专利名称：雷洛昔芬在间充质干细胞体外成骨分化中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞生物技术及骨组织工程技术领域，具体涉及一种治疗骨质疏松的化合物雷洛昔芬在间充质干细胞体外成骨分化中的应用。
背景技术：
骨创伤、肿瘤和炎症等导致的骨缺损是目前骨科临床的常见病和难治病，惟一的方法是通过骨移植进行修复。骨移植材料根据来源大致可分为自体骨、异体骨、和人工骨材料。自体骨移植的取骨手术增加患者创伤，取骨量有限，常不能满足植骨需求；异体骨和异种骨均存在排异。利用骨组织工程不仅可修复大面积的骨缺损，而且可按需塑形及大量制备，是一种理想的创伤修复方法。种子细胞一直是骨组织工程研究的重点，其中，成骨细胞是经典的种子细胞来源，但却存在大量取材不便、对供区会有一定损伤、增殖能力较弱等明显缺点，不能满足作为骨组织工程种子细胞的需要。近年来，干细胞逐渐成为骨组织工程研究的热点，干细胞是一种未分化的原始细胞，具有自我更新和分化潜能，一旦生理需要，这些原始细胞就可以按照发育途径，产生分化成熟的细胞，有着巨大的医学应用前景。根据存在部位的不同，干细胞可以分为以下两种类型胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞在一定条件下可以分化成为人体几乎所有的细胞，具有分化的全能性，但是对周围环境的依赖性较强，在条件不适宜的情况下，容易发生恶性转化而具有成瘤性。成体干细胞也可分化成数种或多种细胞类型，具有分化的多能性，且可以稳定传代和安全性好。骨髓间充质干细胞和脂肪来源的间充质干细胞是两类已被证实具有多向分化能力的成体干细胞。易于分离获取，且对组织损伤较小，体外培养扩增能力强，早在上个世纪八十年代，大量体内和体外研究均证实了间充质干细胞具有成骨分化潜能，是骨组织工程种子细胞的重要来源。目前对间充质干细胞的研究取得了很大进展，但是仍有很多问题摆在人们面前，其中重要的一点便是间充质干细胞定向成骨诱导分化的效率较低。已知的影响成骨细胞分化的因子主要有维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠等。维生素C能促进体外培养细胞合成胶原，形成钙化，也能调节ALP活性，并影响其合成。地塞米松和β-甘油磷酸钠则分别调节细胞胶原和ALP的合成，且具有协同作用。β -甘油磷酸钠可提供ALP作用的底物磷离子，激活ALP促进有机磷向无机磷转化，加速钙盐沉积和骨质生成，此作用可以随着培养基中的地塞米松消失而中断。雷洛昔芬([6-羟基-2-(4-羟苯基)苯并噻酚-3-基]44-[2-(1_哌啶基)乙氧基]-苯基]-甲酮)是一种选择性雌激素受体调节剂，由于其对骨骼具有保护作用，可降低血脂，对乳腺和子宫内膜无刺激作用，已被批准用于绝经后妇女骨质疏松的预防和治疗。
发明内容
本发明需要解决的问题雷洛昔芬在干细胞生物技术中新的应用，促进大鼠来源的间充质干细胞向成骨细胞分化。
本发明涉及蛋白、mRNA水平鉴定雷洛昔芬对脂肪和骨髓间充质干细胞成骨分化标志蛋白表达的影响。本发明提供一种治疗骨质疏松的化合物雷洛昔芬的干细胞生物技术、以及骨组织工程领域中的应用，雷洛昔芬由山东银飞达药业有限公司购买获得，具体合成工艺流程 以2-甲氧基苯硫酚为起始原料经过环合、脱甲氧基等反应，然后与4-[2-(1_哌啶基)乙氧基]苯甲酰氯发生Friedel-Crafts反应，最后在巯基乙醇作用下脱去甲基保护获得。