Immunol. 2004,5 :975-979。TLRs信号通路作为机体固有免疫的第一道屏障，通过诱导产生炎性因子和干扰素来清除病原体，维持机体内环境的稳定，然而，TLRs的活化是一把双刃剑，过多的炎性因子产生会导致各种炎症性疾病和自身免疫病。炎症性疾病如内毒素休克的机理是由于病灶或血流中革兰氏阴性病原菌大量死亡，释放出来的大量内毒素进入血液时，可发生内毒素血症。大量内毒素作用于机体的巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、血小板，以及补体系统和凝血系统等，便会产生白细胞介素1、6、8和肿瘤坏死因子α、组胺、5羟色胺、前列腺素、激肽等生物活性物质。这些物质作用于小血管造成功能紊乱而导致微循环障碍，临床表现为微循环衰竭、低血压、缺氧、酸中毒等，于是导致病人休克，严重者可致死亡。其本质是大量生物毒素引发的机体过度的炎性反应导致机体自身的损伤，在此过程中，免疫细胞表面的 TLRs介导的炎性反应是其致病机理的重要环节。因此，TLR信号通路的活化必须受到严格的调控，防止其过度活化，尤其是炎性因子的过度产生。TLR受体与相应配体结合可以分别活化下游的MyD88(myeloiddifferentiation factor 88)依赖性通路和 TRIF(Toll/IL-lrec印tor (TIR)-domaincontaining adaptor protein inducing IFN-β )依赖性通路，MyD88 既而活化下游的 IRAKs、TRAF6、TAKl 及 IKK 和MAPK等信号分子，最终导致NFk B和APl的早期活化，介导炎性因子如TNF-α，IL-6, IL-I β和一氧化氮的产生；TRIF的活化能激活ΤΒΚ1、TRAF3和IRF3，最终导致I型干扰素的产生和干扰素诱导基因的活化，如CXCL10和CCL5等Akira，S.等，Nat. Rev. Immunol. 4， 499-511(2004) ；Liew, F. Y.等，Nat. Rev. Immunol. 5，446-458 Q005)。目前的研究表明很多跨膜和胞内分子都能够负调节TLR信号通路，抑制MyD88依赖性通路的活化和炎性因子的产生，如A20，CYLD, DUBA, SHP-I等，还有某些分子通过减少细胞膜表面TLRs受体的表达来达到负调节的目的Akira，S.等，Nat. Rev. Immunol. 4， 499-511(2004) ；Liew, F. Y.等，Nat. Rev. Immunol. 5，446-458 Q005)。针对 TLR 介导的信号传导通路进行的研究和试验已经表明，抑制TLR信号传导的各个环节可以有效地控制细菌感染所导致的炎症性反应，预防和治疗细菌感染导致的休克、器官功能损伤等严重的后果。已有研究发现TLR拮抗剂可以应用于感染性疾病的预防和治疗，如TLR4拮抗剂 TAK-242, E5564等可以应用于严重的败血症(III期临床试验)[Liew, F. Y.等，Nat. Rev. Immunol. 5,446-458(2005) ；Cook, D. N.等，Nat Immunol. 2004，5 :975-979。Itgam,又称⑶11b，属于α整合素家族，与β 2整合素(⑶18)组成异链受体，即 Mac-I (macrophage antigen-1)或 CR3 (complement receptor 3),其配体包括细胞间黍占附分子(intracellular adhension molecule, ICAM) 1/2/3、补体 iC3b、纤维原(fibrinogen) > 纤维素(fibronectin)、变性蛋白等，高表达于巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cell, DC)、NK细胞和中性粒细胞等髓系来源细胞，调节细胞黏附、活化和吞噬等Kinashi，Τ.等， Nat. Rev. Immunol. 2005，5 :546-559 ；Evans, R.等，J. Cell Sci. 2009，122 :215-225.。已有研究表明镁离子活化DCs上表达的Itgam能够抑制T细胞活化，而Itgam阻断性抗体阻断DCs上Itgam活化则能增强T细胞活化Varga G.等，Blood 2007，209 :661-669.， Itgam的缺陷的小鼠对DSS (dextran sodium sulfate)诱导肠炎更严重Abdelbaqi， M.等，Lab. Invest. 2006,86 :380-390，可能的机制是Itgam能够抑制ThI7细胞分化 [Ehirchiou, D.等，J.Exp. Med. 2007，204 :1519_1524。CDllb+Grl+的髓系来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)能够诱导 T 细胞耐受或低反应性，MDSCs 高表达⑶11b，但⑶lib对MDSCs抑制性功能是否有影响仍未知Gabrilovich，D. I.等， Nat. Rev. Immunol. 2009,9 162-174。第二军医大学免疫学研究所研究发现，脾脏、肝脏和肺基质细胞的微环境能够产生一群高表达CDllb的新的调节性的DC亚群(regulatory DC，DCreg) [Zhang,Μ.等，Nat. Immunol. 2004, 5 :1124-1133 (2004).，DCreg也能够抑制T细胞反应或活化，并促进免疫耐受维持，抑制哮喘和肝炎Tang，H.等，Blood 2006，108 :1189-1197 ；Xia, S.等，Blood 2008，112 :3175-3185 ；Li, Q.等 Eur. J. Immunol. 2008,38 :2751-2761 。以上研究表明 CDllb能够获得性免疫，但CD1 Ib在天然免疫中的作用尚未明确。综上所述，本领域迫切需要开发出一种可有效抵抗细菌感染、抑制炎性因子产生的免疫学活性物质。

