专利名称：表达马链球菌兽疫亚种类m蛋白的重组猪痘病毒载体疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制品领域。本发明涉及一种重组猪痘病毒载体疫苗，具体而言，涉及一种表达马链球菌兽疫亚种(SEZ)类M蛋白(SzP)的重组猪痘病毒(rSPV-SzP)载体疫苗，该疫苗能提供针对SEZ的免疫保护作用，及减少养猪业的经济损失。
背景技术：
gljli求胃·禾中(Streptococcus equi subsp zooepidemicus SEZ) 链球菌病的重要病原之一，同时也是一种重要的人畜共患病病原。其引发的猪链球菌病曾在我国华南、西南和华东等地区广泛流行，给我国养猪业造成较大的危害，猪链球菌病也是严重危害世界养猪业的一种重要的细菌性传染病，并可引起人类的感染。类 M 蛋白(M_Like Protein)是马链球菌兽疫亚种(Sti^ptococcus equi subsp zooepidemicus SEZ)细胞壁表面一种纤丝状表面蛋白，是该菌重要的毒力因子和保护性抗原(Timoney J F，Walker J，Zhou M，et al. Cloning and sequence analysis of a protective M-Iike gene from streptococcus equi subsp. Zooepidemicus. Infect， Immune，1995，63 :1440-1445)。马链球菌兽疫亚种类M蛋白(SzP)高度抗酸，具有多种生物学功會邑(Timoney JFiArliushin SC,Boschwitz JS. Comparison of the sequences and functions of Streptococcus equi M-Iike protein Sem and SzPse. Infect Immun,1997, 65(9) :3600 3605)。其表面有调理素表位，能剌激机体产生抗调理素抗体(Timoney JF， Mukhtar M. Varability in the M proteins of the equine strains of Streptococcus equi subsp zooepidemicus，P. 15 20In W. PlowrightiP D Rossdale,and J F Wade(ed)， Equine Infectious diseases VI， Cambridge 1991， R&W Publications， Newmarket, Englmd)；能抑制补体C3b在菌体表面沉积，从而抑制机体补体系统的活化(Boschwitz JS, Timoney JF. Inhibition of C3 deposition of Streptococcus equi by M protein a mechanism for survival in equine blood. Infect Immun,1994，62 :3515 3520)； 能结合机体的纤维蛋白原，使其具有抗吞噬细胞的吞噬活性(Boschwitz JS，Timoney JF. Characterization of the antiphagocytic activity of equine fibrinogen for Streptococcus, zooepidemicus. Microb Pathog，1994，17 :121 129)。类 M 蛋白与 SEZ 致病性和机体的免疫保护作用密切相关，一直是研制链球菌疫苗的焦点。重组痘病毒载体疫苗已经有近30年的安全应用，作为表达载体，痘病毒有许多特有的优点(1)冻干疫苗较稳定、费用低、容易进行生产和使用。(2)疫苗有多种用药途径， 包括口服，尤其是针对野生动物进行免疫预防时。(3)痘病毒作为基因重组活疫苗的载体， 不需佐剂即可免疫动物，病毒在体内增殖过程中产生的外源蛋白可刺激机体产生免疫应答，不仅诱导机体产生体液免疫，而且诱导很强的细胞免疫。接种一次就能获得长期的免疫效果，能诱导抗外来抗原的抗体和细胞毒性T细胞反应。(4)基因组容易组装，允许大片段的基因丢失或删除，以及外源DNA的插入.(5)重组痘病毒疫苗能区分天然感染和接种的动物并与之兼容。(6)与其它哺乳动物病毒表达载体相比，被表达的外源蛋白在感染细胞中能
3忠实地进行修饰具有较高的表达效率。通过对动物接种重组痘病毒的办法，能了解外源蛋白对个体的作用以及机体的免疫应答。应用重组痘病毒已经成功地表达了来源于动植物，乃至人类的许多种基因。表达抗原基因的重组痘病毒作为基因重组疫苗。目前用作表达载体的痘病毒主要有痘苗病毒、禽痘病毒、山羊痘病毒等。使用猪痘病毒作为载体构建重组疫苗迄今尚无成功报道，更无利用重组猪痘病毒载体表达马链球菌兽疫亚种类M蛋白基因的重组疫苗的相关报道。
发明内容