发明所述包括雷洛昔芬促进间充质干细胞成骨细胞分化标志蛋白在mRNA和蛋白水平的表达， 以及钙离子的沉积，诱导向成骨细胞分化。可以应用于细胞生物技术的研究，并开发制备成治疗骨折、骨缺损、骨创伤等疾病的药物。实现本发明的技术方案为从正常大鼠的脂肪和骨髓组织，体外培养分离得到脂肪和骨髓来源的间充质干细胞。将3-5代的间充质干细胞进行成骨分化培养，添加雷洛昔芬，于14-21天对成骨分化标志蛋白、钙离子沉积进行测定，并与正常未添加药物的对照组比较，验证雷洛昔芬对成骨分化的作用。具体的分析步骤如下(1)定量PCR分析雷洛昔芬对间充质干细胞成骨分化标志蛋白mRNA水平表达的影响；(2)蛋白水平鉴定雷洛昔芬对间充质干细胞成骨分化中ALP表达的影响；(3)免疫细胞化学检测雷洛昔芬对间充质干细胞BMP2合成的影响(4)雷洛昔芬对间充质干细胞钙离子沉积的影响本发明的有益效果是本发明所述雷洛昔芬在干细胞生物学中的应用，在大鼠来源的间充质干细胞体外成骨分化培养中添加雷洛昔芬，可以促进成骨分化标志基因的表达和钙离子沉积，提高间充质干细胞向成骨细胞分化的效率，可制备成治疗骨创伤、骨折、骨缺损药物。
四
图1是雷洛昔芬促进脂肪干细胞成骨分化标志蛋白在mRNA水平表达图2是雷洛昔芬促进脂肪干细胞成骨分化标志蛋白ALP在蛋白水平表达图3是雷洛昔芬促进脂肪干细胞成骨分化标志蛋白BMP2在蛋白水平表达图4是雷洛昔芬促进脂肪干细胞钙离子沉积的结果。图5是雷洛昔芬促进骨髓干细胞成骨分化标志蛋白在mRNA水平表达图6是雷洛昔芬促进骨髓干细胞成骨分化标志蛋白ALP在蛋白水平表达图7是雷洛昔芬促进骨髓干细胞成骨分化标志蛋白BMP2在蛋白水平表达图8是雷洛昔芬促进骨髓干细胞钙离子沉积的结果。
五具体实施例方式本发明通过以下实施例做进一步描述。实施例1 大鼠脂肪干细胞的提取、培养以及成骨分化1.大鼠脂肪干细胞的提取1)断颈处死大鼠，仰卧位固定于实验台上，70%乙醇消毒；
2)沿腹股沟走向切开皮肤，并小心分离腹股沟白色脂肪组织；3)立即将脂肪组织放入冰冷的PBS里，反复冲洗3次，去除组织杂屑；4)取材后30min内在超净台内进行细胞分离；幻再次仔细剔除脂肪组织表面的筋膜和小血管，并用冰冷的PBS冲洗3遍，去除脂肪组织表面粘附的红细胞；6)剪碎脂肪组织加入两倍体积的0. 075% I型胶原酶；7)5% CO2、37°C恒温振荡消化 30min ；8)含10% FBS的低糖DMEM培养液中和I型胶原酶并稀释细胞，用吸管吹打数次混勻，防止细胞聚集，1200rpm离心IOmin ；9)小心弃去上清和残留的脂肪，加入红细胞裂解液，置于冰上lOmin，去除红细胞，再加入用20ml PBS清洗后，以1200rpm离心IOmin ；10)弃去上清，用3ml的低糖DMEM培养液重悬细胞过滤，再用2ml的低糖DMEM培养液清洗稀释过滤后的细胞；11)最后将得到的细胞用含10% FBS的低糖DMEM培养液悬浮接种于培养瓶，在饱和湿度、5% CO2和37°C标准环境下培养。2.脂肪干细胞的培养和成骨分化脂肪干细胞分离接种后4 换液。用预热的含100U/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素的PBS小心清洗贴壁的细胞去除组织碎屑和未贴壁细胞。根据培养皿或培养瓶的容积加入适量的低糖DMEM培养液，置于饱和湿度、5% CO2和37°C标准环境下培养。每4 换液一次。待细胞汇合达80-90%，予以消化传代。用少量预热的PBS清洗细胞后弃去PBS， 加入0. 25 %的胰蛋白酶/0. 