专利名称：人工合成鸡干扰素基因序列及其重组工程菌的构建与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物程领域，特别是涉及人工合成的鸡干扰素基因序列，一种以酿酒酵母作为受体菌而得到的重组工程菌，其能进行胞内表达生产动物干扰素。
背景技术：
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种良好的营养与保健饲料添加剂，其营养丰富，富含B族维生素、矿物质、消化酶、促生长因子和较齐全的氨基酸。使用酵母添加剂可以提高饲料蛋白含量，刺激有益菌生长，提高机体免疫力，促进营养物质消化吸收和动物生长发育。同时，酿酒酵母也是最早用于基因工程的酵母菌株，是真核生物生物学研究的模式生物，其表达蛋白能有效保持生物学活性，利用酿酒酵母表达系统，人类已经获得一些重要药用蛋白。鸡α干扰素(ChIFN-α)和鸡Υ干扰素(ChIFN-γ )具有高效广谱的抗病毒、免疫调节、抗肿瘤细胞增殖、提高抗逆性和促进生长等多种重要生理功用，是养禽业用来防治鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、传染性法氏囊、减蛋综合征等多种鸡病毒性传染病的重要药物。尽管干扰素的临床价值极高，但是目前因生产的高昂成本却制约着其在畜牧业中的广泛应用。
发明内容
针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种人工合成的鸡干扰素基因序列，并提供以酿酒酵母作为受体菌而得到的重组工程菌，利用酿酒酵母作为受体菌胞内表达鸡干扰素，酵母发酵产量大，产物不需分离纯化，直接饲喂含有鸡干扰素的酵母饲料重组菌株，可以实现畜牧业中干扰素的低成本供给问题，在提供鸡体营养物质的同时达到提高其免疫力的目的，避免了疫苗注射等繁琐管理和饲喂抗生素等药物带来的畜产品药物残留问题。一种人工合成的鸡干扰素基因YEChlFNR，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。一种人工合成的鸡干扰素基因YEChlFNG，其核苷酸序列如SEQ ID N02所示。一种重组表达载体，具有上述人工合成的鸡干扰素基因YEChlFNR，或YEChlFNG， 其骨架载体为PYES2/CT。一种重组工程菌，具有上述人工合成的鸡干扰素基因YEChlFNR，或YEChlFNG，所述受体菌为酿酒酵母菌株INVScl。上述重组工程菌生产药用蛋白鸡干扰素的方法，包括如下步骤(1)、酵母菌的培养保种的重组工程菌接种于SC选择培养基上，于30°C，200r/ min过夜震荡培养；(2)、酵母菌的诱导表达培养当过夜培养的新鲜菌液OD6tltl = 0. 3-0. 5时，离心收集菌体并用含半乳糖的液体诱导培养基重悬，并于30°C、200r/min振荡培养。所述诱导培养的条件为诱导12h，重组菌液发酵pH值为3. 8-4. 0,2. 5%的半乳糖浓度。
所述步骤还包括保种的重组工程菌的制备方法，将重组工程菌在YPD筛选培养基培养，菌落PCR筛选，挑取阳性克隆单菌落，SC选择培养基，30°C振荡过夜培养保种。所述步骤还包括菌体 细胞的裂解，所述步骤(2)的酵母菌培养到对数生长期时， 取出转速1500rpm/min离心5min收集菌体，灭菌水重悬菌体细胞之后，10000r/min离心 30s，得菌体细胞用裂解缓冲液重悬。所述菌体细胞裂解前液氮冷冻后置-80°C保存备用，裂解缓冲液重悬的0D_ = 50-100。所述SC选择培养基为0. 8% Ura缺陷培养基粉+2%葡萄糖；所述YPD筛选培养基为2%胰蛋白胨+1%酵母提取物，2%葡萄糖+60mg/l Amp (氨苄青霉素)；所述诱导培养基为0. 8% Ura(尿嘧啶)缺陷培养基粉+2%半乳糖+1%棉子糖或者2%葡萄糖。本研究通过构建鸡干扰素基因ChIFN的酿酒酵母表达载体，并通过电击法将其转化酵母菌株INVScl，对重组菌株的pH值、诱导时间和诱导剂浓度等诱导条件进行优化，并对重组蛋白及其生物学活性进行进检测和分析，证明功能基因已在受体菌中获得正确翻译表达，重组ChIFN-α和ChIFN-Y蛋白具有抗病毒活性，为开发具有抗病功能的饲料微生物添加剂奠定了基础。本研究对探索禽流感等病毒性疾病的防治新途径和保证家禽的安全生产具有积极的意义。