针对表达天冬酰胺酰-β-羟化酶的肿瘤的树突细胞疫苗的制作方法

专利名称：针对表达天冬酰胺酰-β-羟化酶的肿瘤的树突细胞疫苗的制作方法
针对表达天冬酰胺酰-β -羟化酶的肿瘤的树突细胞疫苗相关申请本申请请求以下申请的权益2009年7月M日提交的U. S. S. N 61/228,429,2009 年 8 月 4 日提交的 U. S. S. N 61/231，127,2009 年 9 月 2 日提交的 U. S. S. N 61/239，288 和 2009年9月9日提交的U. S. S. N 61/240, 745，其内容通过引用全文納入本文。
背景技术：
肝癌包括肝細胞癌和胆管細胞性肝癌，是世界上最常见癌症中的ー种。在美国，肝癌在男性和女性的癌症致死中分别是第五和第九大死因。尽管对肝癌的诊断和局部控制有显著进展，但在美国的致死率仍在持续上升。死亡率升高的原因之一可能在干，与乳腺癌和结直肠癌在内的其他癌症不同，肝癌耐受全身治疗如化疗。因此，肝癌一旦成为全身疾病便没有有效疗法。

发明内容
本发明为长期以来对诊断为癌症的患者进行化疗替代治疗的问题提供了解决方案。降低对象内表达天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)-β _羟化酶(AAH或ASPH)肿瘤的生长的方法包括给予对象分离的成熟载AAH树突細胞或細胞群体。表达AAH的肿瘤的生长在给予此类树突细胞疫苗后有降低。例如，肿瘤生长与肿瘤负荷降低10^,20^,50^,75%, 2倍、5倍、10倍或更多。所述方法用于降低和消除哺乳动物对象如人患者中表达AAH的肿瘤。所述组合物和方法也适用于伴侣动物和牲畜，如人、犬、猫、马、牛或猪对象。表达AAH的肿瘤包括大多数肿瘤类型，例如胃肠组织(如食道、胃、结肠)、胰腺、 肝(如胆管細胞性肝癌、肝細胞癌)、乳腺、前列腺、子宫颈、卵巣、输卵管、喉、肺、甲状腺、胆囊、肾、膀胱和脑(如成胶质細胞瘤)的肿瘤以及下文描述的大量其他肿瘤。表达AAH的肿瘤包括相比正常组织表达且提高AAH水平的原发性肿瘤，以及通过所述过量表达AAH的原发肿瘤转移所产生的肿瘤。所述免疫方法中所用的树突细胞优选在给予对象前用含GM-CSF和IFN- γ的細胞因子的组合离体激活。后一步骤导致树突細胞群体的抗肿瘤活性改善。产生致敏树突細胞的改进方法通过使分离的树突細胞接触抗原如AAH或肿瘤抗原的組合如AAH和甲胎蛋白(AFP)并处理细胞以得到成熟并活化的抗原呈递细胞群进行。 抗原接触步骤之后，树突細胞与細胞因子組合接触。例如，所述组合包括GM-CSF和IFN-γ。 在其他示例中，组合还包括IL-4。可选地，組合包括CD40L。树突細胞与細胞因子組合接触至少10小时(例如，12、24、36、40、48小时或更久)。抗原为可溶形式或结合于固相载体。 例如，所述固相载体包括聚苯乙烯珠如生物可降解珠或颗粒。树突細胞通过已知方法如白血球单采术或細胞分离法获自对象。获取细胞的对象患有癌症或有发生癌症的风险。例如，所述患者已诊断有肿瘤如表达AAH的肿瘤。有发生癌症如载AAH肿瘤风险的患者包括已鉴定为有此类癌症病患个体的家族史的对象。本发明还包括含有如上所述产生的致敏树突細胞的疫苗组合物。所述疫苗有助于抑制肿瘤生长、预防肿瘤生长和抑制或减少转移。抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法通过下述步骤进行鉴定患有载AAH肿瘤的对象，并给予所述对象自体树突細胞，所述细胞已经按上述方法致敏。预防哺乳动物中肿瘤发生的方法包括以下步骤鉴定有发生载AAH肿瘤风险的对象(例如，有癌症家族史的对象)，并给予所述对象经抗原致敏并活化的自体树突细胞。预防载AAH肿瘤转移的方法通过鉴定患有载AAH肿瘤的对象，并给予所述对象如上所述的自体树突细胞进行。本发明的多肽和其他組合物为纯化的。例如，其中基本纯的AAH多肽变体优选通过表达编码该多肽的重组核酸或通过化学合成所述蛋白来获得。当多肽或蛋白与在天然状态下与其共存的污染物(蛋白质或其他天然产生的有机分子)分离时为基本纯。通常，当多肽在制品的蛋白中至少占60重量％吋，所述多肽为基本纯的。制品中的蛋白质优选以重量计至少75%，更优选至少90%，最优选至少99%为AAH。纯度通过任何适当方法如柱层折、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析測定。