专利名称：干扰素类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域。尤其涉及表现出较少不期望的副作用的干扰素(IFN)的生物活性类似物(analog)及其治疗应用。
背景技术：
已经在哺乳动物中识别出大约十种不同的IFN ;这些中的七种为人干扰素。它们通常分为三类IFN :1型IFN、II型IFN以及III型IFN。所有的I型IFN都结合到称为IFN- α受体(IFNAR)的特异细胞表面受体复合物，该IFN-α受体由IFNARl和IFNAR2链组成。人体中存在的I型干扰素为IFN-a ,IFN-β以及IFN-ω。II型干扰素结合到IFNGR。在人体中，这是IFN-Y。通过与它们的特异细胞表面受体相互作用，IFN激活信号传导物和转录活化因子(STAT)的复合物；STAT是调节某些免疫系统基因的表达的转录因子的家族。一些STAT由I型和II型IFN两者激活。然而，每种IFN类型也能够激活独特的STAT (Platanias， L. C. 2005Nature reviews. Immunology 5(5) :375-386)。属于所有IFN类别的IFN对于对抗病毒感染非常重要。虽然它们是以它们在宿主细胞内“干预”病毒复制的能力而命名的，但是IFN具有其他的功能它们激活免疫细胞，例如天然杀伤细胞和巨噬细胞；它们通过上调抗原呈递至T-淋巴细胞的抗原来增进感染或肿瘤细胞的识别；并且它们增强未受侵染的宿主细胞抵抗由病毒引起的新感染的能力。某些宿主症状，例如肌肉疼痛或发烧，与感染期间IFN的产生有关。IFNy是由激活的免疫细胞产生的多效细胞因子。它通过几乎在所有细胞类型上表达的IFN Y受体发挥作用，然而，它表现出严格的种属特异性。IFNy已经应用于免疫、病毒以及肿瘤疾病的治疗(Younes and Amsden, J Pharm Sci2002),具有明显的效果。另外,几项研究已经表明在肾和肝纤维化方面IFNy的潜在作用(Kidney Int. 1999 ；56 =2116-27,Hepatology 1996 ；23 :1189-99)。遗憾的是，目前可提供的干扰素的短的循环半衰期和不希望的全身性副作用已限制了它的临床应用，并且甚至使临床试验停止了。为克服这些问题已经做了许多尝试，例如将IFNy并入脂质体、微球体以及弹性体内(Pharm Res. 200017 42-8,Pharm Res. 199613 1464-75，J Control Release. 2005102 :607-17)。迄今为止，还没有使用特定的细胞传送途径。因为这样的途径对于需要传送到它们自己的受体以引起生物学效应的细胞因子通常认为是不可能的，从而它们总是在表达这些受体的靶细胞中结束的事实，这并不令人吃惊。因此传送到其他靶受体在多数情况下将是无用的并且至多引起在其他细胞类型中导致活性丧失或不利影响的进一步多样化的摄取。然而，本发明人意识到INF的结构提供独特的靶向机会，因为其分子包括种属特异性的受体结合部分和非种属特异性并在细胞内发挥作用的信号传导部分。惊奇地发现，INFy独特的结构允许将IFNy的信号传导部分传送到另一靶受体，前提是该新的靶受体能实现该信号传导部分的细胞内释放以及细胞内/细胞核的INFy信号传导路径的随后激活。例如，当与全长的IFNy或非靶向的IFNy模拟物相比较时，靶向血小板衍生生长因子(PDGF,Platelet Derived Growth Factor)受体的截短的IFNy模拟物在急性肝损伤小鼠模型中显示出明显少的全身性副作用。
发明内容
因此，本发明涉及干扰素类似物(IFN)，其中，介导结合到它的天然受体的部分至少被功能性破坏，并且其中该类似物包括能够介导细胞内IFN活性的信号传导部分，可选地通过接头，所述信号传导部分提供在它的N-端，具有能够结合到不同于IFN受体的细胞表面受体的至少一个靶向域。优选地，该类似物为IFNy (IFNy)类似物。提供有异源性靶向部分的干扰素类似物是本技术领域内已知的。W02008/068621公开了 IFNy和靶向部分的偶联产物，例如肿瘤靶向部分或肿瘤脉管系统靶向部分。现有技术仅公开了偶联到全长的IFNy的偶联物，其仍然结合到它的天然受体，导致不利影响。EP0844252旨在提供环肽及其制备方法，其允许随后在所述环肽上化学接枝或偶合，也就是说它们附着在固体支撑体上、高分子量化合物上、标记物上和/或其他环肽上， 以提供特别是在亲和色谱法、免疫、诊断检测开发、疫苗和药物组合物领域内新的或改进的生物科技应用。它教导了将环肽配体偶合到生物分子，特别是偶合到干扰素。在EP0844252中没有提及结合到它的天然受体的缺乏功能结合域的截短的IFN分子的用途。相对于(改性的)全长干扰素的应用，不仅在它的治疗应用(由于较低的分子量具有更少的副作用、提高的功效、降低的抗原性)方面而且在它的制备方法(重组合成)方面，本发明的干扰素类似物具有明显的出人预料的优点。介导结合到它的天然受体的部分的功能性破坏能够通过缺失、插入、取代受体结合域的一个或多个相关的氨基酸残基实现。干扰素受体结合域已经被识别并且在本领域内是已知的。例如，小鼠IFNy向INFy受体的结合能够通过至少部分地缺失第一 40、30或20N-端残基而被破坏。在一个实施方式中，该类似物为截短的只包括参与细胞内信号传导的残基的IFNy多肽。如文中所用，细胞内信号传导可以包括核易位和/或抗病毒活性。优选地，介导细胞内活性的信号传导部分包括在人和小鼠IFN的C-端发现的多兀核定位信号(NLS, nuclear localization signal)基序(Subramaniam 等，2000, J. CellScience, 113，2771-2781)。该NLS基序被认为形成具有信号传导物和转录活化因子(STAT)的复合物；STAT是调节某些免疫系统基因的表达的转录因子的家族。一些STAT由I型和II型两种类型的IFN激活。然而，每种IFN类型也能够激活独特的STAT (Platanias，L. C. 2005Nature reviews. Immunology 5(5) :375-386)。STAT 活化引发对所有 IFN 定义最明确的细胞信号传导路径，经典的Janus激酶-STAT (JAK-STAT)信号传导路径。在该路径中，在受体与IFN结合之后，JAK与IFN受体联合，磷酸化STATl和STAT2。结果，IFN刺激基因因子 3 (ISGF3，IFN-Stimulated Gene Factor 3)复合物形成-其包括 STAT1、STAT2 以及称为IRF9的第三转录因子-并且移动到细胞核内。在细胞核内部，ISGF3复合物结合到某些基因的促进剂中称为IFN刺激响应单兀(ISRE, IFN-Stimulated Response Element)的特定的核苷酸序列；这诱导这些基因的转录。本申请提供的类似物可以包括多元NLS基序，该多元NLS基序包括氨基酸序列(R)KRXRS (R)，其中X为任何氨基酸残基，优选地，其中X为R、K、S或T。