02 % EDTA，37°C消化5min，倒置显微镜下发现超过90 %的细胞悬浮时加入含10% FBS的低糖DMEM培养液中和胰酶，然后将含细胞的培养液移入离心管， 1200rpm,离心5min，弃去上清，重悬细胞，将细胞分种于培养皿或培养瓶中。用第3-5代的脂肪干细胞进行成骨分化实验，成骨诱导培养液为在含10% FBS 高糖DMEM培养液中加入10讓01/1^-甘油磷酸钠、5(^11101/1的维生素C和IOnmol/L的地塞米松。实施例2 大鼠骨髓干细胞的提取、培养以及成骨分化1.大鼠骨髓干细胞的提取1)取4周龄SD大鼠，断颈处死幻75%乙醇浸泡IOmin消毒，无菌条件下取出股骨、胫骨，并彻底清除附着其上的肌肉组织，去除股骨、胫骨两端骨骺，显露骨髓腔。3)用含有肝素(200U/ml)的PBS冲洗骨髓腔，制成单细胞悬液4) 1500rpm离心lOmin，去上层脂肪和上清，用PBS吹打沉淀物，制成骨髓单细胞悬液。5)用含10% FBS、100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素L-DMEM完全培养基并吹打均勻，形成单细胞悬液。将细胞悬液转移到培养瓶，置37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱培养。2.骨髓干细胞的培养和成骨分化骨髓干细胞分离接种后4 换液。用预热的含100U/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素的PBS洗去未贴壁细胞。加入适量的低糖DMEM培养液，置于饱和湿度、5% CO2和37°C环境下培养，4 换液。待细胞汇合达80-90%，予以消化传代。第3-5代的骨髓干细胞进行成骨分化实验，成骨诱导培养液为在含10% FBS高糖DMEM培养液中加入10mmOl/Li3-甘油磷酸钠、50 μ mol/L的维生素C和lOnmol/L的地塞米松。实施例3 雷洛昔芬对脂肪干细胞成骨分化的影响将脂肪干细胞以5X104CellS/Well的密度接种于六孔板中，待细胞长满后，换成成骨诱导培养基，进行成骨诱导。实验分组对照组(Con，加入相应浓度的二甲亚砜)、Ral 组(雷洛昔芬组，10_8M、IO^7M 和 I(TfiM)、Ral (10_7M) +L-NAME (ImM)组、ImM L-NAME 组。诱导 14天后，弃培养液，PBS洗3次，Trizol法提取总RNA、逆转录，用定量PCR鉴定BMP2和ALP 的mRNA水平的表达。结果如图所示，我们分别用定量PCR鉴定雷洛昔芬对脂肪干细胞成骨分化标志蛋白碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白2 (BMP^mRNA表达的影响(图1)，在雷洛昔芬 KT8-IO-6M的浓度范围，都可以促进标志蛋白mRNA的表达，浓度越高促进作用越明显。雷洛昔芬对脂肪干细胞成骨分化中ALP蛋白水平表达的影响将脂肪干细胞以 5X104cells/well的密度接种于六孔板中，待细胞长满后，换成成骨诱导培养基，进行成骨诱导。实验分组对照组(Con，加入相应浓度的DMS0) ,Ral组(雷洛昔芬组，10-8Μ、1(Γ7Μ和 I(T6M)、Ral (I(T7M) +L-NAME (ImM)组、ImM L-NAME 组。诱导 14 天后，弃培养液，PBS 洗 3 次， 用试剂盒对碱性磷酸酶进行定量分析以及BCA蛋白检测试剂盒测定细胞裂解液中蛋白质含量。