本发明通过酿酒酵母生物反应器表达生产动物药用蛋白，极大地降低生产成本， 在给动物提供优质蛋白的同时提高机体免疫力。本发明的总体的技术方案包括下列步骤A、表达载体构建对目的基因进行核苷酸密码子偏好性改造，利用基因直接合成方法，获得待表达蛋白质编码基因片段，将得到的基因片段克隆到表达质粒中，鉴定后通过电击法转入酿酒酵母菌株。B、表达质粒及重组菌株鉴定分别利用PCR、酶切、测序和表型诱导筛选，进行构建质粒和重组菌株的筛选鉴定。C、重组蛋白检测使用SDS-PAGE和ELISA检测重组蛋白及其表达量。D、酵母菌的培养保种的基因工程酵母菌株接种于SC选择培养基上，于30°C倒置培养至单菌落长出后，挑取活化后的单菌落于YPD酵母菌完全液体培养基中过夜培养。E、酵母菌的诱导表达培养当过夜培养的新鲜菌液OD6tltl = 0. 4时，1500*g离心 5min，收集菌体并用同样体积的含半乳糖诱导剂的液体诱导培养基重悬，并于30°C、200r/ min振荡培养。F、诱导时间确定新鲜菌液在添加诱导剂后的不同时间点分别测定重组蛋白数量，确定半乳糖添加量。G、发酵pH值的确定新鲜菌液在添加诱导剂后的不同时间点分别测定菌液的pH 值，并检测重组蛋白数量，确定重组酵母发酵的最适pH。H、诱导剂添加量的优化新鲜菌液在添加诱导剂后的不同时间点分别测定重组蛋白数量，确定半乳糖添加量。I、重组蛋白活性检测使用CPE试验和利用IBDV-CEF系统检测重组鸡干扰素的抗
病毒活性。本发明通过电击法将经过改造的鸡干扰素编码基因ChIFN- α和ChIFN- γ导入饲料酿酒酵母菌株中，使其能够作为生物反应器生产药用蛋白鸡干扰素。发明人利用INVScl 酿酒酵母菌株作为受体菌，经基因工程改造后得到鸡干扰素重组基因工程菌株，经PCR、酶切鉴定、测序、SDS-PAGE、ELISA和CPE检测，结果表明ChIFN_a和ChIFN-γ基因整合到受体菌染色体基因组中，并得到正确的翻译表达，重组菌株成功表达具有生物学活性的ChIFN 蛋白。酵母微生物发酵容易，产量大，自身具有营养和保健价值，与现有生产技术相比较，本发明将酿酒酵母作为生物反应器生产鸡干扰素药用蛋白，不仅可以极大降低干扰素生产成本，而且可以在提供优质蛋白的同时达到改善机体免疫功能的目的。
图1为酵母表达载体pYE-IFNR的物理图谱，利用氨苄青霉素(Amp)基因和 URA3 (尿嘧啶合成酶)营养缺陷标记基因和作为筛选和标记基因。图2酵母表达载体pYE-IFNG的物理图谱，利用氨苄青霉素(Amp)基因和URA3 (尿嘧啶合成酶)营养缺陷标记基因和作为筛选和标记基因。图3为YEChIFNR基因的菌落PCR检测，PCR扩增获得的条带大小为582，与目标片段大小一致。其中M为DL2000DNA marker, 1-5为不同Amp抗性菌株。图4为重组质粒pYE-IFNR酶切鉴定，使用Xho I/Kpn I双酶切pYE_IFNR质粒后， 得到的片段与目标片段大小一致。其中M为DNA marker，1-8为不同样品。图5为YEChIFNG基因的菌落PCR检测，PCR扩增获得的条带大小为459，与目标片段大小一致。其中M1和M2为DNA marker, 1-16为不同Amp抗性菌株。图6为重组质粒pYE-IFNg酶切鉴定，使用Xho I/Kpn I双酶切pYE-IFNR质粒后， 得到的片段与目标片段大小一致。其中M为DNA marker，1-4为不同样品。图7为YEChIFNR基因测序图谱，与设计合成的序列一致。图8为YEChIFNG基因测序图谱，与设计合成的序列一致。图9为重组ChIFN的诱导表达SDS-PAGE电泳图，其中M 标准分子量蛋白，1_4为不同重组菌株，表达蛋白分子量约在29-44kDa之间。图10为重组ChIFN-α的含量检测，利用ELISA技术对不同转化菌株中重组 ChIFN-α的含量进行检测，y轴为A450吸光值读数，χ轴为13株不同转化菌株。图11为重组ChIFN-Y的含量检测，利用ELISA技术对不同转化菌株中重组 ChIFN-α的含量进行检测，y轴为A450吸光值读数，χ轴为13株不同转化菌株。图12为不同诱导时间的重组ChIFN-α蛋白含量，利用ELISA技术对诱导剂处理不同时间的重组ChIFN-α的含量进行检测。图13为重组菌株发酵pH值检测图，利用ELISA技术对获得最高表达量的表达蛋白进行检测，判断最适pH在3. 9左右。 