优选地，该NLS基序出现在该类似物的C-端。在一个实施方式中，它包括序列，优选C-端序列RKRKRSR，KSKRSR，KRTRS 或 KRTRSQ。在特定的方面，该信号传导部分包括选自由以下氨基酸序列组成的组中的序列或由选自由以下氨基酸序列组成的组中的序列组成(a)氨基酸序列 KFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR ；(b)氨基酸序列 YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRTRSQ 或 YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQ ；(c)氨基酸序列 AKFEVNNPQIQHKAVNELIRVIHQLSPESSLRKRKRSRC ；(d) (a)、(b)或(C)的所述序列的至少10个，优选至少15个邻接氨基酸的延伸物(stretch)； (e)表现出与(a)或(b)或(C)至少70%，优选至少80%，更优选至少90%的同一性的氨基酸序列，前提是细胞内信号传导活性得以保持；以及(f) (a)、(b)或(C)的氨基酸序列，其中至多10个、优选至多8个、更优选至多5个氨基酸残基被缺失、添加或取代，前提是所述信号传导活性，例如核易位得以保持。(g)共有序列 VxxxxVQRxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRxRS,其中 x 为任何氨基酸残基；(h)共有序列 VxxxxxQxxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRKRS,其中 x 为任何氨基酸残基；⑴共有序列Vxxxx[V/I]Q[R/H] [Q/K]A[F/V/I] [N/H]ELI [R/Q]Vx[H/A] [Q/E]L[L/S]P[E/A] [S/A] [S/A] [L/K]xxKRKRS，其中 x 为任何氨基酸残基。(a)的氨基酸序列表示截短的小鼠IFNy序列；(b)的序列为人同源物；以及(C)的序列为大鼠同源物。优选地，本发明的类似物包括(a)、(b)或(C)序列的至少10个，优选至少15个,更优选至少20个邻接氨基酸的延伸物。在一个实施方式中，所述延伸物包括(a)或(b)或(C)的序列的N-端序列。在另一个实施方式中，所述延伸物包括(a)、(b)或(c)的序列的C-端序列，优选至少最后15个氨基酸。在又一实施方式中，该延伸物包括(a)或(b)或(c)的序列的间插序列。示例性的序列为LLPESSLRKRKRSR，KFEVNNPQVQRQ,QAFNELIRVVHQLL, MAELSPAAKTGKRTRSQ, YSVTDLNVQRKAI,KAIHELIQVMAELS。技术人员将会理解具有对(a)或(b)或(C)的序列进行一个或多个氨基酸改变的变体也属于本发明的范围。(a)或(b)或(C)的氨基酸序列，其中至多10个，优选至多8个，更优选至多5个氨基酸残基被缺失、添加或取代，前提是信号传导活性，例如核易位得以保持。人和小鼠的IFNy序列的比对表明36个残基中的15个(41% )是相同的，并且36个残基中的24个(66%)是带正电荷的。根据clustal W对比软件进行同一性匹配。人干扰素Y 4YSVTDLN VQR K AIHELIQV MAELS PAAKTG KRTRSQ39+ V + VQR + A +ELI+V + +L P+ KR RS+小鼠干扰素Y3FEVNNPQ VQRQ AFNEL I RV VH QLL PESS LRKRK RS R38在序列之间的线表示保守残基，产生上文(g)表示的共有序列。人、大鼠以及小鼠干扰素Y的比对能够提供(h)和⑴的共有序列。在一个实施方式中，类似物包括根据上述共有序列(g)、(h)或⑴的信号传导部分。
其他有用的序列包括表现出与(a)或(b)或(C)至少70%，优选至少80%，更优选至少95%的同一性的氨基酸序列，前提是细胞内信号传导活性得以保持。在特定的方面，该类似物包括根据以下共有序列的信号传导部分Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4V a I Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9G I n Xaa10Xaa11Ala Xaa12Xaa13Glu Leu He Xaa14Val Xaa15Xaa16Xaa17Leu Xaa18Pro Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Lys Arg Lys Arg Ser Xaa24Xaa25,其中Xaa1、Xaa2、Xaa3Xaa4Xaa6Xaa11、Xaa13、Xaa14、Xaa16Xaa17、Xaa18Xaa19Xaa20
Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24 以及 Xaa25 为任何氨基酸残基；Xaa5为极性的、不带电荷的残基，例如Asn或Thr ；
Xaa7为非极性的、疏水性的残基，例如Pro或Leu ；Xaa8为极性的、不带电荷的残基，例如Gln或Asn ；Xaa9为非极性的疏水性残基，例如Val，Ile或Leu ；Xaa1Q为极性的碱性残基，例如Arg，His或Lys ；Xaa12为非极性的疏水性残基，例如Phe，Val或Ile ;Xaa15为非极性的疏水性残基，例如Val，He, Met。优选地，类似物包括对应于小鼠IFN Y中的残基95 133或人IFN Y中的残基95 134的序列作为信号传导部分。该序列具有抗病毒活性(Mujtaba等，2006，Clinicaland Vaccine Immunology,第 13 卷，第 8 期，944-952 页)。类似物的信号传导活性可以容易地通过本领域内已知的方法测定。例如，如由Subramaniam等所描述的，类似物被小鼠巨噬细胞细胞系细胞内摄取时能够测定类似物的诱导STATl α核易位的能力。信号传导活性也能够通过Statl α转录因子和Statl α细胞核输入者的复合物的形成来评估(2001, J. Interferon Cytokine Res. 21 (11) :951-959)。其他合适的体外试验包括小鼠巨噬细胞中例如，RAW细胞系中的NO-产生。在一个实施方式中，该类似物表现出它的全长干扰素的相似物的至少30%，优选至少50%，更优选至少75%的(体外)活性。细胞特异性靶向能够明显地提高表现出相对低的体外活性的类似物的体内功效。如上文所述，本发明的类似物的特征在于不存在功能性IFN受体结合域并且存在能够结合到替代的受体的靶向域，该替代的受体能够介导上述类似物的细胞内摄取，例如在配体结合时和/或作为恒定受体运转(receptor turnover)的部分进入胞内路径的受体。