专利名称：重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的水溶液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的水溶液，属于生 物制剂技术领域。
背景技术：
干扰素属于蛋白质家族的细胞因子，自然存在于人体中。细胞因子可控制细胞的 生长、激活、迁移和衰老。干扰素α也是一种细胞因子，但干扰素α (IFNa)准确的作用机 制尚不十分清楚，研究表明IFNa具有抗病毒活性如治疗丙型肝炎，同时具有免疫调节和 针对特定的癌症具有直接的抗肿瘤效应。IFNa已成为临床上广泛应用的药物之一，可治疗 人的病毒性肝炎(乙型和丙型)、肿瘤和其它病毒感染等相关疾病。然而，IFNa分子量约 为19KD，作为一个小分子蛋白，IFN α从血浆中清除的速度较快，其半衰期为4 6h，24h后 在血浆中就已检测不到IFNa的存在，患者需要每日注射1次或每周3次，疗程长达4 6 个月。这种长期大剂量频繁用药增加了病人的痛苦和治疗费用，而且易产生发烧、疲乏、食 欲减退及抑郁等毒副作用。为了延长IFNa在体内的半衰期，广泛采用的是聚乙二醇修饰法，目前已有 40KD左右聚乙二醇修饰的IFNa 2a(派罗欣，罗氏公司)和12KD左右聚乙二醇修饰的 IFNa 2b (佩乐能，先灵葆雅)应用于临床。这两种产品均可明显延长IFNa在体内的半衰 期，患者只需每周注射1次。近年来，研究较热的是重组人血清白蛋白-干扰素融合蛋白。人血清白蛋白(HSA) 是存在于人循环系统中的最普遍的血液蛋白，它是体内因子和药物转运的天然载体，半衰 期约为19天。研究表明将治疗性蛋白基因与人血清白蛋白基因融合所表达的融合蛋白可 明显降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期。白蛋白-干扰素融合蛋白是人血清白蛋 白和干扰素α基因融合的产物。HGS公司(人类基因科学公司)开发的克鲁维氏酵母表达 的HSA-IFNa 2b的融合蛋白(albuferon)在猕猴体内的半衰期比单独的IFN α延长了大约 18倍，即重组人血清白蛋白-干扰素a 2b融合蛋白在体内的半衰期长达148h左右，仅需 每2 4周注射一次，被称为最长效的干扰素。研究表明，它比聚乙二醇修饰的干扰素显示 出更强的抗病毒活性，目前正处于III期临床阶段。国内目前在研的也有重组人血清白蛋 白-干扰素a 2a融合蛋白和重组人血清白蛋白-干扰素a 2b融合蛋白，简称HSA-IFNa 2a 禾口 HSA-IFNa 2b ο重组人血清白蛋白-干扰素融合蛋白比普通干扰素的稳定性有所提高，但作为蛋 白类药物，其稳定性还是无法与常规化学药物相比。根据以往的重组干扰素临床使用经验， 在治疗病毒性肝炎等疾病需要3 6个月的连续给药周期。因为给药时间较长，活性药物 需要有较好的稳定性。众所周知，一般重组蛋白质的稳定性比较差，在保存过程中会受到多 种环境因素的影响，例如温度、湿度、氧、光照和紫外线等都可能使蛋白发生多种物理或化 学变化，造成蛋白质的聚集、降解、氧化或变性等。这些变化使蛋白质活性丧失从而降低治疗效果，并且严重的可能引起毒副作用。因此，研究出一种能稳定保存的重组人血清白蛋 白-干扰素α融合蛋白，并适合于实际临床使用的制剂处方是很有意义的。中国专利CN101099722A(申请号200610052365. 4)公开了一种含有重组人血清白 蛋白-干扰素α融合蛋白的注射用水剂，所述注射用水剂由重组人血清白蛋白_干扰素α 融合蛋白与药学上可接受的稳定性辅料溶于ΡΗ5 8的药学上可接收的缓冲液中得到，所 述重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白浓度为0. 1 5mg/ml，所述的稳定性辅料为甘氨 酸或甲硫氨酸。中国专利CN101234193A(申请号200810033915. 7)公开了一种重组人血清 白蛋白融合干扰素的稳定水溶液，含有磷酸盐和焦亚硫酸钠、L-抗坏血酸、半胱氨酸等还原 性物质，PH为6. 5 7. 5。但根据这两个专利申请公开的技术方案制备的制剂的稳定性仍 有待提高。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种能稳定保存的重组人血清白蛋白-干扰素 α融合蛋白的水溶液，该水溶液能够充分防止重组人血清白蛋白_干扰素α融合蛋白的聚 集、降解、氧化或变性等，从而保持其有效组分的生物学活性，适合于临床使用。发明概述为了达到发明目的，发明人对稳定剂进行了大量的研究，发现精氨酸不仅可以作 为稳定剂，还可以用作营养剂，治疗肝脏疾病的治疗药物；在药物制剂中用作助溶剂，与一 些酸性药物成盐，提高药物溶解度，增强药物的药理作用或减少副作用。精氨酸用作肝脏疾 病治疗药物的特点是其他氨基酸所不具备的，比如甘氨酸、甲硫氨酸等。另外，由于重组人 血清白蛋白-干扰素α融合蛋白主要用于病毒性肝炎的治疗，发明人除了考虑利用精氨酸 稳定药物的作用外，还考虑利用其具有保肝护肝的作用，可恢复受损的肝功能，增强人体免 疫能力，因此，选择了精氨酸作为稳定剂。发明详述本发明采用的技术方案是一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，它包括重组人血清白蛋 白-干扰素α融合蛋白与药学上可接受的稳定性辅料溶于药学上可接受的缓冲液得到，其 特征在于，所述药学上可接受的稳定性辅料为精氨酸，浓度为5 30g/L。