专利名称：脾脏免疫因子及其制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫因子，尤其涉及脾脏免疫因子及其制备方法，属生物医药技术领域。
背景技术：
脾脏是人、动物体内最大的淋巴器官；脾脏亦是机体的中枢免疫器官。脾脏的免疫学功能主要体现在生成免疫活性细胞、识别抗原、生成抗体等方面。脾脏中T淋巴细胞和 B淋巴细胞可以制造免疫球蛋白、补体等免疫活性物质以及干扰素、转移因子等各种活性因子。当血液中出现病菌、病毒、原虫等抗原或异物时，脾脏中的这些活性细胞和活性物质就可以发挥主动或被动的免疫作用，将进入机体的细菌、病毒及其它异物吞噬、中和或杀灭。禽类(鸡、鸭等)、畜类(猪、牛、羊等)的脾脏容易获得，尤其是鸡、猪的脾脏资源量非常大。肉鸡及猪的脾脏为屠宰加工过程中的下脚料，因为人们没有食用脾脏的习惯，脾脏经常作为非食用部分被弃去。将这些下脚料资源充分利用，变废为宝，能够创造极大的经济效益和社会效益。但目前对脾脏的利用仅仅是从中提取转移因子(Transfer Factor, TF)。TF的制备方法已有多个专利，如中国发明专利CN1087520公开了猪脾脏提取转移因子的方法；中国发明专利CN1408367A则阐述了一种鸡脾转移因子的生产工艺及其制备方法。 TF为分子量介于3000 6000道尔顿的小分子核苷酸_多肽类物质，它作为一种特定的细胞因子参与机体的免疫反应，能够提高机体细胞免疫功能，抵抗真菌、病毒等非细菌性感染；同时有促进B细胞的抗体分泌作用，能够诱导细胞释放干扰素，进而促进机体抗感染、 防御能力。然而脾脏中的活性物质远非仅仅转移因子TF—族。脾脏的应用价值有待进一步挖掘。本发明经过研究探索，提取出了动物脾脏免疫因子，经检索，未见现有技术中有关脾脏免疫因子的相关文献报道。
发明内容
本发明目的旨在充分利用动物屠宰环节产生的丰富下脚料——脾脏，制备具有多种生物活性的脾脏免疫因子，从而提供一种能够提高人类、动物机体免疫功能以及防治病毒性、细菌性等疾病的生物制剂，使脾脏这种丰富的生物资源得以充分利用；另一目的在于提供其制备方法。本发明的技术实施方案如下我们利用经过检疫的鸡、猪等的脾脏为原料，经冻融破碎细胞后将脾脏成份提取出来，经过滤、离心，然后超滤；超滤后收集分子量小于20000 道尔顿的脾脏成份，我们将其称为脾脏免疫因子(Spleen Immune Factor)、脾脏因子 (Spleen Factor)或活性蛋白因子(Active Protein Factor，简称 APF)。与转移因子TF相似(任丽君等，转移因子研究及其临床应用，生物学杂志，1997年第14卷第15期)，脾脏免疫因子可分为特异性脾脏免疫因子和非特异性脾脏免疫因子两大类。特异性脾脏免疫因子系采用某种特定病原感染或免疫机体后再提取含该抗原特异活性的脾脏免疫因子，针对性强，治疗效果突出。非特异性脾脏免疫因子是指用自然机体脾脏提取的具有多种免疫活性的脾脏免疫因子，可非特异性调节机体的免疫机能，从而提高机体的抵抗力或疫苗的免疫效果。试验表明，由对病原体的抑杀效果和免疫活性来看，特异性脾脏免疫因子活性为非特异性脾脏免疫因子活性的40 50倍。 一、非特异性脾脏免疫因子通过如下步骤制备首先将经过检疫的新鲜、健康脾脏，用无菌纯水反复清洗，将脾脏表面的油脂、筋膜处理干净；将脾脏切块放入高速组织捣碎机中捣碎，分盘后入冷库(_25°C -30°C )速冻，冻融3 5次，加3 5倍无菌纯水，混勻，然后置于胶体磨中乳化，离心分离固体物与提取物，每分钟3000 16000转；滤液收集于容器中，滤液过滤；超滤，截留分子量小于20000 道尔顿得到的超滤产物即为脾脏免疫因子。其为分子量小于20000道尔顿的混合物。二、特异性脾脏免疫因子通过如下步骤制备用某种特定疾病抗原免疫猪、鸡等动物，待免疫成功后取免疫动物的脾脏，无菌勻浆，冻融3 5次，使细胞彻底破坏；将勻浆冻融液放入透析袋中透析，收集其中分子量 20000道尔顿以下部分，即为特异性脾脏免疫因子。