将会被理解的是，被靶向的替代的或“第二”受体应该具有一定程度的细胞类型特异表达。广泛表达的受体是不太合适的候选者。而且，受体必须表达在对细胞内信号传导部分作出响应的细胞上，例如在IFNy类似物的情况下，它必须包括IFNy响应单元。优选地，靶向域能够结合到对成纤维细胞和成纤维细胞样细胞特异的受体，例如成肌纤维细胞、肝门成纤维细胞(portal fibroblast)、系膜细胞、间质成纤维细胞、肺泡成纤维细胞或基质细胞。还可以想象的是表达在肿瘤细胞上的受体。IFN Y类似物能够在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡，该肿瘤细胞能够通过表达在肿瘤细胞上的第二受体被特异性靶向。在一个实施方式中，上述受体选自由TOGF受体、胶原蛋白VI型受体以及细胞因子受体组成的组，该细胞因子受体包括TGFP受体、TNFa受体和ILlP受体、胰岛素生长因子受体、VEGF受体以及趋化因子受体(例如CXCR4)。当该类似物靶向I3DGF受体，优选TOGF-β受体时，获得非常好的结果。其他合适的靶向域包括细胞粘附肽，例如三肽Arg-Gly-Asp(RGD)，其起初被识别为介导细胞附着的纤维连接蛋白中的序列。RGD基序现已经在很多种其他蛋白质中发现并且在这些蛋白质中的许多但不是全部中支持细胞粘附。整合素，一个细胞表面蛋白质家族，担当细胞粘附分子的受体。一亚类的整合素识别在它们的配体内的RGD基序，RGD的结合介导细胞-基质和细胞-细胞之间的相互作用。包含RGD的类似物能够用作治疗诸如血栓症和癌症等疾病的治疗剂。在特定的方面，靶向域靶体能够结合到低聚糖和糖蛋白的受体，优选结合到脱唾液酸糖蛋白(ASGP)受体或甘露糖受体(CD206)。例如，该靶向域为偶联到载剂分子的低聚糖，优选为甘露糖或乳糖。在另一个实施方式中，甘露糖-6-磷酸盐(M6P)或其衍生物能够用作M6P/IGF II受体的靶向域。例如参见EP1117443。上述靶向域优选为蛋白质物质(肽)，使得类似物作为一个整体为能够被容易地制备，例如重组制备的融合多肽。然而，非蛋白质的其他类型的靶向域也是可以想象的，例 如糖类、脂类、核酸类、合成的分子及其类似物。在一个方面，靶向域包括至少一个环肽部分。肽能够通过不同的方式环化，包括形成半胱氨酸-二硫醚(disulfide)或羊毛硫氨酸桥。用于将本发明的类似物靶向期望的细胞类型的环肽在本技术领域内描述。例如，EP1117443公开了包括编码细胞受体识别肽(RPR,Receptor Recognising Peptide)的至少一个序列的环肽。在一个实施方式中，本发明的类似物在它的(环化的或线性的)靶向域中包括选自由RGD、KPT、SRN、NLI以及LID组成的组中的至少一个氨基酸序列。优选的实施方式涉及具有靶向域的类似物，该靶向域优选以(环)肽部分的至少一个串联重复部分的形式包括多个受体结合序列。该串联重复部分可以包括通过I 5个氨基酸的接头连接的两个环肽部分，该两个环肽部分优选为相同的环肽部分。这特别有利于靶向以二聚体为活性的受体，例如H)GF、TGF0或IL-10受体。在一个实施方式中，靶向域包括一段，优选两段氨基酸序列X1SRNLIdX2，其中X1和X2表示能够一起形成(肽)键，从而形成环结构的部分，其中序列SRNLID是环的一部分。该两段氨基酸序列优选由I 7个氨基酸的接头序列间隔开。优选地，X1和X2为Cys残基。本发明人发现包括氨基酸序列CSRNLIDC-接头-CSRNLIDCS的靶向域在结合到二聚I3DGFii受体上非常有效，其中，该接头为I 7个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基的氨基酸序列。例如，他们进行了比较实验，其中能够结合至TOGF受体的两种环肽通过由6个氨基酸组成的间隔区(spacer)彼此连结，而在另一种结构中，这两种环肽由11个氨基酸的间隔区偶合。在这两种结构中，间隔区包括赖氨酸残基以允许药物或示踪剂的偶合。两种双环用FITC标记并且加入到3T3细胞培养液中，表达TOGF受体并且培养2hr以检测上述结合。在培养及用抗FITC的抗体染色之后，免疫细胞化学数据表明包括6个氨基酸的间隔区的结构显著结合，而包含11个氨基酸的较长间隔区的结构仅被观察到低程度的结合。在一个实施方式中，接头可以由4个或5个氨基酸残基组成，优选选自Gly、Ala、Ser以及Thr残基的组，更优选它们中的至少三个为甘氨酸残基。优选的接头由序列K(GS)niGG组成，其中m为I或2。作为一个具体实例，靶向域包括氨基酸序列 CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS 或 CSRNLIDCKGSGSGG CSRNLIDCS 或由氨基酸序列CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS 或 CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCS 组成。在另一实施方式中，上述接头由5或6个氨基酸残基组成,优选选自Asp、Lys、Gly、Ala、Ser以及Thr残基的组。具有4 7个残基，至少4个残基，优选地至少5个残基为甘氨酸残基的接头得到了好的结果。其他合适的接头包括4 7个残基的序列,残基选自Gly以及Asp残基,例如[GnDm],其中n+m为4至7，其中η彡4并且M为O和3之间的整数。在具体实施方式
中，靶向域包括氨基酸序列 CSRNLIDC [GnDm] CSRNLIDC 或由氨基酸序列 CSRNLIDC [GnDm] CSRNLIDC 组成，其中 n+m 为 4 至7，其中η彡4，并且M为O和3之间的整数。例如靶向域由序列CSRNLIDCGGGDGGCSRNLIDC，CSRNLIDCGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDC ⑶DGGCSRNLIDC 或 CSRNLIDCGGGGGGCSRNLIDC 组成或包括这些序列。靶向域可以以任何方式附着到信号传导域上，例如通过接头或间隔区序列。合适的接头序列在长度上典型为至多15个氨基酸残基，优选至多10个氨基酸残基。可使用聚丙胺酸接头。例如，本发明提供一种干扰素Y类似物，由序列CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLP ESSLRKRKRSR, CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQ AFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR或 CSRNLIDCGGGDGGCSRNLIDCSAA AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR 组成。