因此，基本纯的多肽包括衍生自真核细胞但在大肠杆菌或其他原核細胞内或在不同于所述多肽原始来源的真核細胞内生产的重组多肽。用于所述方法的树突細胞或其他細胞，例如免疫細胞如巨噬細胞、B細胞、T細胞为纯化或分离的。就细胞而言，术语"分离的"指細胞基本不含在天然条件下与其共存的其他细胞类型或細胞材料。例如，特定组织类型或表型的细胞样品占細胞群体至少60%时为〃基本纯的"。制品中优选至少75%，更优选至少90%，最优选至少99%或100%为所述细胞群体。纯度通过任何适当的标准方法測定，例如，通过荧光活化的細胞分选(FACS)。产生经抗原致敏DC的方法相比此前的方法有多种优势。细胞不但加载抗原，还经过后续的細胞因子孵育产生优异的已活化的经抗原致敏的抗原呈递細胞，具有改善的抗肿瘤和抗转移活性。在阅读下列附图、具体描述和权利要求书后将更充分理解本发明的这些和其他能力以及本发明本身。本文引用的所有文献通过引用納入本文。附图简要说明

图1的柱状图显示分离DC的IL-12生产。图2显示分离DC上表达多种表面DC标记物的系列线图。图3的柱状图显示表面DC标记物的平均荧光。图4显示細胞因子存在下生长的CD8+ DC群体増加的系列流式細胞分选图和柱状图。图5的柱状图显示IFN- γ分泌。图6的柱状图显示IL-4分泌。图7是显示細胞毒性试验结果的线图。图8为细胞表达AAH的示意图。图9为加载成熟抗原的DC的产生方法的示意图。图10为用AAH加载DC进行免疫的方案流程图。图11显示AAH免疫对小鼠中肿瘤生长的治疗效果的确定方法的示意图。图12显示AAH免疫对小鼠中肿瘤生长的治疗效果的线图。
具体实施方式
AAH为蛋白质，其表达与多种肿瘤类型相关(參见如USPN 6,815,415 ；USPN 6，812，206 ；USPN 6，797，696 ；USPN 6，783，758 ；USPN 6，835，370 和 USPN 7，094，556)。HAAH 过量表达已通过免疫组化染色(IHC)在多种肺癌(例如，腺癌、细支气管肺泡癌和其他非小细胞肺癌如鳞状细胞癌亚型(Luu等，2009，Hum. Pathol. 40 :639-644)，肝癌(如肝细胞癌和胆管癌和胆上皮細胞癌(Wang等，2010，Hepatology 52 :164-173)，胃肠组织(如结肠、 胃、食道)癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巣癌、胆管癌、乳腺癌、肾癌、膀胱癌和脑癌(如成胶质細胞瘤和神经母細胞瘤)中测得。肿瘤组织样品和細胞系的另ー调查证实在以下其他癌症中(与非癌组织相比)的AAH表达喉癌、宫颈癌、输卵管癌、肝癌(如胆管癌)、肾癌、 乳腺癌、宫颈癌、卵巣癌、输卵管癌、喉癌、肺癌、甲状腺癌、胰腺癌、胸腺癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、胆囊癌、结肠癌和直肠癌(Song等，2010，Chinese J. of Cell, and Mol. Immunol. 26 :141-144)。HAAH为癌症高度特异性，其已通过免疫组织化学在> 99%的测试肿瘤样品(η > 1000)中测得，而在相邻的未受侵袭组织或在正常个体的组织样品中没有。将使用经AAH致敏的細胞的免疫治疗给予患在細胞表面表达AAH的肿瘤患者。这类肿瘤包括肝癌如肝細胞癌和胆管癌以及乳腺和结肠的腺癌。这类治疗策略不但可用于治疗癌症，也可用于预防癌症。在本发明以前，尽管肝癌的诊断和局部控制有所发展，但尚无有效的全身治疗法。 免疫治疗因其特异性而用于治疗全身和局部肝癌。发现使用AAH的树突细胞疫苗治愈有免疫力小鼠内已建立的肝細胞癌。AAH树突细胞疫苗降低表达AAH的肿瘤的生长以降低肿瘤负荷井根除人体内肿瘤。免疫治疗恶性肿瘤的免疫治疗在对肿瘤細胞的特异性响应方面引人关注。免疫治疗的ー个原理是癌細胞充满潜在抗原，当由抗原呈递细胞呈递给辅助与細胞毒性T細胞时这些抗原成为免疫原性。不论是否为全身性，肝癌的免疫治疗是可行的临床方法，因为肝癌細胞表达多种肿瘤相关蛋白，这些蛋白在正常组织内不表达或仅少量表达。例如，在成人组织内不表达的AFP在肝細胞癌(HCC)中广泛表达。多项研究显示AFP特异性免疫反应不单可在小鼠内诱发还可在人体内诱发。但是，靶向AFP的HCC免疫治疗临床试验未显示哪怕是部分的肿瘤应答。ー些可能的理由有因为AFP不參与癌的进展，不表达AFP的癌細胞在APP-靶向的免疫治疗中占优势。