图14为不同诱导剂浓度诱导获得的重组蛋白SDS-PAGE电泳图，其中M为标准分子量蛋白，1为不携带质粒的对照菌株；2-6分别半乳糖浓度1%、1.5%、2%、2.5%和3%。图15为重组ChINF- α对IBDV攻毒的CEF细胞抑制观察显微图片，其中a为阳性对照，b为阴性对照，c为10_6稀释，d为10_5稀释。图16为重组ChINF- γ对IBDV攻毒的CEF细胞抑制观察显微图片，其中a为阳性对照，b为阴性对照，C为10_5稀释，d为10_4稀释。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。SC选择培养基为0. 8% Ura缺陷培养基粉，2%葡萄糖YPD筛选培养基为2%胰蛋白胨，酵母提取物，2%葡萄糖(固体培养基加2% 的琼脂粉)，60mg/l Amp。诱导培养基为0. 8% Ura缺陷培养基粉，2%半乳糖，棉子糖；或者0.8% Ura缺陷培养基粉，2%半乳糖，2%葡萄糖(一 )材料和方法1.质粒和菌株酿酒酵母表达质粒pYES2/CT和酿酒酵母菌菌株INVScl均购自Invitrogen公司； 大肠杆菌菌株DH5ci为贵州省农业生物工程重点实验室保存，为通用菌株，可以对公众发放。2.酿酒酵母表达载体构建根据NCBI 登录的干扰素基因 ChIFN- α (GenBank accession No. U07868)和 ChIFN- y (GenBank accession No. U27465)的序列和酿酒酵母偏好性密码子(http://www. kazusa. or. jp/codon/)进行核酸序列改造，设计合成YEChIFNR和YEChIFNG基因，序列中添加KpnI和XhoI限制性酶切位点及保护碱基。设计并合成以下全长引物Pyee L :5，-ATGGCTGTTCCAGCTTCTCCAC-3，Pyee R :5，-TCAAGTTCTAGTGTTACCAGTCAAGT-3，Pyeg L :5，-ATGACTTGTCAAACTTACAACTTGTTTG-3，Pyeg R 5，-TCAACAGTTACATCTTCTTTGAGATTGAG-3，使用KpnI/XhoI分别双酶切质粒pYES2/CT和PCR扩增产物，电泳回收目的基因小片段和载体质粒大片段，用T4DNA连接酶连接，构建酵母GALl启动子驱动的YEChIFNR 和YEChIFNG酵母表达载体ρYE-IFNR和pYE-IFNG。将连接产物pYE-IFNR和pYE-IFNG转化E. coli感受态细胞。用含Amp的LB培养基和菌落PCR筛选阳性克隆，提取pYE-IFNR和 pYE-IFNG质粒进行酶切和测序鉴定。酶切反应体系为XhoI 0. 5-110 μ L ；Kpn I 0. 5-110 μ L ;10XM Buffer 1-210 μ L ；质粒4-810 μ L ；最后加水至总体积10 μ L。PCR反应体系为10XPCR Buffer 2 μ L ；dNTP 1. 6 μ L ；上下游引物分别0. 5 μ L ；rTaq 0. 2 μ L ；模板DNA 0. 1 μ L ；最后加水至总体积 20 μ L。PCR 反应条件为94°C 5min, Icycle ；94°C 30sec，57°C 30sec，72°C 30sec, 30cycles ；72°C 8min, lcycle。3. GALl启动子驱动的功能蛋白基因遗传转化酵母菌株将获得的pYE-IFNR和pYE-IFNG酵母表达载体通过电击法转化酿酒酵母INVScl 菌株，YPD筛选培养基培养和菌落PCR筛选重组子INVSc 1/pYE-IFNR和INVSc 1/pYE-IFNG， 挑取阳性克隆单菌落，SC液体选择培养 基30°C振荡过夜培养保种。4.重组蛋白的诱导表达及裂解