发明内容
本发明正是提供了 Itgam蛋白或其编码序列在有效抵抗细菌感染、抑制炎性因子产生中的新用途。在本发明的第一方面，提供了 Itgam或其编码序列在制备用于预防和/或治疗细菌感染相关疾病和/或征状的药物中的用途。在本发明的一个实施方式中，所述细菌感染相关疾病和/或征状为选自下组的一种或多种细菌感染后炎症因子的过量产生；内毒素性休克或死亡；器官的炎性损伤；以及，多器官功能衰竭。
在本发明的另一个实施方式中，所述细菌感染是由选自下组的一种或多种细菌引起的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌。在另一优选例中，所述炎症因子为选自下组的一种或多种TNFa、IL_1、IL_6、I 型干扰素，优选TNFa、IL_1或IL-6。在另一优选例中，所述器官选自肺、肝脏、脾脏、脑或肾。在本发明的另一个实施方式中，所述Itgam选自(a) SEQ ID NO 2 的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO :2氨基酸序列同源，其具有抑制细菌感染相关疾病和/或征状活性的蛋白；(c) (a)或(b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有预防或治疗细菌感染相关疾病和/或征状活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质或多肽。在一个优选例中，Itgam是天然纯化的蛋白、化学合成的产物、或使用重组技术从原核或真核宿主中产生，优选为人Itgam。在另一优选例中，所述氨基酸序列是Gen Bank No :NM_008401的核苷酸序列所编码的序列。在一个优选例中，所述宿主选自细菌、酵母、高等动物、昆虫和哺乳动物细胞。在本发明的另一个实施方式中，所述Itgam的编码基因选自(i)SEQ ID NO 1 的序列；或(ii)在严格条件下与(i)限定的序列杂交且具有预防或治疗细菌感染相关疾病和/或征状的分子。在本发明的另一个实施方式中，所述药物的给药方法选自直接裸DNA注射法、 脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、或目的基因所编码蛋白质。在本发明的第二方面中，提供了一种药物组合物，其包含(A)治疗有效量的Itgam和/或其编码序列；以及(B)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。在一个优选例中，在给予本发明的药物组合物之前、同时或之后，给予具有预防或治疗细菌感染相关疾病和/或征状活性的其它活性物质。所述具有预防或治疗细菌感染相关疾病和/或征状活性的其它活性物质选自临床常用抗生素(包括内酰胺类(青霉素类和头孢菌素类)、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内脂类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素)的一种或多种。在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物中Itgam及其编码序列占药物组合物总重量的0. 001 99. 9wt%。在一个优选例中，所述药物组合物中Itgam及其编码序列占药物组合物总重量的 1 95wt %，优选为5 90wt %，更优选10 80wt %。在本发明的第三个方面，提供了一种药物组合物，其包含(A)治疗有效量的Itgam和/或其编码序列；(B)预防或治疗细菌感染相关疾病和/或征状活性的其它活性物质；以及
(C)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。在本发明的一个实施方式中，所述具有预防或治疗细菌感染相关疾病和/或征状活性的其它活性物质是临床常用抗生素。在一个优选例中，所述临床常用抗生素是选自下组中的一种或多种β-内酰胺类(青霉素类和头孢菌素类)、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内脂类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素。在本发明的第四方面中，提供了一种预防或治疗细菌感染相关疾病和/或征状的方法，所述方法包括给予需要预防或治疗的对象有效量的Itgam及其编码序列。