靶向域也能够通过载剂分子，例如白蛋白附着在信号传导域上。如果靶向域为非蛋白质的物质，例如诸如甘露糖或乳糖等低聚糖，这特别有利。在一个实施方式中，载剂分子包括自由的反应性基团，例如羟基、胺和/或硫酸酯。载剂的大小优选为内源性血浆蛋白质，例如白蛋白、乳铁传递蛋白或纤维连接蛋白。 本发明也涉及包括结合到双环PDGF-祀向域的兴趣化合物(compound ofinterest),例如生物活性分子的偶联物(conjugate),所述祀向域包括两段氨基酸序列X1SRNLIdX2，其中，X1和X2表示一起能形成键的部分，例如形成肽或二硫醚键，从而形成双环结构，其中序列SRNLID为每个环的一部分。优选地，X1和X2为能通过形成二硫醚键实现环化的Cys残基。根据本发明的偶联物的特征在于两段氨基酸序列通过2 7个氨基酸的接头序列隔开。惊奇地发现这种特定的间隔区长度能实现TOGF受体的高效靶向，TOGF受体以二聚体具有活性。因此，也提供了一种偶联物，其包括偶联到靶向域的兴趣化合物，所述靶向域包括氨基酸序列X1SRNLIdX2-接头-X3SRNLIdX4,其中，X1和X2对以及X3和X4对能够形成(肽)键，从而形成双环结构，其中，序列SRNLID为环的一部分，并且其中接头为由2 7个氨基酸残基组成的氨基酸序列。如上文所讨论的，接头可以由4或5个氨基酸残基组成。它们能够选自Gly、Ala、Ser、Asp、Lys以及Thr残基的组,优选它们中的至少3个为甘氨酸残基。优选的接头由序列K(GS)mGG组成，其中，m为I或2。作为具体实例，靶向域包括氨基酸序列 CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS 或 CSRNLIDCKGSGSGGCSR NLIDCS 或由氨基酸序列CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS 或 CSRNLIDCKGS GSGGCSRNLIDCS 组成。在另一个实施方式中，上述接头由5或6个氨基酸残基组成,优选选自Asp、Gly、Ala、Ser以及Thr残基的组。具有4 7个残基，至少4个残基，优选至少5个残基为甘氨酸残基时获得良好的结果。其他合适的接头包括4 7个残基的序列，这些残基选自Gly和Asp残基，例如[GnDm]，其中，n+m为4到7，其中η > 4并且M为O和3之间的整数。在具体实施方式
中，靶向域包括氨基酸序列CSRNLIDC[GnDJCSRNLIDC 或由氨基酸序列 CSRNLIDC[GnDjCSRNLIDC 组成，其中 n+m 为 4 至7，其中η彡4并且M为O和3之间的整数。例如靶向域由序列CSRNLIDCGGGDGGCSRNLIDC，CSRNLIDCGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDCGDDGGCSRNLIDC 或 CSRNLID CGGGGGGCSRNLIDC 组成或包括这些序列。将序列SRNLID用作细胞靶向域在本技术领域内已为人所知。W000/23113公开了包括受体识别肽(RRP)的环肽向大于5000道尔顿的载剂分子，例如血清白蛋白的偶联。示例性RRP为I3DGF受体结合序列XSRNLIDCX，其中，X表示环化的位置。它教导了在环肽结构中，可存在多个RRP序列。它也公开了多于一个(例如5 15个环肽)附着到载剂分子。Hagens等(2007), Pharmaceutical Res.，第24卷，566-574页,表明偶联到白蛋白的环肽CSRNLIDC向肝脏星状细胞的传输。因此，现有技术的偶联物都依赖于将RRP附着到载剂分子上。本发明的偶联物的结构，其中环部分没有附着到载剂分子上，取而代之的是置于具有2 7个氨基酸的特定间隔区长度的串联基序中，没有在本技术领域内教导或建议过。发现与根据W000/23113的结合物相比，该定义明确的双环结构改善了结合到二聚TOGF受体的偶联物，其中根据W000/23113的偶联物中附着到载剂上的多个受体结合序列的数目和空间取向是任意的并且缺乏控制。固定本发明结合物中两个环部分之间的距离的串联构型被 设计用于与二聚TOGF-受体发生最佳的相互作用。而且，相对大的载剂分子的存在能够通过位阻现象降低受体之间的相互作用。双环肽可以化学制备或通过重组技术制备，这提供了非常有利于药物产业的生产方法。另外，双环结构能够直接附着在化学本体上(药物或示踪剂)、聚合物(例如，聚乙二醇，PEG)，产生细胞特定低分子量化合物的小的肽或蛋白质，其中，细胞特定低分子量化合物能够容易地渗透到血管外组织。特别是对于肿瘤靶向目的，该组织渗透可具有非常重要的作用。使用由3 5个氨基酸残基组成的接头获得非常好的结果。在一个实施方式中，偶联物包括氨基酸序列CSRNLIDC-接头-CSRNLIDCS (BiPPB)，其中，接头为2 7个，优选3 5个氨基酸残基的氨基酸序列。该双环肽适合用作对I3DGF受体(TOGF-R)具有高亲和力的低分子量靶向配体。所述肽可以通过化学法或重组合成法制备。所述接头可以包括一个或多个具有反应性侧链的氨基酸残基，其中该反应性侧链可以用于兴趣化合物的共价附着，例如可检测的标记、药物和/或诊断剂。合适的反应性氨基酸包括赖氨酸、丝氨酸以及苏氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、天门冬酰胺、酪氨酸、甲硫氨酸以及色氨酸。生物活性部分可以具有任何类型的有用的生物活性，包括细胞因子、趋化因子或前列腺素活性。它可具有蛋白质性质或非蛋白质性质。例如该部分选自药物、细胞因子、趋化因子、激素、前列腺素及其类似物的组。具体实例包括PGE2、15d-PGJ2、IL-10、IFNy、截短的IFNy。蛋白质的部分通过基因融合可以方便地附着到I3DGF-R特异性靶向域，在N-端或C-端。在一个实施方式中，它偶联到N-端。根据本发明的类似物或偶联物通过本领域内已知的方法可以偶合到内核(core)和/或载剂或传输分子。合适的内核或载剂包括树枝状大分子、脂质体，以及天然的、合成的或半合成的聚合物(支链的或直链的)。树枝状大分子已经成功地证明它们自己在不同的药物给药途径中为有用的添加剂，因为它们能够赋予药物更好的水溶性、生物药效率以及生物适应性。参见 Chen 等，Journal of Pharmaceutical Sciences,第 97 卷,第 I 期,123-143页。作为实例，本发明提供了偶联到树枝状大分子或脂质体的IFN Y-类似物。该脂质体可以包括(抗癌)药物。