为使HCC細胞被AFP响应T細胞识别，AFP应与I型主要组织相容性复合抗体(MHC)分子一起呈递于細胞表面，因为AFP不分布在細胞表面。但是，由于I型 MHC分子通常在很多癌細胞中被下调，AFP可能不被T细胞恰当地识别。为克服肝癌免疫治疗的问题，进行研究以鉴定与肝癌相关的另一抗原以用来致敏细胞供基于细胞的治疗。考虑到用AFP作为抗原的結果，AAH的抗肿瘤结果出乎意料。AAH也称为ASPH，在肝細胞癌和胆管細胞癌中強烈表达，但在这些组织类型的正常細胞对应体中不表达。因此，AAH是肿瘤相关蛋白。因其独特性质，AAH可用于肝癌的免疫治疗。首先，AAH赋予癌細胞移动性，该移动性与癌转移相关；因此，靶向表达AAH的細胞的治疗能有效抑制转移灶以及原发肿瘤。其次，由于AAH是膜蛋白，其大部分暴露于胞外空间，易于免疫細胞接触所述蛋白，即使I型分子被下调。再次，除AAH以外，尚未知胆管細胞癌特异性的抗原蛋白。因此，AAH可独特地作为针对肝癌的免疫治疗的靶分子。免疫治疗方法包括注射载有感兴趣蛋白的树突細胞(DC)。DC是捕获、处理和呈递抗原给T細胞以诱导和控制T細胞介导免疫的专门細胞。DC广泛用于免疫，不单用于实验动物也用于荷瘤患者。本文所述方法包括基于DC免疫接种以诱发针对AAH的免疫。本方法比此前所述产生载有感兴趣蛋白的免疫原性小鼠DC的方法(Gehring等，2008，J. Immunol. Meth. 332:18-30)至少在两方面有所改善。其ー为刺激DC吋，此前采用脂多糖(LPQ，这种强热原可能不适于体内使用。其ニ为根据DC的IL-12分泌和不同表面DC标记物的表达来判断，DC刺激较弱。因此，对产生免疫原性DC的方法有所改进。树突细胞疫苗最有前景的HCC免疫治疗方法是利用DC的方法，因为DC具有诱导T細胞介导肿瘤免疫的強大能力。DC源自造血細胞，并专用于捕获并处理抗原，将蛋白转化成肽呈递在 MHC分子上并由T細胞识别。DC强效诱导并控制T細胞免疫。基于DC的免疫治疗是根据肿瘤充满潜在抗原且这些抗原由DC呈递时成为免疫原性这一事实。DC获自对象，例如通过细胞分离法。这些细胞此时为离体，载有(即，接触过) 肿瘤抗原(例如，肿瘤細胞裂解物；凋亡或坏死的肿瘤細胞；重组、合成或纯化的肿瘤抗原肽或蛋白；或编码肿瘤抗原的核酸如RNA)，经刺激以成熟，并重注射入患者以诱导强T細胞免疫。AAH肿瘤抗原AAH是II型膜蛋白，在C-末端区域具有催化域。该蛋白大部分位于細胞膜外，使免疫細胞能接触此蛋白。AAH蛋白在HCC、胆管癌和乳腺或结肠源的腺癌中強烈表达，而在正常组织对应体中很少测得或完全不可检测。因此，AAH是HCC和其他荷AAH肿瘤的基于 DC的免疫治疗的理想靶标分子。AAH在肿瘤細胞中的过量表达提高細胞移动性，该移动性使肿瘤細胞具有恶性表型。对HCC的临床病理学研究发现AAH过量表达与组织学评级和肝内转移有关。因此，靶向表达AAH的肿瘤細胞群体抑制载AAH肿瘤的发生和发展。表1 人AAH的氨基酸序列
MAQRKNAKSSGNSSSSGSGSGSTSAGSSSPGARRETKHGGHKNGRKGGLSGTSFFTWFMV61エALLGVWTSVAWWFDLVDYEEVLGKLGIYDADGDGDFDVDDAKVLLGLKERSTSEPAVP121PEEAEPHTEPEEQVPVEAEPQNIEDEAKEQIQSLLHEMVHAEHVEGEDLQQEDGPTGEPQ181QEDDEFLMATDVDDRFETLEPEVSHEETEHSYHVEETVSQDCNQDMEEMMSEQENPDSSE241PWEDERLHHDTDDVTYQVYEEQAVYEPLENEGIEITEVTAPPEDNPVEDSQVIVEEVSエ301FPVEEQQEVPPETNRKTDDPEQKAKVKKKKPKLLNKFDKTIKAELDAAEKLRKRGKエEEA361VNAFKELVRKYPQSPRARYGKAQCEDDLAEKRRSNEVLRGAIETYQEVASLPDVPADLLK421LSLKRRSDRQQFLGHMRGSLLTLQRLVQLFPNDTSLKNDLGVGYLLIGDNDNAKKVYEEV481
LSVTPNDGFAKVHYGFILKAQNKIAESIPYLKEGIESGDPGTDDGRFYFHLGDAMQRVGN541KEAYKWYELGHKRGHFASVWQRSLYNVNGLKAQP丽TPKETGYTELVKSLERNWKLIRDE601GLAVMDKAKGLFLPEDENLREKGDWSQFTLWQQGRRNENACKGAPKTCTLLEKFPETTGC661RRGQIKYSIMHPGTHVWPHTGPTNCRLRMHLGLVIPKEGCKIRCANETRTWEEGKVLIFD721