在一个优选例中，所述细菌感染相关疾病和/或征状为选自下组的一种或多种因细菌感染引起的疾病和/或征状细菌感染后炎症因子的过量产生；内毒素性休克或死亡； 器官的炎性损伤；以及，多器官功能衰竭。在另一个优选例中，所述细菌感染是由选自下组的一种或多种细菌引起的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌。在另一优选例中，所述炎症因子为选自下组的一种或多种TNFci、IL-6、I型干扰素，优选 TNFa、IL-I 或 IL-6。在另一优选例中，所述器官选自肺、肝脏、脾脏、脑或肾，优选肺、肝脏或脾脏。在本发明的其它方面中，提供了一种转基因细胞、器官、组织或个体，所述细胞、 器官、组织或个体通过常规转基因的方法获得并转入了本发明Itgam基因，以稳定高表达 Itgam蛋白或多肽。在本发明的其它方面中，还提供了一种制备转基因细胞、器官、组织或个体的方法，所述细胞、器官、组织或个体稳定高表达Itgam蛋白或多肽，其中所述方法包括将本发明Itgam基因转入细胞、器官、组织或个体内，并选择和获得稳定高表达Itgam蛋白或多肽的细胞、器官、组织或个体。在本发明的一个实施方式中，所述方法还包括使所得个体与其它同种个体杂交， 以获得稳定高表达Itgam蛋白或多肽的杂交后代。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1 =Itgam缺陷小鼠对内毒素休克更为敏感。其中，图Ia为ELISA分析，图Ib为生存率分析，图Ic为肺脏HE染色病理分析。(“*”，P <0.01),(对照为Itgam+缺陷小鼠同窝的Itgam+A小鼠)。图2 =Itgam缺陷小鼠对GranT感染更敏感而对Gram+感染更耐受。图加为生存率分析，图沘、e为ELISA分析，图2c、d为细菌克隆计数。(“*”，P < 0. 01)，(对照即为 Itgam+缺陷小鼠同窝的Itgam+A小鼠)。图3 =Itgam缺陷的巨噬细胞对TLR配体刺激产生强反应。图3a为ELISA分析，图 3b和c为Western Blot分析。(对照即为Itgam+缺陷小鼠同窝的Itgam+小鼠巨噬细胞)。图4 =Itgam过表达能够抑制巨噬细胞炎性细胞因子产生。图4为ELISA分析(“*”，P < 0. 05 ；“**，，，P < 0. 01)，(对照为空载体质粒)；图5 =Itgam阻断能够促进TLR信号和炎性细胞因子产生。图5a为ELISA分析，图 5b 为 Western Blot 分析。(“*”，P < 0. 05 ;“**”，P < 0. 01)(对照为 IgG)。实施方式本发明人通过大量的研究和动物模型试验，发现Itgam在细菌感染性疾病中，能有效抑制细菌感染后所导致的炎性因子的产生、改善器官功能状态、提高患者的生存率。在此，基础上本发明人完成了本发明。具体而言，针对炎症相关基因进行应用研究是炎症分子生物学和细胞生物学研究的热点，将炎症抑制基因的核苷酸和蛋白质应用于炎症的预防和治疗是人工干预细菌性感染的有效技术，因此无论是在功能基因组研究，还是炎症相关地基因治疗方面均具有广阔地应用前景。发明人通过研究发现=Itgam缺陷明显促进炎性反应。在LPS、Gram_和Gram+诱导内毒素休克的模型中，观察到Itgam缺陷能够显著促进前炎性细胞因子和I型干扰素产生， Itgam缺陷小鼠对LPS诱导的肺脏损伤更为明显，对GranT细菌感染更敏感，而清除Gram+细菌能力则更强，提示Itgam可能具备治疗内毒素休克等炎症性疾病的应用前景。由此，本发明提供了将Itgam抗炎分子应用于细菌感染性疾病的预防和治疗中的方法和策略，特别是可用于内毒素休克、感染所导致的肺脏和肝脏损伤。本发明针对具有抗炎作用的新型抗炎分子Itgam，对免疫细胞中巨噬细胞在微生物成分作用下的炎症因子的产生进行了研究，并且验证了应用该分子的序列对内毒素休克动物的治疗和保护作用。实验证明l)Itgam缺陷小鼠对TLR内毒素休克更敏感，产生更多的前炎性细胞因子和I型干扰素，表现出更严重的肺脏和肝脏损伤；2) Itgam缺陷小鼠对细菌感染产生更多的前炎性细胞因子和I型干扰素，对 GranT细菌更感染敏感，而对Gram+感染更耐受；3) Itgam缺陷的巨噬细胞产生更强的信号转导反应，更多的前炎性细胞因子和I 型干扰素；4) Itgam抑制巨噬细胞信号转导和炎症因子的产生；5)阻断Itgam则增强巨噬细胞信号转导和炎症因子。本发明针对Itgam基因的不同的核苷酸和蛋白质产物，用以抑制炎症因子的表达和细菌感染所致的内毒素性休克和肝脏损伤。这些发明证实Itgam的相关产物可望成为治疗和预防细菌性感染的有效手段。Itgam 蛋白(多肽)如本文所用，术语“Itgam(多肽)”、“Itgam蛋白(多肽)”、“Itgam”、“Itgam”、 “CDllb”可互换使用，是指SEQ ID NO :1的序列(即GenBank No. ΝΜ_001145808，智人来源) 所编码的蛋白质或其同源蛋白(例如GenBank No. NM_008401，小鼠来源)，或这些蛋白质具有抗炎作用的变异或修饰形式。例如，所述Itgam蛋白可选自(a)SEQ ID NO 2的氨基酸序列；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抑制炎性因子的活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。