在一个实施方式中，根据本发明的干扰素类似物或靶向I3DGFR的偶联物通过传统方法修饰以提高它的药物性能，例如提高功效和/或稳定性。在一个实施方式中，为了通过附着至少一个无抗原性的聚合物，例如选自由聚乙二醇(PEG)及其衍生物组成的组的聚合物来提高半衰期，修饰上述干扰素类似物或靶向I3DGFR的结合物。PEG修饰常规地通过培养具有靶大分子的PEG的反应性衍生物实现。PEG共价附着到药物或治疗蛋白质能够“屏蔽”来自宿主免疫系统(降低的免疫原性和抗原性)的试剂，增大试剂的流体动力学尺寸(在溶液中的尺寸)，该试剂通过降低肾清除率延长它的循环时间。本发明的又一方面涉及编码根据本发明的蛋白质的干扰素类似物或编码上文所述的蛋白质的靶向TOGFR的偶联物的分离的核酸序列。技术人员将能够设计和结构合适的核酸序列，例如融合结构，该融合结构利用标准的重组DNA技术编码靶向部分和生物活性部分。上述分离的核酸序列可以是表达载体的一部分，例如设计为在细菌或哺乳动物的宿主细胞中产生重组蛋白质的载体。也提供了一种宿主细胞，包括根据本发明的核酸序列或载体，优选地，其中所述宿主细胞为细菌的或哺乳动物的宿主细胞。关于它在体内的分布，文中公开的类似物或靶向I3DGF的偶联物具有改善的性能 。更具体地，它能实现将生物活性的兴趣化合物导向兴趣细胞，同时保持该特定化合物的生物活性。为了实现细胞特异性，这些介质(mediator)配备有地址标记，该地址标记将增大它们在患病组织内相关靶受体周围的浓度。因此，又一实施方式涉及药物组合物，包括IFN类似物或靶向TOGF的偶联物以及药学上可接受的载剂。具体方面涉及药物组合物，包括靶向的IFNy类似物，优选包括靶向I3DGF的IFNy类似物，其中，靶向I3DGF的IFNy类似物与非靶向的IFNy相比表现出减少的副作用。示例性的药物组合物包含肽，该肽包括序列CSRNLIDCK (GS) mGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVH QLLPESSLRKRKRSR 或由这些序列组成，其中 m 为 I 或 2，例如 CSRNLIDCK GSGSGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKR KRSR0另一种示例性的药物组合物包括偶联物，该偶联物包括偶联到靶向域的生物活性分子，所述靶向域包括氨基酸序列CSRNLIDC-接头-CSRNLIDCS，其中所述接头为2 7个氨基酸残基，优选3 5个氨基酸残基的氨基酸序列。也提供了根据本发明的IFN(Y)类似物用于生产药剂的应用，该药剂用于治疗性或预防性治疗选自癌症、病毒性疾病、纤维化疾病、硬化疾病以及慢性或急性炎症性疾病的疾病。代表性的疾病包括肾小球硬化、间质纤维化、肺纤维化(特发性肺纤维化)、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、克罗恩斯病、溃疡性结肠炎、肾小球肾炎以及败血症。已知IFN Y也具有抗病毒活性。因为截短形式的IFN Y表现为生物活性的，并且发现显示出天然IFNy的所有的活性，假如使导归器附着到分子，则本发明的类似物也被赋予抗病毒的活性。示例性的疾病包括由流感病毒或人呼吸道合胞病毒(RSV)导致的感染。RSV为导致呼吸道感染的病毒。它是在婴儿和儿童时期较低的呼吸道感染和就诊的主要原因。有时候，即使在单个RSV季内，婴儿也可以多于一次地出现感染症状。在美国，60%的婴儿在他们的第一个RSV季被感染，并且几乎所有的儿童在2 3岁年龄时已感染该病毒。在这些感染RSV的儿童中，2% 3%的将会发展为细支气管炎，迫使住院治疗。严重的RSV感染已经越来越多地在稍老的患者中发现。没有疫苗。治疗限于支持治疗，包括氧气。在温带气候，在冬天的几个月当中存在年度流行病。在热带气候，感染在雨季期间是最常见的。因此本发明也涉及一种方法，用于治疗性或预防性治疗选自癌症、病毒性疾病、纤维化疾病、硬化疾病以及慢性或急性炎症性疾病的疾病，例如肾小球硬化、间质纤维化、肺纤维化(特发性肺纤维化)、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、克罗恩斯病、溃疡性结肠炎、肾小球肾炎以及败血症，该方法包括向需要的受试者给药治疗有效剂量的根据本发明的IFN类似物。该疾病可以是肝疾病，优选慢性肝疾病，例如肝硬化。本领域内技术人员将会根据给药发生的受试者的施用方式、身高、体重、健康状态等调整施用的剂量。给药能够以任何本身已为人所知的药剂给药方式发生。根据本发明的IFNy类似物有利地用于肺内传输形式的医药组合物(治疗性或预防性)，例如鼻内给药或吸入。也提供了包括一种吸入装置，包括IFN Y类似物作为活性组分。
图I :来自小鼠的模拟IFN Y的克隆。用PHA刺激脾细胞并且分离RNA。利用特异性引物进行RT和PCR生成期望大小的PCR产物。在BL21细胞中的结构的表达和Western印迹证实了模拟物的产生。图2 :重组的模拟IFN Y在小鼠3T3成纤维细胞中表现出抗纤维化效应。细胞被 染色以显示纤维化标记α-平滑肌肌动蛋白。图3 :编码双环PDGF-受体靶向域的pET39b_BiPPB的构建。图4 :编码靶向PDGFR的IFN Y偶联物的pET39b_BiPPB_IFN Y的构建。图5 :pET39b-BiPPB_ 模拟 IFN Y 的构建。图6 :示出pPB-肽与IFN Y偶合的IFN y -BiPPB以及模拟IFN y -BiPPB的斑点杂交分析。图7 :人肝脏星状细胞系LX2细胞的结合研究。细胞被染色以显示TOGFR-结合肽。染色表明包含PPB的结构与靶细胞的结合。图8 :血细胞计数分析以研究急性肝损伤小鼠模型中治疗的副作用。WBC =白血细胞计数。LYM=淋巴细胞。PLT=血小板计数。RBC=红血细胞计数。具体参见实施例4。图9 :肝纤维化标记MMP13和 ΜΡ1的实时定量PCR分析。具体参见实施例4。图10 :模拟IFN-PEG-BiPPB在急性CCl4诱导的肝损伤小鼠模型中的效果。a -SMA(A)、胶原蛋白-I⑶以及肌间线蛋白(C)的定量-从只接受IFN Y、模拟IFN Y、模拟IFNy-PEG、模拟IFN Y-PEG-BiPPB (5 μ g/小鼠)或PBS的橄榄油处理过的正常小鼠中以及CCl4处理过的小鼠中获得的肝切片的染色。利用计算机化的细胞-D成像软件完成定量。数据代表每组5只小鼠的平均值土SEM。相对于PBS治疗的橄榄油组，#P < O. 05 ;相对于PBS治疗的CCl4组，*P < O. 05，料P < O. 01。具体参见实施例6。图11 :服用CCl4或橄榄油3天后，小鼠肝纤维化的标记的实时定量PCR分析。小鼠用所指出的不同的化合物治疗，并且测量了胶原蛋白Ial (A)、a-SMA(B)、肌间线蛋白(C)以及TIMPl⑶的mRNA的水平。具体参见实施例6。图12 :服用CCl4或橄榄油3天后，小鼠全血中的血细胞计数分析。小鼠用所指出的不同的化合物治疗，并且使用库特尔计数器测量了血小板计数(PLT :图A)、白血细胞计数(WBC，图B)、淋巴细胞计数(C)。具体参见实施例6。
具体实施方式