DSFEHEVWQD ASSFRLIFIV DVWHPELTPQ QRRSLPAI (SEQ ID NO: 1; GENBANK 登录号S83325 ；His基序带下划线；催化域内的保守序列由粗体标出；催化域包含SEQ
ID NO 1 的 650-700 残基)。表2 人 AAH cDNA 序列
cggaccgtgc aatggcccag cqtaagaatq ccaaaaqcaq cgacaacagc agcagcagca 61
gctccggcagcggtagcacgagtgcgggcagcagcagccccggggcccggagagagacaa121agcatggaggacacaagaatggg^ggaaaggcggactctcgggaacttcattcttcacgt181ggtttatggtgattgcattgctgggcgtctggacatctgtagctqtcgtttggtttgatc241ttgttaactatgaggaagttctaggaaaactaggaatctatgatgctgatggtgatggag301attttaatgtggatgatgccaaagttttattaggacttaaagagagatctacttcagagc361cagcaqtcccgccagaagaggctgagccacacactgagcccgaggagcaggttcctgtgg421SLggcaqaaccccagaatatcgaagatgaagcaaaagaacaaattcagtcccttctccatg481aaatgatacacgcagaacatgttgagggagaagacttgcaacaagaagatggacccacag541cragaaccacaacaaqaggatgatgagtttcttatggcgactgatgtagatgatagatttg601aaaccctqgaacctgaagtatctcatgaagaaaccgagcatagttaccacgtggaagaga661cagtttcacaagactgtaatcaggatatggaagagatgatgtctgagcagqaaaatccag721attccagtgaaccagtagtaqaagatgaaagattgcaccatgatacagatgatgtaacat781accaaqtctatgaggaacaagcagtatatgaacctctagaaaatgaagggatagaaatca841cagaagtaactgctccccctgaggataatcctgtagaagattcacaggtaattgtagaag901aaqtaaqcatttttcctgtggaagaacagcaggaagtaccaccaqaaacaaataqaaaaa961
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acctgctgaa gctgagtttg aagcgtcgct cagacaggca acaatttcta ggtcatataa 1321 gaggttccct gcttaccctg cagagattag ttcaactatt tcccaatgat acttccttaa 1381 aaaatgacct tggccrtggga tacctcttga taggagataa tgacaatgca aagaaagttt 1441 atgaagaggt gctgagtgtg acacctaatg atggctttgc taaaqtccat tatgacttca 1501 tcctgaaggc acagaacaaa attactaaga qcatcccata tttaaaggaa agaatagaat 1561 ccggaaatcc tggcactgat gatgggagat tttatttcca cctgggqgat gccatqcaga 1621 gggttgggaa caaagaggca tataagtggt atgagcttgg gcacaagaqa ggacactttg 1681 catctgtctg gcaacgctca ctctacaatg tgaatggact gaaagcacag ccttggtgga 1741 ccccaaaaga