本发明的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等动物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明中Itgam蛋白或多肽优选由人Itgam基因或其同源基因或家族基因编码。本发明蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50 个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的Itgam蛋白质或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有抑制炎性因子的活性。可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获得上述(b)中的蛋白质或多肽。可利用编码所述蛋白质或多肽的编码序列来构建转基因动物，并观察该转基因动物对炎症的抗性是否有所改良来筛选和鉴别所得蛋白质或多肽。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括Itgam蛋白的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与Itgam蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗Itgam蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含Itgam 蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了 Itgam蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有Itgam蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100 个连续氨基酸。ItRam蛋白编码基因如本文所用，术语“ Itgam基因”或“ Itgam蛋白编码序列”可互换使用，均是指一种编码本发明所述的Itgam蛋白或多肽的序列，其可为SEQ ID NO :1的序列、在严格条件下与 SEQ ID NO :1序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表达对炎性因子的产生和影响具有一定的抑制作用。本发明的Itgam基因可选自(i)SEQ ID NO 1的序列；或(ii)在严格条件下与(i)限定的序列杂交且具有抑制炎性因子活性的分子。如本文所用，术语“严格条件”是指⑴在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0. 2XSSC，0. SDS，60°C;或⑵杂交时加有变性剂，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 1% 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50 %，优选 55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。本发明的Itgam基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR 扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
应理解，本发明的Itgam基因优选获自人，获自其它动物的与人Itgam基因高度同源(如具有50%以上，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上， 更优选85 %以上如85 %、90 %、95 %、甚至98 %序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。载体、宿主及转基因动物本发明还涉及包含Itgam基因的载体，以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞，以及通过转基因获得高表达Itgam的转基因动物。通过常规的重组DNA技术(kience，1984 ；224 1431)，可利用本发明的编码序列可用来表达或生产重组的Itgam蛋白。一般来说有以下步骤(1)用本发明的编码Itgam蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；和(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质或多肽。本发明中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、 噬菌体、酵母质粒、动物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Itgam编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。 