优选的，所述精氨 酸的浓度为10 25g/L。所述的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的浓度为0. 2 2g/L。所述的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白选自重组人血清白蛋白-干扰素 α 2a融合蛋白、重组人血清白蛋白_干扰素α Ib融合蛋白、重组人血清白蛋白-干扰素 α 2b融合蛋白或重组人血清白蛋白-干扰素α con融合蛋白；进一步优选重组人血清白蛋 白-干扰素α 2a融合蛋白。所述药学上可接受的缓冲液为磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、组氨 酸-盐酸缓冲液；进一步优选的，药学上可接受的缓冲液为磷酸盐缓冲液。所述药学上可接受的缓冲液的浓度为5 lOOmmol/L，pH为5. 0 8. 0。所述稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液还包括浓度为0.05 0. 2g/L的表面活性剂；优选非离子型表面活性剂；进一步优选吐温-80。
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所述稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液还包括浓度为0.5 10g/L无机盐；优选氯化钠、氯化钾、磷酸盐、醋酸盐、巴比妥盐、三羟甲基氨基甲烷、硼酸盐 之一或任意比的组合；进一步优选氯化钠。上述稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液的制备方法，步骤如下(1)配制药学上可接受的缓冲液，pH5. 0 8. 0，浓度为5 100mmol/L ；(2)向步骤(1)制得的缓冲液中添加精氨酸，使溶液中精氨酸终浓度达到5 30g/L，得混合液；(3)向步骤(2)制得的混合液中加入重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白，使 其终浓度达到0. 2 2g/L，即得稳定的重组人血清白蛋白_干扰素α融合蛋白溶液。优选的，步骤(2)中所述精氨酸的浓度为10 25g/L。优选的，步骤(2)中添加精氨酸前，先向缓冲液中添加无机盐，使溶液中无机盐终 浓度达到0. 5 10g/L。优选的，步骤(2)中添加精氨酸后，向缓冲液中添加表面活性剂，使溶液中表面活 性剂终浓度达到0. 05 0. 2g/L。优选的，步骤(2)中添加精氨酸前，先向缓冲液中添加无机盐，使溶液中无机盐终 浓度达到0. 5 10g/L，；添加精氨酸后，再向缓冲液中添加表面活性剂，使溶液中表面活性 剂终浓度达到0. 05 0. 2g/L。上述稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液在制备用于治疗病毒性 肝炎、肿瘤和其它病毒感染相关疾病的药物中的应用。上述试剂如无特别说明，均为市售产品；缓冲液的配制均可采用本领域常用技术。本发明提供的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白克服了传统的干扰素治疗 过程中多次给药的缺点，并具备以下几个优点(1)降低了干扰素α在体内药物的清除速率，延长生物半衰期，减少注射给药频 率；(2)添加表面活性剂，可以抑制摇晃导致的蛋白二聚体的产生，则可进一步改善融 合蛋白的稳定性。经试验检测，加入吐温-80的融合蛋白溶液的非还原电泳纯度为99. 1 %， 而不加吐温-80的融合蛋白溶液的非还原电泳纯度仅为97. 5%，且电泳图谱中有明显的寡 聚体的条带。
图1、25°C条件下放置6个月，重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液的非还 原SDS-PAGE结果；其中1、Marker，2、实施例1的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，3、 实施例2的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，4、实施例3的重组人血清白蛋 白-干扰素α融合蛋白溶液，5、实施例4的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液， 6、实施例5的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，7、实施例6的重组人血清白蛋 白-干扰素α融合蛋白溶液，8、实施例7的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液， 9、实施例8的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，10、实施例9的重组人血清白 蛋白-干扰素α融合蛋白溶液。