aacgcrqctac acagagttag taaagtcttt agaaaqaaac tggaagttaa 1801 tccgagatga aggccttgca gtgatggata aagccaaagg tctcttcctg cctgaggatg 1861 aaaacctgag ggaaaaaggg gactggagcc agttcacgct gtggcagcaa ggaagaagaa 1921 atgaaaatgc ctgcaaagga gctcctaaaa cctgtacctt actagaaaag ttccccgaga 1981 caacaggatg cagaagagga cagatcaaat attccatcat gcaccccggg actcacgtgt 2041 ggccqcacac agggcccaca aactgcaggc tccgaatgca cctgggcttg gtgattccca 2101 aggaaggctg caagattcga tgtgccaacg agaccaggac ctgggaggaa ggcaaggtgc 2161 tcatctttqa tqactccttt gagcacgagg tatggcagga tgcctcatct ttccggctga 2221 tattcatcgt ggatgtgtgg catccggaac tgacaccaca gcagagacgc agccttccag 2281
caatttagca tgaattcatg caagcttggg aaactctgga gaga(SEQ ID NO :2 ；GENBANK登录号S83325 ；编码起始甲硫氨酸的密码子带下划线)。临床应用抗原呈递細胞(APC)如DC采用白血球单采术取自对象，如患有癌症或有发生癌症风险的人患者。此类过程通常在单采血液成分中心进行(第1天)。用已知方法纯化的树突細胞接触抗原如AAH或AAH以及AFP。抗原接触后，細胞在細胞因子混合物中培养(第 2-3天)。然后将经抗原致敏并激活的DC给予患者(第3-4天)。治疗的示范性过程包括在4周时间内给予3次DC。用下列材料和方法产生本文所述数据。动物7-8 周龄的雌性 BALB/c(H_2d)小鼠购自 HSD 有限公司(Harlan Sprague Dawley, Inc.)，并保持在无特定病原条件下。制备磁性微珠免疫磁珠(1. 3 μ m ；卡巴开公司(Calbiochem))用50mM，pH 8. 5的硼酸盐缓冲液清洗3遍，并重悬于pH 9. 0，含0. lmg/ml AAH或GFP蛋白的50mM硼酸盐缓冲液中。然后， 悬液在不断搅拌条件下室温孵育过夜。离心珠粒，用PBS清洗并以固体含量30mg/ml的浓度重悬于PBS。DC 分离
DC 分离米用已知方法进行(例如(Gehring 等，2008，J. Immunol. Meth. 332 18-30))。可选由白血球单采术获得細胞。在第0天和第6天将IOyg编码Fms-样酪氨酸激酶受体-3配体(FLT3L)的表达质粒pUMVC3-hFLex注入小鼠尾静脉。脾细胞由注射了 FLT3L的小鼠用NH4Cl红细胞裂解缓冲液制备，5x IO7个细胞在含10 μ 1磁性微珠的无血清 DMEM中孵育4-6小吋。收集細胞，用MACS MS柱(美天旎公司(Miltenyi))通过磁场以富集摄取磁珠的細胞。然后，采用Lympholyte M(塞得兰公司(Cedarlane))对细胞进行密度梯度离心以消除游离珠和死細胞。收集活細胞，用汉克斯(Hank' s)缓冲盐溶液(HBSS)清洗2次，并用于后续实验。分离细胞的活力>90%，且分离細胞中CDllc阳性群体的百分数为 70-80% ο细胞培养DC在HEPES缓冲的补充有10%小鼠血清(艾奎泰克生物公司(Equitech Bio))、 2mM L-谷氨酰胺、50 μ M 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、20ng/ml GM-CSFU00ng/ml IL_4、20ng/ml IFN-γ 和 1 μ g/ml CD40L(所有细胞因子购自派普罗泰克公司(Peprotech))的RPMI1640中，在6孔超低贴附平板(康宁公司(Corning))上培养40 小吋。就細胞因子释放而言，脾细胞生长于含2mM L-谷氨酰胺、50nM 2-巯基乙醇、100U/ ml青霉素和100 μ g/ml链霉素的无血清X-VIVO 15 (龙沙公司(Lonza))中。