所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本发明中优选使用PCDNA3. 1载体、 PIRES2-EGFP 载体、Adeno-X 表达系统。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如动物细胞。代表性例子有大肠杆菌， 链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；动物细胞等。在本发明中，优选采用大肠杆菌细菌细胞、小鼠巨噬细胞作为宿主细胞。本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、 增强子和宿主细胞。本发明中术语“转基因动物”、或“转化动物”可互换使用，均指通过常规转基因的方法获得的转入本发明Itgam基因并稳定高表达Itgam蛋白或多肽的细胞、器官、组织或个体。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、 吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结药物组合物本发明还提供了一种药物组合物，所述的组合物含有有效量的本发明的Itgam蛋白或其编码序列，以及药学上可接受的载体。在较佳的实施方案中，所述药物组合物可用于治疗与现有技术中已知可治疗或预防细菌感染性疾病，例如细菌感染后炎症因子的过量产生；内毒素性休克或死亡；器官的炎性损伤；多器官功能衰竭。如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由......构成”、和
“由......构成”。如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和 /或动物所接受的量。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》 (Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、PH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中PH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。本发明的组合物中Itgam蛋白或其编码序列有效成分占组合物总重量的0. 001 99. 9 丨％;优选为组合物总重量的1 95wt%，较优选为5 90wt%，更优选10 80wt%。 余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。在本发明的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型，且其中Itgam 蛋白或其编码序列的含量为0.01 2000mg/剂，优选0. 1 1500mg/剂，更优选1 IOOOmg/剂。在本发明的另一个优选例中，每天施用1 6剂本发明的组合物，优选施用1 3剂；最优选的，每天服用的剂量为1齐U。应理解，所用Itgam蛋白或其编码序列的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。本发明的组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给药途径可采用(1)直接裸DNA或者蛋白质注射法；(2)将Itgam的cDNA、mRNA和蛋白质与转铁蛋白/多聚L-赖氨酸复合物连接，以增强其生物效应；(3)cDNA、mRNA和蛋白质与带正电荷的脂类形成复合物，以克服磷酸骨架负电荷所致的穿越细胞膜的困难；(4)用脂质体包裹cDNA、mRNA和蛋白质后介导进入细胞，既有利于大分子的顺利进入又免受细胞外各种酶的水解作用；(5) cDNA、mRNA和蛋白质与胆固醇结合使其胞浆保持时间增加10倍；(6)用免疫脂质体转运cDNA、mRNA和蛋白质可使其特异性转运至靶组织和靶细胞；(7)将cDNA、mRNA和蛋白质体外转染给转载细胞(如成纤维细胞)也可较好地将Itgam相关药物载入靶细胞内；(8)电打孔(electroporation)，即借助于电流将cDNA、mRNA和蛋白质导入靶细胞。此外，本发明的组合物中还可含有用于改善和治疗细菌感染性疾病的其它活性物质，所述的其它活性物质选自下组临床常用抗生素(包括内酰胺类(青霉素类和头孢菌素类)、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内脂类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素) 的一种或多种。本发明的Itgam相关的核苷酸和蛋白质药物相互间可以联合应用，还可以与其它药物和治疗手段联合，用于细菌感染性疾病的预防和治疗。本发明的优点1.本发明揭示了 Itgam及其编码序列的新功能，即抑制细菌感染所导致的炎症因子的表达、保护内毒素休克机体的肝脏功能、提高感染个体的生存率；2.本发明提供了一种可有效抑制细菌感染所导致的炎症因子的表达、保护内毒素休克机体的肝脏功能、提高感染个体的生存率的新型药物。