图2、4°C条件下放置12个月，重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液的非还 原SDS-PAGE结果；其中1、Marker，2、实施例1的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，3、 实施例2的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，4、实施例3的重组人血清白蛋 白-干扰素α融合蛋白溶液，5、实施例4的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液， 6、实施例5的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，7、实施例6的重组人血清白蛋 白-干扰素α融合蛋白溶液，8、实施例7的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液， 9、实施例8的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，10、实施例9的重组人血清白 蛋白-干扰素α融合蛋白溶液。图3、25°C条件下放置6个月，重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液的非还 原SDS-PAGE结果；其中1、实施例10的重组人血清白蛋白_干扰素α融合蛋白溶液，2、实施例11 的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，3、Marker。图4、4°C条件下放置12个月，重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液的非还 原SDS-PAGE结果；其中1、Marker，2、实施例10的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，3、 实施例11的重组人血清白蛋白_干扰素α融合蛋白溶液。图5、摇晃试验中，重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液的非还原 SDS-PAGE 结果；其中1、Marker，2、实施例12中Rl组结果，3、实施例12中R2组结果。
具体实施例方式本发明所涉及的稳定剂、表面活性剂、缓冲液和无机盐类在实际应用时是几种物 质组合使用。在本发明的基础上改变其浓度或加入其它一些物质，但对提高重组人血清白 蛋白-干扰素α融合蛋白稳定性没有显著作用的改变，仍被视为本发明的一部分。实施例中，采用下述方法确定重组人血清白蛋白_干扰素α融合蛋白的生物学活 性。1、重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的生物学活性检测方法(细胞病变抑 制法)1. 1原理本法依据干扰素可以保护人羊膜细胞(WISH细胞)免受水泡性口炎病 毒(VSV)破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，于波长570nm处测定其吸光度，可 得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素的生物学活性。1.2试剂、材料1)重组人干扰素α 2a和重组人干扰素α 2b活性测定国家标准品，均购自中国药 品生物制品检定所。2) RPMI 1640培养液取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀 释至1000ml，加青霉素IO5IU和链霉素IO5IU,再加NaHC032. lg，溶解后，混勻，除菌过滤，4°C保存。3)完全培养液量取新生牛血清100ml，加入RPMI 1640培养液900ml中。4°C保
6存。4)测定培养液量取新生牛血清7ml，加入RPMI 1640培养液93ml中。4°C保存。5)攻毒培养液量取新生牛血清3ml，加入RPMI 1640培养液97ml中。4°C保存。6)消化液取 EDTA 0. 2g、NaCl 8. 0g, KCl 0. 2g，Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g，加 水溶解至 1000ml，121 °C，15min 灭菌。7)染色液取结晶紫50mg，加入无水乙醇20ml溶解后，加水稀释至100ml。8)脱色液取无水乙醇50ml、冰乙酸0. 1ml，加水稀释至100ml。上述RPMI 1640培养基粉末和新生牛血清，均购自Invitrogen公司。1. 3操作方法1. 3. 1标准品溶液的制备取重组人干扰素生物学活性测定国家标准品按照产品说明书复溶后，用测定培养 液稀释至每Iml含1000IU。然后，在96孔细胞培养板中，进行4倍系列稀释，即稀释4、42、 43、4\45、46、47、48倍，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔，以上操作在无菌条件下进行。1. 3. 2供试品溶液的制备将待测样品用测定培养液稀释至每Iml含1000IU。然后，在96孔细胞培养板中， 做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个复孔，以上操作均在无菌条件下进行。