就細胞毒性试验而言，脾细胞生长于HEPES缓冲的补充有10%胎牛血清(大西洋生物公司(Atlantic Bio))、2mM L-谷氨酰胺、50 μ M 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素100 μ g/ml链霉素、Ix非必需氨基酸(龙沙公司)、0. 5x氨基酸溶液(英杰公司(Invitrogen)和ImM丙酮酸钠的完全 RPMI1640中。SP2/0细胞培养于补充有20%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和 100 μ g/ml链霉素的Dulbecco极限必需培养基中。酶联免疫吸附实验(ELISA)DC或脾细胞在含或不含AAH蛋白的无血清培养基中生长48小吋。然后收集细胞上清液，离心并进行ELISA实验。IL-12、p70、IFN-γ和IL-4的ELISA采用ELISA Ready-SET-Go ！试剂盒(易生物科学公司(eBioscience))按照生产商说明书进行。流式細胞分析通过流式細胞术按此前所述(Gehring等，2008)分析細胞表面标记物的表达。用 3-6x IO5个细胞来染色。細胞用染色缓冲液(含5% FBS的HBSS)清洗，与2. 5 μ g/ml小鼠BD Fc Block(BD生物科学公司(BD Biosciences)) 一起4°C孵育5分钟，再与染色抗体一起在4°C孵育30分钟。所用抗体为抗-⑶llc(HL3 ；BD生物科学公司)、抗-⑶40 (3/23 ； BD生物科学公司)、抗-CM4(3E2 ；BD生物科学公司)、抗-CD80 (16-10A1 ；BD生物科学公司)、抗-⑶86 (GLI ；BD生物科学公司)、抗-I-Ad(AMS-32. 1 ；BD生物科学公司)和抗-CDSa (53-6. 7;易生物科学公司)，所有抗体均与荧光团偶联。仓鼠、大鼠和小鼠免疫球蛋白G同种型匹配对照也用于染色对照。清洗2遍后，細胞重悬于染色缓冲液，并用 FACSCalibur (BD生物科学公司)进行流式細胞分析。通过用7-氨基-放线菌素D (易生物科学公司)的細胞染色将死细胞从分析中除去。用CellQuest软件(BD生物科学公司)然后用FlowJo软件(三星公司(Tree Star))处理数据。疫苗接种与細胞因子培养40小时后，在第0天和第14天将2. 5x IO5細胞皮下注射入右胁和左胁(每只小鼠5x IO5个細胞)。在第观天，经免疫的小鼠用于进一歩的实验，包括细胞因子释放和細胞毒性试验。细胞毒件试骑从经免疫小鼠制得脾細胞，将5x IO7个脾細胞在含0. 5 μ g/ml AAH蛋白的完全培养基中生长2天，并在添加lOng/ml IL-2后再生长2天。2x IO4个靶SP2/0細胞与6_60x IO4个效应脾细胞在无血清培养基中混合，200x g离心5分钟，并在(X)2培养箱中孵育4小吋。收集培养上清液，上清液中释放的乳酸脱氢酶活性通过按生产商的说明书使用LDH细胞毒性检测试剂盒(罗氏公司(Roche))測定。用以下公式计算％靶细胞裂解((几效应细胞+ IE细胞效应细胞_Λ Ε细胞)I^iii1 (Α 细胞+曲通)("Ae细胞))χ 100，其中A表示490nm的吸光度。由经不同细胞因子体外刺激的分离DC分泌的IL-12此前所用的方法包括DC的体内扩增，磁性微珠的摄取，所述微珠上涂覆有抗原和 DC刺激物包括LPS和抗-⑶40抗体，并由通过磁性柱来分离DC。不同于用涂覆于珠粒上的刺激物刺激DC，本改进方法涉及通过在多种细胞因子存在下生长两天来刺激分离的DC，由于刺激物应与細胞表面的相应受体相互作用，而被DC摄取的珠粒上的刺激物不能有此相互作用。包括IL-4、IFN-y和⑶40L的一些细胞因子刺激并促进DC成熟。因此，检查这些細胞因子对DC成熟的組合效应。进行DC的扩增、摄取和分离。分离的細胞在GM-CSF，和/ 或IL-4，和/或IFN- Y，和/或CD40L的存在下培养40小时。始终添加GM-CSF,因其为DC 存活所必需。成熟而非未成熟的DC強烈生产辅助与細胞毒性T细胞极化必需的IL-12。因此，IL-12水平用作DC刺激的指示剂。收集培养的上清液，通过ELISA測定IL_12p70的浓度。结果表明当DC培养中存在所有細胞因子时IL-12p70最高(图1)。各細胞因子単独或組合用于刺激。优选用所有細胞因子刺激DC。