其为分子量小于20000道尔顿的混合物。三、脾脏免疫因子检测1、蛋白质定性试验蛋白质具有缩二脲显色反应，而多肽没有；在试管中加入2mL 脾脏免疫因子溶液，再加10%氢氧化钠溶液2mL，然后加几滴Imol 硫酸铜溶液，可观察到在脾脏免疫因子溶液内有紫色出现；表明脾脏免疫因子含有蛋白质成份；而主要为多肽成份的脾脏转移因子TF蛋白质鉴定为阴性。2、蛋白质含量测定蛋白及多肽含量测定采用Bradford法进行，计算公式为蛋白及多肽含量(mg/g)=(浓度X提取液总体积/测定时取样体积)/脾脏重量。结果为脾脏免疫因子中蛋白及多肽含量6 10mg/g，平均值为7mg/g。3、外观鉴定脾脏免疫因子为澄明液体，无异物、浑浊或沉淀。4、脾脏免疫因子成份组成所述脾脏免疫因子用SDS-PAGE电泳(7. 5%分离胶) 检测，电泳图谱呈现分散的数条区带(见附
图1)，经电泳考马斯亮兰R250染色呈现蓝色； 经与标准分子量对照物比较，各区带的分子量依次为3000 6000、14000、17000、18000以及接近20000道尔顿；通过免疫印记Western-blotting检测表明，上述区带所对应的蛋白质分别为溶菌酶、干扰素、白细胞介素以及补体系统的分子片段(见表1)。由此可知，脾脏免疫因子是一类分子量在20000道尔顿以下(3000 20000道尔顿)、包含转移因子、溶菌酶、干扰素、白介素及补体系统等细胞因子的复合体；但其成份组成以及组成比例会随不同的脾脏来源或者不同的生理状况等因素的变化而变动。脾脏免疫因子制备过程中，分子量上限设定为20000道尔顿具有很好的实际意义。分子量在20000道尔顿以下能充分保证脾脏免疫因子溶液的澄清，为下一步发展注射用制剂奠定良好基础；若分子量超过20000道尔顿，一是水溶性不好，影响制剂稳定性和疗效，二是脾脏免疫因子制备过程中的反复冻融环节容易破坏大分子的空间结构而使其失去活性。表1凝胶电泳区带所对应的多肽、蛋白质种类
权利要求
1.脾脏免疫因子的其制备方法，其特征在于，非特异性脾脏免疫因子通过如下步骤制备首先将经过检疫的新鲜、健康脾脏，用无菌纯水反复清洗，将脾脏表面的油脂、筋膜处理干净；将脾脏切块放入高速组织捣碎机中捣碎，分盘后入冷库(_25°C -30°c )速冻，冻融3 5次，加3 5倍无菌纯水，混勻，然后置于胶体磨中乳化，离心分离固体物与提取物， 每分钟3000 16000转；滤液收集于容器中，滤液过滤；超滤，截留分子量小于20000道尔顿得到的超滤产物即为脾脏免疫因子。
2.脾脏免疫因子的制备方法，其特征在于，特异性脾脏免疫因子通过如下步骤制备 用某种特定疾病抗原免疫猪、鸡等动物，待免疫成功后取免疫动物的脾脏，无菌勻浆，冻融3 5次，使细胞彻底破坏；将勻浆冻融液放入透析袋中透析，收集其中分子量小于 20000道尔顿的成份，即为特异性脾脏免疫因子。
3.脾脏免疫因子，其特征在于，其通过权利要求1或2所述的方法制得，为分子量小于 20000道尔顿的混合物。
4.如权利要求3所述的脾脏免疫因子，其特征在于，其包含有转移因子、溶菌酶、干扰素、白介素及补体系统分子片段。
全文摘要
本发明公开了一种脾脏免疫因子及其制备方法，属生物医药技术领域。该脾脏免疫因子或特异性脾脏免疫因子采用超滤法或透析法制备。本发明脾脏免疫因子的分子量小于20000道尔顿，含有转移因子所没有的蛋白质成份，生物活性高。本发明脾脏免疫因子的开发与应用，不仅拓展了动物(鸡、猪等)脾脏资源的利用效率，增强了脾脏提取物的生物活性，而且为治疗人类、动物界的顽固性疾病，如禽流感、肿瘤等，提供了一种原料易得、成本低廉、无毒副作用的制剂原料，适宜于工业化生产。
文档编号A61P37/04GK102397293SQ201010285529
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月19日 优先权日2010年9月19日
发明者曹吉祥 申请人:曹吉祥