肝纤维化的特征在于导致肝脏瘢痕的细胞外基质组分的过度蓄积。到目前为止，对于肝纤维化的治疗没有可用的成功的治疗方法。肝脏星状细胞(HSC)和成纤维细胞是参与该疾病的进展的关键的效应细胞，其由重要的生长因子例如血小板衍生生长因子(TOGF)和转化生长因子-β (TGFii)激活。干扰素Y (IFNy)在肝纤维化过程中已经表现出各种有益的体外以及体内效应。然而，IFNy显示出严格的种属特异性，并且具有短的循环半衰期，这限制了它潜在的临床应用。而且，IFNy对免疫系统、内皮细胞以及中枢神经系统具有严重的不利作用(例如，导致抑郁)，这些都导致患者频繁地从临床试验中退出，进而导致这些试验的失败。为了克服这些缺点，本发明人制备了一种稳定的IFNy的肽模拟物，其缺乏细胞外受体识别位点，并且包含直接与下游的IFNy信号传导过程相互作用的信号传导部分，因此保持了 IFNy的所希望的功能。为了提高IFN Y以及IFN Y模拟肽的特异性，IFNy以及IFN Y模拟肽稠合到 BiPPB(对抗 F1DGF-P-受体的双环妝，Bicyclic Peptide against thePDGF-Beta-receptor)，因为TOGF受体表达在肝损伤特别是HSC过程中大幅上调。
实施例I :模拟IFNy的克隆将小鼠脾细胞从新鲜的脾中分离，并且在PHA (植物血球凝集素)存在下培养以刺激细胞因子的产生。刺激24小时后，分离出RNA，并且利用基因特异性反向引物合成cDNA，之后利用模拟IFNy特异性正向和反向引物由phusion DNA聚合酶进行PCR扩增。将得到的片段克隆在pET42a(原核表达载体)的PshAl/EcoRI位点处，并且通过限制性内切分析检验阳性克隆。参见图I。截短的小鼠干扰素Y (NCBI 参照序列NM_008337. 2) (nt457_nt572)的 5' —3'核苷酸序列如下457gcca agtttgaggt caacaaccca caggtccagc gccaagcatt caatgagctcatccgagtgg tccaccagct gttgccggaa tccagcctca ggaagcggaa aaggagtcgc tg 572a为了在序列的最后一个氨基酸半胱氨酸前插入终止密码子，已加入最后一个核苷酸。从序列中除去半胱氨酸以提供合适的肽折叠，并且也为了避免由于融合肽(与BiPPB)中的二硫醚键导致的不适合的折叠。经编码的氨基酸序列为AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRK RKRSR*。*表示终止密码子IFN Y -BiPPB 以及模拟 IFN y -BiPPB 的克隆编码双环I3DGF靶向域BiPPB的核酸序列通过利用4个引物扩增两个片段(每个片段两个引物)生成，然后利用内嵌的Bam HI限制性位点连接，然后克隆在pET39b载体的Scal/Notl位点处。IFNy以及模拟IFNy利用肽融合引物(正向)以及IFNy或模拟IFN Y反向引物进行PCR扩增。扩增的片断经消化、且连接在pET39b-BiPPB载体的NotI/XhoI位点处，并且通过限制性内切分析检验阳性克隆。参见图4和图5。所有结构的序列进一步通过自动化DNA测序证实。BiPPBBiPPB 的核苷酸序列tgt tct aga aac ctc ate gat tgt aag gga tcc gga ggttgt tea cgt aat cta ata gat tgt teaBiPPB 的氨基酸序列 CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS (也参见图 3)
干扰素Y (全长)核苷酸序列小鼠干扰素Y (NCBI参照序列NM_008337. 3)gcggccgca457gcca agtttgaggt caacaaccca48lcaggtccagc gccaagcattcaatgagctc atccgagtgg tccaccagct gttgccggaa54Itccagcctca ggaagcggaaaaggagtcg569ataa小鼠IFNy的氨基酸序列MNATHCILALQLFLMAVSGCYCHGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLF LDIffRNWQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFS NSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC融合蛋白质(BiPPB-IFNy)的核苷酸序列 tgt tct aga aac ctc ate gat tgt aag gga tcc gga ggt tgt tea cgt aat ctaata gat tgt tea gcggccgca 干扰素 Y 序列(ΝΜ_008337· 3)。BiPPB-IFN Y的氨基酸序列CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCSAAAMNATHCILALQLFLMAVSGCYCH GTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDGDMKILQSQIISFYLR LFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFSNSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQ AFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC斜体表示BiPPB ;普通的文本表示IFNy模拟物；粗体表示接头或间隔区。也参见图4。融合到BiPPB的模拟干扰素Y融合蛋白质(BiPPB-IFNY模拟物)的核苷酸序列tgt tct aga aac ctc ate gat tgt aag gga tcc gga ggt tgt tea cgtaat cta ata gat tgt tea gcggccgca457gcca agtttgaggt caacaaccca caggtccagcgccaagcatt caatgagctc atccgagtgg tccaccagct gttgccggaa tccagcctca ggaagcggaaaaggagtcg569ataaBiPPB-IFN y模拟物的氨基酸序列CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVH QLLPESSLRKRKRSR斜体表示BiPPB ;普通的文本表示IFNy模拟物；粗体表示接头或间隔区。也参见图5。然后将该核酸转化进BL21细胞(大肠杆菌)以利用IPTG诱导进行表达。表达的蛋白质利用抗-IFN Y抗体和/或抗-PPB抗体通过SDS-PAGE以及Western印迹分析或斑点杂交分析进行分析(参见图6)。表达的蛋白质(具有His标签)然后在天然条件下通过Ni-NTA柱色谱纯化。