免疫细胞化学检测雷洛昔芬对脂肪干细胞ΒΜΡ2的合成将脂肪干细胞以 5X104cells/well的密度接种于六孔板爬片中。待细胞长满后，换成成骨诱导培养基，进行成骨诱导。实验分组对照组(Ctrl，加入相应浓度的DMS0)、雷洛昔芬组(Ral组，I(T7M)、 Ral (I(T7M) +L-NAME (ImM)组、ImM L-NAME 组。诱导 14 天后，弃培养液，PBS 洗 3 次。免疫细胞化学步骤如下1)吸出细胞培养液，用PBS洗涤细胞3次，4%多聚甲醛溶液4°C固定过夜2) PBS漂洗3次每次5min，3%的过氧化氢灭活内源性的过氧化物酶15min3)PBS 漂洗 3 次每次 5min，0. 5%的 TritonX-100 摇床上孵育 Ih5) PBS 漂洗 3 次每次 5min，3% BSA 4°C封闭 2h6)加入一抗(1 200)4°C孵育过夜7) PBS漂洗3次每次5min，加入生物素标记的二抗混合液37°C孵育2h8) PBS漂洗3次每次5min后，DAB显色9)光镜下观察并拍照。结果如图2、3所示，和mRNA的表达水平一致，10_6M的雷洛昔芬对ALP蛋白水平表达的促进作用最明显，相比于没有添加雷洛昔芬的对照组ALP的表达可以提高70%以上。 免疫细胞化学染色也可以清晰地反映ΙΟ—、的雷洛昔芬明显促进了 BMP2在蛋白水平的表达。与此同时，当加入一氧化氮合成酶抑制剂=L-NAME(ImM)，雷洛昔芬诱导成骨分化标志蛋白表达的作用显著降低。雷洛昔芬对脂肪干细胞钙离子沉积的影响脂肪干细胞lXlOYells/well的密度接种于M孔板中，待细胞长满后，换成成骨诱导培养基，进行成骨诱导。实验分组对照组 (Con,加入相应浓度的 DMS0)、Ral 组(雷洛昔芬组，10〃M)、Ral (I(T7M) +L-NAME (ImM)组、ImML-NAME组。诱导14天后，弃培养液，PBS洗3次，0. 6M HCl溶解细胞中沉积的钙离子。用钙离子检测试剂盒检测HCl上清中钙离子浓度，BCA蛋白检测试剂盒测定细胞裂解液中蛋
白质含量。细胞中钙离子的沉积是成骨分化成熟的标志，如图4所示=IO-7M的雷洛昔芬在14 天可以明显促进脂肪干细胞钙离子的沉积。但是雷洛昔芬的诱导作用可以被L-NAME(ImM) 抑制。实施例4 雷洛昔芬对骨髓干细胞成骨分化的影响实验方法、分组同实施例3。如图5-图8所示，雷洛昔芬同样可以明显促进骨髓干细胞ALP、BMP2在mRNA和蛋白水平的表达以及钙离子的沉积。由此可见，在间充质干细胞体外分化培养中，雷洛昔芬可以明显促进间充质干细胞向成骨分化，与此同时，雷洛昔芬的作用可能与胞质内一氧化氮的水平有关，当一氧化氮的合成被抑制时，其诱导成骨分化能力明显下降。
权利要求
1.雷洛昔芬在间充质干细胞体外成骨分化中的应用。
2.雷洛昔芬在制备治疗骨创伤、骨折、骨缺损药物中的应用。
全文摘要
本发明属于细胞生物及骨组织工程技术领域。涉及一种治疗骨质疏松的化合物雷洛昔芬在间充质干细胞体外成骨分化中的应用，该发明是在间充质干细胞体外成骨分化培养中添加雷洛昔芬，可以上调成骨分化标志基因ALP和BMP2在mRNA、蛋白水平的表达以及钙离子沉积，促进间充质干细胞向成骨细胞分化。该发明为雷洛昔芬在间充质干细胞成骨分化中的应用，以及在骨折、骨缺损、骨创伤等疾病的治疗中的应用。
文档编号A61K31/4535GK102373175SQ20101025855
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者卢翔, 张峻峰, 郭继刚, 陈江宁 申请人:南京大学