(1)挑取转重组酵母工程菌单菌落于15mLSC选择培养基中30°C、200r/min过夜震荡培养，待OD6tltl值达0. 4时计算菌体数量，并将培养菌液于1500*g离心5min收集菌体。(2)菌体中加入诱导培养基50mL，于30°C、200r/min振荡培养，到对数生长期时， 取出转速1500rpm/min离心5min收集菌体。(3)用500 μ 1灭菌水重悬菌体细胞之后，10000r/min离心30s。(4)菌体细胞液氮冷冻后置-80°C保存备用。(5)将超低温保存的菌体细胞(1. 5ml离心沉淀物)用约500 μ 1裂解缓冲液(用量使 OD600 = 50-100)重悬。(6)加入等体积的酸洗玻璃珠(0. 4-0. 6mm)，涡旋振荡30s，冰浴30s。(7)重复4次以上裂解过程。(8) 10000r/min 离心裂解溶液 IOmin。(9)将上清移入新离心管中，冰上保存备用。5.重组蛋白的SDS-PAGE电泳检测(1)样品处理蛋白样品上样前先加入等体积的2X SDS-PAGE样品处理液，在沸水浴中煮lOmin， 10000r/min离心2min后取上清液上样。(2)制胶清洗电泳玻板将玻璃板、样品梳用洗涤剂洗净，用自来水冲洗后，再用ddH20冲洗数次，晾干。安装制胶模具打开制胶模具，先安装凹型玻板，将两块胶条放在玻板两边，再小心安装另一块矩型玻板，两块胶条、玻板保存底端对齐。胶溶液配制按下列配方分别配制10%的分离胶9mL和5%的浓缩胶3mL。灌胶将混勻的分离胶沿玻板壁缓缓加入两块玻板之间至梳子下1cm，上面覆盖一层灭菌去离子水，静置20-30min后，看到凝胶与水层之间出现明显界面时，倒掉上层的水，用滤纸吸干残留部分，将混勻的浓缩胶沿玻板壁缓缓加入在分离胶上面至低玻璃线，然后插上梳子，静置20-30min。
权利要求
1.一种人工合成的鸡干扰素基因YEChlFNR，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
2.—种人工合成的鸡干扰素基因YEChlFNG，其核苷酸序列如SEQ ID N02所示。
3.—种重组表达载体，具有权利要求1或2所述的人工合成的鸡干扰素基因 YEChIFNR,或 YEChlFNG，其骨架载体为 pYES2/CT。
4.一种重组工程菌，具有权利要求1或2所述的人工合成的鸡干扰素基因YEChlFNR， 或YEChlFNG，所述受体菌为酿酒酵母菌株INVScl。
5.权利要求4所述的重组工程菌生产药用蛋白鸡干扰素的方法，包括如下步骤(1)、酵母菌的培养保种的重组工程菌接种于SC选择培养基上，于30°c，200r/min过夜震荡培养；(2)、酵母菌的诱导表达培养当过夜培养的新鲜菌液OD6tltl= 0. 3-0. 5时，离心收集菌体并用含半乳糖的液体诱导培养基重悬，并于30°C、200r/min振荡培养。
6.根据权利要求5所述的方法，所述步骤(2)的培养条件为诱导12h，重组菌液发酵 PH值为3. 8-4.0，2. 5%的半乳糖浓度。
7.根据权利要求5所述的方法，所述步骤还包括保种的重组工程菌的制备方法，将重组工程菌在YPD筛选培养基培养，菌落PCR筛选，挑取阳性克隆单菌落，SC选择培养基，30 0C 振荡过夜培养保种。
8.根据权利要求7所述的方法，所述SC选择培养基为0.8% Ura缺陷培养基粉+2% 葡萄糖；所述YPD筛选培养基为2%胰蛋白胨+1%酵母提取物，2%葡萄糖+60mg/l Amp ； 所述诱导培养基为0. 8% Ura缺陷培养基粉+2%半乳糖+1%棉子糖或者2%葡萄糖。
9.根据权利要求5所述的方法，所述步骤还包括菌体细胞的裂解，所述步骤(2)的酵母菌培养到对数生长期时，取出转速1500rpm/min离心5min收集菌体，灭菌水重悬菌体细胞之后，10000r/min离心30s，得菌体细胞用裂解缓冲液重悬。
10.根据权利要求9所述的方法，所述菌体细胞裂解前液氮冷冻后置-80°C保存备用， 裂解缓冲液重悬的0D_ = 50-100。
全文摘要
本发明涉及“人工合成鸡干扰素基因序列及其重组工程菌的构建与应用”，属于生物技术领域。本发明对采用人工合成的序列如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2，以酿酒酵母作为宿主菌株，得到了重组工程菌，经PCR、酶切、测序、SDS-PAGE、ELISA和CPE检测结果表明ChIFN-α和ChIFN-γ基因均能在宿主菌株中胞内表达，并表达蛋白具有明显的生物学活性。实验表明，本发明将酿酒酵母作为生物反应器生产鸡干扰素药用蛋白，不仅可以极大降低干扰素生产成本，而且可以在提供优质蛋白的同时达到改善机体免疫功能的目的，为利用酵母添加剂防治动物疫病奠定基础。
文档编号C12N1/19GK102321631SQ20111025162
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者卢凌霄, 宋莉, 赵德刚 申请人:贵州大学