标签被蛋白质水解切割并且利用琼脂糖柱色谱进一步纯化。实施例2 :切割的活性模拟IFN Y的抗-纤维化效果我们评估了切割的IFN Y模拟肽在小鼠NIH3T3成纤维细胞中的抗纤维化效果，如通过免疫细胞化学(a-SMA染色)来评定。简单地说，以6Χ104个细胞/孔的密度将3Τ3成纤维细胞接种在24孔培养板中，24个小时后，细胞在包含O. 5%的FBS的培养基中饥饿培养过夜。此后，细胞在具有不同化合物(PDGF 50ng/ml、TGF β 10ng/ml、模拟IFN Y I μ g/ml、50ng/ml PDGF+1 μ g/ml 模拟 IFN y 以及 10ng/ml TGF β+1 μ g/ml 模拟 IFN y )的饥饿培养基中培养。培养48个小时之后，清洗细胞，用乙醇丙酮(I : I)固定并且对a-SMA (活化的成纤维细胞的标记)进行染色。实施例3 =BiPPB和模拟IFN Y-BiPPB在人LX2细胞中的结合研究我们测定了 BiPPB和模拟IFN Y-BiPPB在LX2细胞(人HSC)中的结合。简单的说，以3 X IO4个细胞/孔的细胞密度将LX2细胞铺在48孔培养板中。24小时后，细胞在培养基(-FBS)中饥饿培养过 夜。然后细胞用不同的化合物在室温下培养两小时以结合。结合之后，用PBS完全地清洗细胞，用乙醇丙酮(I I)固定，并且对PPB进行染色。结果显不在图7中。实施例4 :在小鼠的急性CCl4诱导的肝损伤中的体内效果研究检测了重组IFNy、模拟IFNy、重组融合蛋白质IFNy-BiPPB以及重组融合蛋白质模拟IFN Y-BiPPB在急性CCl4S导的肝损伤小鼠模型中的抗-纤维化效果。在第一天，给动物们提供一腹腔内剂量(lml/kg)的橄榄油中的四氯化碳(CCl4)或橄榄油(对照η = 6)。注射CC1424个小时后，在第二天和第三天，动物们用PBS(n = 6)、50000U/小鼠的IFNy (η=6)、50000U/小鼠的模拟 IFNy (η = 5)、50000U/小鼠的 IFNy-BiPPB (η = 6)、50000U/小鼠的模拟IFN Y-BiPPB (η = 6)进行处理。此后，在第四天，动物们被处死，并且进行血细胞计数和利用定量PCR评估抗-纤维化效果(参见Hemmann S, Graf J, Roderfeld M, Roeb.J H印atol. 2007，五月，46 (5) :955-75)。结果显示在图8和图9中。图8中显示的数据说明在减弱与CCl4S导的肝纤维化(P <0.01)相关的全血中的白血细胞计数(WBC)以及淋巴细胞计数(Iym)的上调方面，模拟-BiPPB比未改变的IFNy更有效。相反，当动物们接受模拟IFN Y-BiPPB而不是IFNy (P < 0.0025)时，与IFNy处理相关的血小板计数的减少较不严重(这是INF Y的公知的不利作用)。图9中显示的数据表明模拟-IFN Y -BiPPB被赋予抗纤维化活性它减弱CCl4诱导的基质金属蛋白酶类(MMP13)的上调。MMP13与金属蛋白酶组织抑制因子(TIPMl)的比值与用天然IFNy获得的比值相近，但是比模拟IFNy (P < O. 03)更好，表明BiPPB向模拟IFN Y的偶合是有益的。总体上，图8和图9中的数据表明模拟IFN y -BiPPB与天然IFN Y相比较效果更强，并且具有较少的副作用。实施例5 :模拟干扰素Y偶联物的化学合成樽拟IFN Y -PEG-BiPPB 偶联物0. 111 μ mol 双环 PDGFR 识别肽(BiPPB，2223. 2Da，Genosphere生物科技)与O. 337 μ mol的马来酰亚胺-PEG-琥拍酰亚胺基羧基甲酯(Mal-PEG-SCM, 2KDa, Creative PEGworks)偶合 3 个小时。此后，将赖氨酸(0·337μπιο1)加到Mal-PEG-SCM的不含嵌段的基团(block free group)中。反应一个小时后,合成的产物BiPPB-PEG-MAL (0. 112 μ mol)与 0. 56 μ mol 的模拟 IFN y -ATA (4689Da, Genosphere 生物科技)在去乙酰基试剂存在下于室温下反应过夜。最后，合成的模拟IFN Y-PEG-BiPPB偶联物利用7KDa的slide-a-lyzer G2透析盒(赛默科技)用PBS进行完全透析。樽拟IFN Y -PEG 偶联物0. 107 μ mol 的模拟 IFN y -ATA (4689Da)与 0. 321 μ mol 的聚(乙二醇)-琥拍酰亚胺基-α - 丁酸甲酯(mPEG-SMB, 2KDa, Nektar therapeutics)反应两小时，并且接下来对产物进行完全透析。a)模拟 IFN Y -PEG-BiPPB
权利要求
1.一种干扰素Y (IFNy)的类似物，其中，介导结合到所述干扰素Y的天然受体的部分至少被功能性破坏，并且其中所述类似物包括能够介导细胞内IFNy活性的信号传导部分，所述信号传导部分可选地通过接头被设置在所述干扰素Y的N-端，具有能够结合到不同于所述IFNy受体的细胞表面受体的至少一个靶向域。
2.根据权利要求I所述的类似物，其中，介导细胞内活性的所述信号传导部分包括多元核定位信号(NLS)基序。
3.根据权利要求2所述的类似物，其中，所述多元NLS基序包括氨基酸序列(R)KRXRS (R)，其中，X为任何氨基酸残基；优选(R) KRXRS (R)，其中X为R、K、S或T。
4.根据前述任一项权利要求所述的类似物，其中，所述信号传导部分包括选自由以下氨基酸序列组成的组中的序列(a)氨基酸序列KFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR ；(b)氨基酸序列YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRTRSQ ；(c)氨基酸序列AKFEVNNPQIQHKAVNELIRVIHQLSPESSLRKRKRSRC ； (d)(a)、(b)或(c)的所述序列的至少10个、优选至少15个邻接氨基酸的延伸物； (e)表现出与(a)或(b)或(C)至少70%、优选至少80%、更优选至少90%的同一'生的氨基酸序列，前提是细胞内信号传导活性得以保持；以及 (f)(a)或(b)或(C)的氨基酸序列，其中至多10个、优选至多8个、更优选至多5个氨基酸残基被缺失、添加或取代，前提是所述信号传导活性例如核易位得以保持。
(g)共有序列VxxxxVQRxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRxRS,其中x为任何氨基酸残基； (h)共有序列VxxxxxQxxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRKRS,其中x为任何氨基酸残基；以及(i)共有序列Vxxx [Q/N] [F/V/I]Q[R/H] [Q/K]A[F/V/I] [N/H]ELI [R/Q]Vx[H/A] [Q/E]L[L/S]P[E/A] [S/A] [S/A] [L/K]xxKRKRS，其中 x 为任何氨基酸残基。