实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆实验室指南》(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。下文ELISA中的抗体均购自R&D公司。实施例1 :Itgam缺陷对小鼠内毒素休克产生促进作用首先采用15mg/kg LPS (又称脂多糖，为TLR4的配体，购自Sigma公司)，20mg/kg Poly(I:C) (TLR3配体，购自Sigma公司)，20mg/kg CpG 0GN(TLR9配体，购自上海生工)腹腔注射Itgam缺陷小鼠及对照小鼠(购自美国Jaxson实验室)不同时间后，收集血清，通过 ELISA (所用试剂盒购自R&D公司)检测炎症因子蛋白水平O小时后测定TNF α和IL-6， 4小时后测定IFN-β和ΙΡ-10)；收集肺脏，并且切片做HE染色，观察肺脏的显微病理改变 (重点观察炎性细胞浸润、红细胞渗出等)，同时观察LPS刺激后，小鼠生存率。ELISA分析的结果分别如图Ia所示。结果显示=Itgam缺陷促进小鼠炎症因子 TNFa、IL-6、IFN-β 和 ΙΡ-10 的产生。
小鼠生存率如图Ib所示=Itgam缺陷小鼠对LPS诱导的内毒素休克更早死亡，即更敏感。HE染色的结果如图Ic所示=Itgam缺陷小鼠在内毒素休克中表现出更严重的肺脏损伤。该实例表明=Itgam缺陷促进小鼠内毒素休克。实施例2 :Iteam缺陷使小鼠对Granr细菌感染更早死亡、血清中炎件因子的产牛 、血液中细菌多。Itgam缺陷#小鼠清除GramiM菌能力 曾强。首先采用IXlO8个埃希氏大肠杆菌(E.coli 0111 :B4，购自CCTCC)腹腔注射 Itgam缺陷及对照小鼠，在不同时间眼球取血。用ELISA检测(所用试剂盒购自R&D公司) 血清中炎性因子TNFa、IL-6以及IFN-β产量，细菌培养法检测血液中埃希氏大肠杆菌数量(CFU)，并动态观察小鼠的生存率。感染埃希氏大肠杆菌后小鼠生存率如图加所示。结果显示Itgam缺陷小鼠更早死亡。对血清中炎性因子TNFa以及IL-6产量的ELISA分析结果如图2b所示。结果显示=Itgam缺陷小鼠在感染埃希氏大肠杆菌后产生更高的炎性因子TNFa、IL_6以及 IFN- β。对血液中的埃希氏大肠杆菌数量如图2c所示。结果显示埃希氏大肠杆菌在 Itgam缺陷小鼠体内有更强的血行扩散。该结果表明Itgam的表达可以抑制血清中炎性因子的产生。然后尾静脉注射IX IO4和IX IO5个李斯特菌(Listerial monocytogenes，购自 CCTCC)，2天后获取小鼠肝脏和脾脏，计数每个脏器的细菌数；同时在感染细菌1天和2天后收集血清用ELISA测定细胞因子产量。感染李斯特菌后小鼠肝脏和脾脏内细菌数量如图2d所示，血清中炎性细胞因子含量如图加所示。结果显示=Itgam缺陷小鼠肝脏和脾脏内李斯特菌数量更少，血清中 TNFa和IL-6产量更高。该实例表明Itgam缺陷小鼠对GranT细菌感染更为敏感，而清除Gram+细菌能力则增强。实施例3 :Itgam缺陷的小鼠来源腹腔巨噬细胞产生更多的炎症因子给Itgam缺陷小鼠腹腔注射Iml肉汤(购自Sigma)，三天后以PBS冲洗腹腔获得巨噬细胞。然后分另Ij用 100ng/ml LPS, 1 μ M CpG 0DN，10 μ g/ml Poly (I: C), 10 μ g/ mlpoly(I:C)处理腹腔巨噬细胞(IXlO5个细胞/ml RPMI 1640培养基)。收集细胞做 ELISA (所用试剂盒购自R&D公司)测定细胞因子产量(8小时后测定TNF α和IL-6，12小时后测定IFN-β)分析。同时收集全细胞蛋白用Wfestern Blot检测TLRs信号转导活化。Itgam缺陷对小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子产生的影响如图3a所示，对TLRs信号转导影响如图b和c所示。结果显示=Itgam缺陷小鼠腹腔巨噬细胞在受到TLR配体刺激后产生更高的炎性因子；同时信号转导分子活化更强(主要体现在NF-kB和IRF3)。该结果表明Itgam缺陷促进小鼠来源的腹腔巨噬细胞炎症因子的产生。
^MM 4 :CD1 lb (Itgam) i寸表汰抑吿彳小鼠目复脖巨噬细胞,产牛炎t牛细胞,因子给Itgam缺陷小鼠腹腔注射Iml肉汤(购自Sigma)，三天后以PBS冲洗腹腔获得巨噬细胞。然后分别转染对照质粒(空载体质粒)，野生型⑶lib和持续活化型⑶lib质粒 (根据文献报道 Susannah，E.等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005,337 :142-148 设计的活化型突变体)，48 小时后用 100ng/ml LPS, 1 μ M CpG ODN, 10 μ g/ml Poly (I: C)，10 μ g/ml poly (I: C)处理腹腔巨噬细胞(IX IO5个细胞/ml RPMI1640培养基)。收集细胞做ELISA(所用试剂盒购自R&D公司)测定细胞因子产量(8小时后测定TNF α和IL-6，12小时后测定 IFN- β )分析。⑶lib过表达对小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子产生的影响如图如所示。结果显示 过表达野生型⑶lib能抑制小鼠腹腔巨噬细胞产生炎性因子，持续活化型⑶lib的抑制效