但是，CD40L是可选的。成熟DC标记物在经刺激DC表面的表达为研究細胞因子刺激对成熟DC标记物表达的影响，测定细胞因子存在下生长40 小时的DC与无培养DC的标记物表达。泛DC标记物⑶Ilc的表达在培养后未改变(图2、 3)。但是，包括⑶40、CD54, CD80、CD86和II型MHC(I-Ad)在内的所有成熟DC标记物在生长40小时的DC中都显著上调(图2、3)。⑶8a+ DC为能有效刺激CTL的DC子集。评估了細胞因子刺激对CDSa+DC群体的影响。如图4所述，DC中CDSa+群体的百分数在刺激期间显著上升。这些结果表明该方法不用LPS所产生的細胞具有基于DC免疫所需的充分品质。AAH免疫小鼠的脾细胞响应AAH的IFN- γ分泌为检查ThI应答是否被AAH免疫诱发，测定响应AAH蛋白的ThI細胞因子IFN-γ的生产。小鼠以2周间隔用DC免疫两次，所用DC摄取了 AAH或GFP-涂覆珠粒或无任何抗原的珠粒。后一次免疫2周后，从免疫小鼠制备脾細胞，在AAH存在下培养48小吋，并测定培养上清液中IFN-Y的浓度以检查经AAH免疫小鼠的脾细胞是否响应AAH刺激生产IFN-γ。 经AAH免疫小鼠的脾细胞以剂量依赖性方式強烈生产IFN-Y (图幻。尽管在伴刀豆球蛋白 A (Con Α)存在下，来自三组的脾细胞生产了可观量的IFN-γ，但对照脾细胞在AAH刺激时仅生产微量IFN- Y (图5)。这ー结果表明对在免疫小鼠中产生对AAH的ThI細胞响应。AAH免疫小鼠的脾细胞响应AAH的IL_4分泌为研究AAH负荷DC是否诱发针对AAH的体液免疫，測定在IFN- γ測定的相同样品中Th2細胞因子IL-4的浓度。不论免疫与否，Con A刺激的脾细胞都产生大量IL_4(图 6)。相反，用三种DC免疫的小鼠制得的脾细胞仅生产痕量IL-4(图6)，表明针对AAH的TH2 細胞响应未被AAH免疫有效诱发。经AAH免疫小鼠中针对AAH表汰细胞的CTL活件为确定在AAH免疫小鼠中是否诱发响应AAH的CTL，通过用表达AAH的SP2/0細胞为靶细胞评估細胞毒性。SP2/0細胞与AAH蛋白和IL-2活化后的来自免疫小鼠的脾细胞共培养4小吋。通过测定濒死细胞释放的乳酸脱氢酶活性评估靶細胞裂解效率。如图7所述，经AAH免疫小鼠的脾细胞的CTL活性高于其他对照脾細胞，表明AAH免疫诱发AAH响应性 CTL。经AAH免疫小鼠中的AAH响应件T细胞当小鼠用载AAH的DC免疫吋，诱发AAH响应性ThI細胞和CTL。抗原特异性T细胞扩增是表明产生抗原响应性T細胞的另一重要指标。AAH体内免疫的抗肿瘤效应用AAH致敏DC进行AAH免疫诱发抗肿瘤免疫。小鼠用载AAH的DC以2周间隔免疫两次，后一次免疫2周后，SP2/0细胞植入皮下，测定植入肿瘤尺寸的生长。这一荷瘤模型所得数据反映免疫接种的预防效果。为评估AAH免疫的治疗效果，SP2/0先行植入，然后当肿瘤生长至直径5mm吋，用载AAH的DC免疫小鼠，并测定对肿瘤生长的效果。AAH靶向的免疫治疗还抑制转移。小鼠用载AAH的DC免疫，然后注射SP2/0細胞入尾静脉。两周后，切除肺，对形成的结节计数。免疫小鼠内结节数量相对未免疫小鼠中数量的减少表明载AAH的DC免疫方案抑制荷AAH肿瘤的转移。用载AAH的成熟树突細胞免疫接种显著降低表达AAH肿瘤的肿瘤负荷(肿瘤体积)。图11和12显示小鼠中AAH免疫接种对肿瘤生长的治疗效果。5X IO5个BNL IME A. 7R. 1小鼠肝癌細胞皮下植入6周龄BALB/c小鼠胁部。在第10天和第15天，将5 X IO5个载有AAH或GFP的成熟DC或HBSS皮下注射入荷瘤小鼠。肿瘤尺寸每周測定。用如下公式确定肿瘤体积0. 52X (长)X (宽)2。各数据点代表平均肿瘤体积士标准误差(n = 6)。 发现肿瘤体积在用载AAH的DC免疫后显著减小。使用本领域已知肿瘤模型的这些数据表明用载AAH成熟DC的治疗方法能在体内有效减少和消除载有AAH的肿瘤。此类树突細胞疫苗显示针对任何表达AAH的肿瘤的有效抗肿瘤效果。通过AAH和AFP同时免疫增强抗肿瘤效果AFP是对小鼠和人为免疫原性的仅有的HCC相关蛋白。但是，也已显示其抗肿瘤效果不足以用于人HCC患者。但是，用AAH和AFP同时免疫增强对同时表达AAH和AFP的肿瘤如HCC的免疫应答。表达AFP的SP2/0細胞的稳定系通过导入AFP表达质粒DNA产生。通过使用所述細胞，測定在经载AFP和载AAH的DC免疫小鼠中的体外CTL活性。免疫后的細胞毒性增强表明免疫引起AAH和AFP联合免疫对荷有AAH和/或AFP的肿瘤生长的抗肿瘤效果。