5.根据权利要求4所述的类似物，包括根据序列Xaa1 Xaa2Xaa3Xaa4VaI Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9GIn Xaa10Xaa11Ala Xaa12Xaa13Glu Leu He Xaa14Val Xaa15Xaa16Xaa17Leu Xaa18Pro Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Lys Arg Lys Arg Ser Xaa24Xaa25 的信号传导部分,其中Xaa1 > Xaa2 > Xaa3Xaa4Xaa6Xaa11、Xaa13、Xaa14 > Xaa16Xaa1' Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24以及Xaa25为任何氨基酸残基； Xaa5为极性的、不带电荷的残基，例如Asn或Thr ； Xaa7为非极性的、疏水性的残基，例如Pro或Leu ； Xaa8为极性的、不带电荷的残基，例如Gln或Asn ； Xaa9为非极性的、疏水性的残基，例如Val、Ile或Leu ； Xaa10为极性的、碱性残基,例如Arg、His或Lys ； Xaa12为非极性的、疏水性的残基，例如Phe、Val或Ile ； Xaa15为非极性的、疏水性的残基，例如Val、lie、Met。
6.根据前述任一项权利要求所述的类似物，其中，所述靶向域能够结合到成纤维细胞和成纤维细胞样细胞，优选成肌纤维细胞、肝门成纤维细胞、系膜细胞、间质成纤维细胞、肺泡成纤维细胞和/或基质细胞特异的受体。
7.根据前述任一项权利要求所述的类似物，其中，所述靶向域能够结合到低聚糖或糖蛋白的受体，优选甘露糖-6-磷酸盐/胰岛素样生长因子-II受体(M6P/IGF2R)、脱唾液酸糖蛋白(ASGP)受体或甘露糖受体(CD 206)。
8.根据权利要求7所述的类似物，其中，所述靶向域为偶联到载剂分子的低聚糖，优选甘露糖(-6-磷酸盐)或乳糖。
9.根据权利要求I 6中任一项所述的类似物，其中，所述受体选自由I3DGF受体、胶原蛋白VI型受体以及细胞因子受体组成的组,所述细胞因子受体包括TGFP受体、TNFa受体、胰岛素生长因子受体、VEGF受体、趋化因子受体以及ILlP受体。
10.根据权利要求9所述的类似物，其中，所述受体为所述TOGF受体，优选为TOGFii受体。
11.根据前述任一项权利要求所述的类似物，其中，所述靶向域包括至少一个环肽部分。
12.根据任何权利要求11所述的类似物，其中，所述靶向域包括环肽部分的至少一个串联重复部分，优选相同的环肽部分。
13.根据权利要求11所述的类似物，其中，串联重复部分中的两个环肽部分通过2 7个氨基酸接头连接。
14.根据权利要求13所述的类似物，其中，所述接头选自由⑴序列K(GS)mGG以及( )通式[GnDJ的序列组成的组，其中，K (GS)mGG中m为I或2 ;通式[GnDj中n+m为4至7，其中η彡4，并且M为O和3之间的整数。
15.根据前述任一项权利要求所述的类似物，其中，所述靶向域包括至少一个氨基酸序列 RGD、KPT、SRN、NLI 和 / 或 LID。
16.根据权利要求15所述的类似物，其中，所述靶向域包括氨基酸序列CSRNLIDC-接头-CSRNLIDCS，其中，所述接头为3 7个、优选为4 5个氨基酸残基的氨基酸序列。
17.—种包括偶联到靶向域的兴趣化合物的偶联物，所述靶向域包括氨基酸序列X1SRNLIdX2-接头-X3SRNLIdX4，其中，X1和X2对以及X3和X4对能够形成键，优选形成肽键，从而形成双环结构，其中所述序列SRNLID为环的每部分，并且其中所述接头为2 7个、优选为3 5个氨基酸残基的氨基酸序列。
18.根据前述任一项权利要求所述的类似物或偶联物，设置有至少一个无抗原性的聚合物，优选选自由聚乙二醇及其衍生物组成的组。
19.一种分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码根据前述任一项权利要求所述的蛋白质的类似物或偶联物。
20.一种表达载体，包括根据权利要求19所述的分离的核酸序列。
21.一种宿主细胞，包括根据权利要求18所述的核酸序列或根据权利要求20所述的载体，优选地，其中所述宿主细胞为细菌或哺乳动物宿主细胞。
22.—种药物组合物，包括根据权利要求I 18中任一项所述的类似物或偶联物，以及药学上可接受的载剂、佐剂和/或赋性剂。
23.根据权利要求I 18中任一项所述的类似物或偶联物用于生产药剂的应用，所述药剂用于治疗性或预防性治疗选自癌症、病毒性疾病、纤维化疾病、硬化疾病、以及慢性或急性炎症性疾病的疾病。
24.根据权利要求I 18中任一项所述的类似物或偶联物，用于治疗性或预防性治疗选自癌症、病毒性疾病、纤维化疾病、硬化疾病以及慢性或急性炎症性疾病的疾病。
25.根据权利要求24所述的类似物或偶联物，用于治疗肝疾病，优选慢性肝疾病，例如肝硬化。
26.根据权利要求24所述的类似物或偶联物，用于治疗病毒性疾病，优选由流感病毒或呼吸道合胞病毒(RSV)导致的疾病。
27.一种用于治疗性或预防性治疗选自癌症、病毒性疾病、纤维化疾病、硬化疾病以及慢性或急性炎症性疾病的疾病的方法，所述方法包括向需要的受试者给药有效剂量的根据权利要求I 18中任一项所述的类似物或偶联物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述疾病选自由肾小球硬化、间质纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、克罗恩斯疾病、溃疡性结肠炎、肾小球肾炎以及败血症组成的组，优选地，其中所述疾病为肝疾病，更优选为慢性肝疾病，例如肝硬化。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述给药包括粘膜给药，优选肺内给药。
全文摘要
本发明涉及医药领域。本发明尤其涉及干扰素(IFN)的生物活性类似物及其医疗用途，所述类似物表现出较少的不期望的副作用。提供了一种IFN类似物，其中，介导结合到它的天然受体的部分至少被功能性破坏，并且其中所述类似物包括能够介导细胞内IFN活性的信号传导部分，所述信号传导部分可选地通过接头被提供在所述类似物的N-端，具有能结合到不同于IFN受体的细胞表面受体的至少一个靶向域。
文档编号A61P31/12GK102917726SQ201080062942
公开日2013年2月6日 申请日期2010年12月30日 优先权日2009年12月31日
发明者克拉斯·普尔斯特拉, J·普拉卡什, E·贝尔雅斯, R·班赛尔 申请人:毕欧丽安技术有限公司