应更强。该结果表明活化的CDllb抑制小鼠来源的腹腔巨噬细胞产生炎症因子。^MM 5 :CD1 lb (Itgam)阳断促讲小鼠目复脖巨噬细胞,产牛炎t牛细胞,因子给野生型小鼠腹腔注射Iml肉汤(购自Sigma)，三天后以PBS冲洗腹腔获得巨噬细胞。用⑶lib阻断型抗体(购自eBioscience，10y g/ml)预处理野生型巨噬细胞， 阻断 CDllb 活化。然后用 100ng/ml LPS, 1 μ M CpG ODN, 10 μ g/ml Poly (I: C), 10 μ g/ml poly (I:C)处理腹腔巨噬细胞(IX IO5个细胞/ml RPMI 1640培养基)。用LPS实例3获取野生型小鼠腹腔内注射LPS (购自Sigma公司，15mg/kg)。收集细胞做ELISA(所用试剂盒购自R&D公司)测定细胞因子产量(8小时后测定TNF α和IL-6，12小时后测定IFN- β ) 分析。同时收集全细胞蛋白用Wfestern Blot检测TLRs信号转导活化。阻断⑶lib活化对巨噬细胞产生炎性细胞因子影响如图fe所示，阻断⑶lib活化对巨噬细胞TLRs信号转导影响如图恥所示。结果显示阻断⑶lib活化促进野生型巨噬细胞产生炎性细胞因子，促进TLRs信号转导(主要体现在NF- κ B和IRF3)。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.Itgam或其编码序列在制备用于预防和/或治疗细菌感染相关疾病和/或征状的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述细菌感染相关疾病和/或征状为选自下组的一种或多种细菌感染后炎症因子的过量产生；内毒素性休克或死亡；器官的炎性损伤；以及，多器官功能衰竭。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述细菌感染是由选自下组的一种或多种细菌引起的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、 粪肠球菌。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Itgam选自(a)SEQ ID NO 2的氨基酸序列；(b)与SEQID NO :2氨基酸序列同源，其具有抑制细菌感染相关疾病和/或征状活性的蛋白；(c)(a)或(b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有预防或治疗细菌感染相关疾病和/或征状活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质或多肽。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述Itgam的编码基因选自(i)SEQ ID NO 1 的序列；或( )在严格条件下与(i)限定的序列杂交且具有预防或治疗细菌感染相关疾病和/或征状的分子。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的给药方法选自直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、 复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、或目的基因所编码蛋白质。
7.一种药物组合物，其包含(A)治疗有效量的Itgam和/或其编码序列；以及(B)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中Itgam及其编码序列占药物组合物总重量的0. 001 99. 9wt%。
9.一种药物组合物，其包含(A)治疗有效量的Itgam和/或其编码序列；(B)预防或治疗细菌感染相关疾病和/或征状活性的其它活性物质；以及(C)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述具有预防或治疗细菌感染相关疾病和/或征状活性的其它活性物质是临床常用抗生素。
全文摘要
本发明涉及了一种新型膜分子的抗炎作用、实施方法及用途。具体涉及整合素αM(integrinαM，Itgam)在抵抗细菌感染中的用途和应用方法。本发明提供这种分子在抗细菌感染过程中的应用方法及相应的免疫学原理。本发明公开了这种分子在抗细菌感染中的用途和策略，特别是应用于细菌感染导致的感染性休克、内毒素性休克的预防和治疗。本发明证实了这种分子可以抑制细菌感染后炎症因子的产生，提高内毒素性休克中机体的存活率，保护肺脏等脏器在感染后免于炎性损伤。
文档编号A61K38/17GK102335415SQ201010230469
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月19日 优先权日2010年7月19日
发明者曹雪涛, 李楠, 韩超峰 申请人:中国人民解放军第二军医大学