权利要求
1.一种降低对象内表达天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)-β-羟化酶(AAH)肿瘤的生长的方法，包括给予所述对象分离的载AAH的成熟树突細胞，其中所述表达AAH的肿瘤的生长在给予所述树突細胞后降低。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在干，所述肿瘤选自下组肝癌、胃肠癌、胰腺癌、 乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巣癌、输卵管癌、喉癌、肺癌、甲状腺癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌和脑癌。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在干，在向所述对象进行所述给予前，所述树突细胞用含GM-CSF和IFN- γ的細胞因子组合离体激活。
4.一种产生致敏树突細胞的方法，其包括使分离的树突細胞接触抗原，在所述抗原接触步骤后，使所述树突細胞接触細胞因子的組合，所述组合包含GM-CSF和IFN- γ。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在干，所述组合还包括IL-4。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在干，所述组合还包括CD40L。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在干，所述树突細胞与所述细胞因子組合接触至少10小时。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在干，所述树突細胞与所述细胞因子組合接触至少40小时。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在干，所述抗原包括ΑΑΗ。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在干，所述抗原包括AAH和AFP。
11.如权利要求3所述的方法，其特征在干，所述抗原是可溶形式。
12.如权利要求3所述的方法，其特征在干，所述抗原连接于固相载体。
13.如权利要求3所述的方法，其特征在干，所述固相载体包括聚苯乙烯珠。
14.如权利要求3所述的方法，其特征在干，所述固相载体为生物可降解的。
15.如权利要求3所述的方法，其特征在干，所述树突細胞通过白血球单采术从对象获得。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在干，所述对象患有癌症或有发生癌症的风险。
17.一种疫苗組合物，其包含由权利要求4的方法产生的致敏树突細胞。
18.一种含载AAH的成熟树突细胞的疫苗，其用于治疗哺乳动物对象中表达AAH的肿瘤。
19.ー种抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，其包括鉴定患有载AAH肿瘤的对象，并给予所述对象自体树突細胞，其中所述自体树突细胞按权利要求4所述方法致敏。
20.一种预防哺乳动物中肿瘤发生的方法，其包括鉴定有发生载AAH肿瘤风险的对象， 并给予所述对象自体树突細胞，其中所述自体树突细胞按权利要求3所述方法致敏。
21.ー种预防载AAH肿瘤转移的方法，其包括鉴定患有载AAH肿瘤的对象，并给予所述对象自体树突細胞，其中所述自体树突细胞按权利要求4所述方法致敏。
22.如权利要求1、15、16、18、19、20或21所述的方法，其特征在干，所述对象是人、犬、 猫、马、牛或猪对象。
全文摘要
一种含载AAH的成熟树突细胞的疫苗用于治疗哺乳动物对象中表达AAH的肿瘤。一种生产致敏树突细胞的方法，通过使分离的树突细胞接触抗原如AAH来进行。抗原接触步骤之后，树突细胞与细胞因子组合如GM-CSF和IFN-γ接触。
文档编号A61K39/00GK102596234SQ201080033781
公开日2012年7月18日 申请日期2010年7月23日 优先权日2009年7月24日
发明者J·R·万德斯, 下田雅史 申请人:罗得岛医院