1.3. 3 测定法WISH细胞用完全培养液培养，使其贴壁至生长状态良好，按体积比1 2 1 4 传代，每周2 3次。取培养的细胞弃去培养液，用0. 04wt% EDTA消化，细胞计数并调成浓 度为2. 5 3. 5X IO5个/ml的细胞悬液，100 μ 1/孔接种于96孔培养板上，37°C,5% CO2, 培养4 6小时。将配制完成的标准品溶液和待测样品溶液移入接种WISH细胞的培养板中，每孔 加入 100μ 1。37°C，5% CO2，培养 18 24 小时。弃去细胞培养板中的上清液。将-70°C保存的疱疹性口炎病毒(VSV)用攻毒培养 液稀释至IOOCCID50，每孔ΙΟΟμ 1,37°C,5% CO2，培养24小时(镜检标准品溶液的50%病 变点在lIU/ml)。染色弃去上清，每孔加入100 μ 1染色液，室温放置30分钟后，用自来水洗净染色 液，并吸干残留水分。脱色每孔加入50 μ 1脱色液，室温下放置3 5分钟，570nm，参比波长630nm下，
测定OD值。记录测定结果。试验数据采用计算机程序进行处理，并按下式计算结果
权利要求
一种稳定的重组人血清白蛋白 干扰素α融合蛋白溶液，它包括重组人血清白蛋白 干扰素α融合蛋白与药学上可接受的稳定性辅料溶于药学上可接受的缓冲液得到，其特征在于，所述药学上可接受的稳定性辅料为精氨酸，浓度为5～30g/L。
2.如权利要求1所述的溶液，其特征在于，所述精氨酸的浓度为10 25g/L。
3.如权利要求1所述的溶液，其特征在于，所述的重组人血清白蛋白-干扰素α融合 蛋白的浓度为0.2 2g/L。
4.如权利要求1所述的溶液，其特征在于，所述的重组人血清白蛋白-干扰素α融合 蛋白选自重组人血清白蛋白_干扰素α 2a融合蛋白、重组人血清白蛋白_干扰素α Ib融 合蛋白、重组人血清白蛋白_干扰素α 2b融合蛋白或重组人血清白蛋白_干扰素α con融 合蛋白；进一步优选重组人血清白蛋白-干扰素α 2a融合蛋白。
5.如权利要求1所述的溶液，其特征在于，所述药学上可接受的缓冲液为磷酸盐缓冲 液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、组氨酸-盐酸缓冲液；进一步优选的，药学上可接受的缓冲液 为磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求1所述的溶液，其特征在于，所述药学上可接受的缓冲液的浓度为5 1 OOmmol/L, pH 为 5. 0 8. 0。
7.如权利要求1所述的溶液，其特征在于，所述稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α 融合蛋白溶液还包括浓度为0. 05 0. 2g/L的表面活性剂；优选非离子型表面活性剂；进 一步优选吐温-80。
8.如权利要求1所述的溶液，其特征在于，所述稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α 融合蛋白溶液还包括浓度为0. 5 10g/L无机盐；优选氯化钠、氯化钾、磷酸盐、醋酸盐、巴 比妥盐、三羟甲基氨基甲烷、硼酸盐之一或任意比的组合；进一步优选氯化钠。
9.权利要求1所述稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液的制备方法，其 特征在于，步骤如下(1)配制药学上可接受的缓冲液，pH5.0 8. 0，浓度为5 lOOmmol/L ；(2)向步骤(1)制得的缓冲液中添加精氨酸，使溶液中精氨酸终浓度达到5 30g/L， 得混合液；(3)向步骤(2)制得的混合液中加入重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白，使其终 浓度达到0.2 2g/L，即得稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液。
10.权利要求1所述稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液在制备用于治 疗病毒性肝炎、肿瘤和其它病毒感染相关疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的水溶液，属于生物制剂技术领域。一种稳定的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白溶液，它包括重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白与药学上可接受的稳定性辅料溶于药学上可接受的缓冲液得到，其特征在于，所述药学上可接受的稳定性辅料为精氨酸，浓度为5～30g/L。本发明的重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的水溶液能够充分防止重组融合蛋白的聚集、降解、氧化或变性等，从而保持其生物学活性，适合于临床使用。
文档编号A61K9/08GK101954067SQ201010261889
公开日2011年1月26日 申请日期2010年8月25日 优先权日2010年8月25日
发明者孙丽霞, 张乐, 王克波, 王晶翼, 秦素娟, 董婷 申请人:齐鲁制药有限公司