本发明的目的是研制一种能够有效控制猪链球菌病的重组疫苗。一方面，本发明提供了一种重组猪痘病毒(rSPV-SzP)，该重组猪痘病毒是在猪痘病毒载体中插入本发明所述SzP基因重组制备得到的。在优选的实施方案中，本发明所述SzP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。本发明通过动物免疫试验发现本发明提供的重组猪痘病毒能够在免疫动物体内大量增殖，表达目的蛋白SzP，能够诱导动物体内产生较高效价的抗体，并对免疫动物产生良好的保护作用因此，另一方面，本发明提供了一种疫苗组合物，其中含有本发明所述的重组猪痘病毒和一种或多种药物学上可接受的载体或佐剂。该重组猪痘病毒包含猪痘病毒载体和本发明所述的SzP基因。在一个优选实施方案中，所述的SzP基因具有如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。在一个优选实施方案中，所述的猪痘病毒载体为VR-363。另一方面，本发明提供了本发明所述的重组猪痘病毒及含有其的疫苗组合物在制备预防和/或治疗马链球菌兽医亚种引发的疾病的药物中的用途，优选用于制备预防和/ 或治疗马链球菌兽医亚种引发的猪链球菌病的药物中的用途。本发明所述联合免疫的接种途径包括但不限于肌肉注射等。另一方面，本发明提供了一种制备重组猪痘病毒的方法，该方法包括(1)利用特异性引物对扩增马链球菌兽疫亚种(SEZ)类M蛋白(SzP)的编码基因；(2)把SzP基因克隆入穿梭载体pUSZll/P28M中，然后通过PCR和酶切鉴定，获得含有SzP基因的穿梭载体PUSZ11/P28S ；(3)让含有SzP基因的穿梭载体pUSZl 1/P28S与猪痘病毒同源重组，获得重组猪痘病毒 rSPV-SzP。(4)纯化重组猪痘病毒rSPV-SzP。在本发明的一个优选实施方案中，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示在本发明的一个优选实施方案中，所述让含有SzP基因的穿梭载体pUSZl 1/P28S 与猪痘病毒同源重组具体操作为用猪痘病毒(SPV)感染PK15单层细胞，2小时后用脂质体转染法加入穿梭载体PUSZ11/P28S，二者发生同源重组。PK15细胞在常规条件下培养4 天后，反复冻融3次，获得最初的重组猪窦病毒rSPV-SzP。在本发明的一个优选实施方案中，所述纯化重组猪痘病毒rSPV-SzP的具体操作为将所述重组猪痘病毒rSPV-SzP经倍比稀释，接种PK15单层细胞，使其在3_4天内形成独立的蓝色噬斑，挑取单独的病毒噬斑，适当稀释后再次接种PK15单层细胞，重复6次，直至最后得到的重组猪痘病毒能够稳定遗传。另一方面，本发明提供了一种将上述重组猪痘病毒制成疫苗的方法，该方法包括(1)将纯化的重组猪痘病毒rSPV-SzP在PK15细胞上连续传代30次，检测其SzP 基因的表达情况，至SzP稳定表达，且重组猪痘病毒的毒价稳定在106PFU/mL。(2)在扩大培养过程中取用保存的rSPV-SzP按5M0I接种长成单层的PK15细胞， 当细胞病变达70-90%时收毒，经反复冻融2次，即可获得表达SzP的重组猪痘病毒载体疫
田ο有益效果1.本发明首次成功构建了表达SzP的重组猪痘病毒，该重组猪痘病毒突破了 SEZ 常规灭活疫苗和弱毒疫苗的局限性。该重组疫苗兼具弱毒疫苗的复制特性和灭活疫苗的安全性，而且对人、猪等动物没有致病性，容易通过安全性评价。2.试验证明，本发明构建的表达SzP的重组猪痘病毒对外源蛋白表达稳定，种毒的毒价稳定在106PFU/mL。通过小鼠免疫试验和攻毒保护试验证明了该重组猪痘病毒产生了针对SEZ的抗体，对ICR小鼠的免疫保护率高达62. 5%。3.重组猪痘病毒对动物不致病，并可以通过多种途径进行传播，能够使混养猪发生感染。这种特性可以使没有免疫或漏免的猪也获得免疫，使群体的抗体水平较一致，能够更好的抵抗外源病毒的攻击。与现在应用的SEZ的弱毒疫苗和灭活疫苗相比，该病毒能在猪体内复制增殖并且不断表达SzP蛋白，使机体持续受到SzP的刺激，不断产生针对SzP的中和抗体，这样就能对猪体提供持久的保护力，因此在SEZ的防治方面具有广阔的应用前
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图1为穿梭载体PUSZ11/P28S结构示意图。其中，LF和RF分别为猪痘病毒的左、 右同源交换序列；Pll和P28为痘病毒启动子；LacZ为报告基因；szp为目的蛋白基因图2图示的是免疫小鼠血清抗体效价测定结果。图3图示的是攻毒保护试验结果下列实施例的给出是为了更好地理解和阐述本发明，而决不应理解为对本发明的任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。
实施例实施例ISzP基因的扩增、克隆、鉴定和测序分析1. IPCR引物设计及合成根据SEZ标准毒株ATCC 35246的基因序列设计了一对针对SzP基因(GenBank EU624402)的特异性引物，在引物的5’端分别含有限制性内切酶BamHI和SalI的酶切位点。引物由上海invitrogen生物公司合成。SzPl 5' -gtc gac gat tct gtt gag tea get aag-3' (SEQ ID NO 1)SzP2 5' -gga tcc tta tta gtt ttc ttt gcg tct tg_3，(SEQ ID NO :2)。L2PCR 扩增取2*Taq PCR Mix 25. O μ L, SzPll. O μ L，SzP21. Ομ L, SEZ 菌(ATCC35246)液 3. O μ L，用无菌超纯水补至总体积50. O μ L0在PCR仪上进行反应。循环参数为94°C预变性 5min ；94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，共进行35个循环；然后72°C延伸lOmin。 PCR产物进行(g/mL)琼脂糖凝胶电泳。1. 3PCR产物回收与纯化PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖凝胶块，用 DNA快速回收纯化试剂盒回收凝胶中的目的片段。具体操作步骤按Geneaid公司凝胶回收试剂盒的说明书进行。1. 4PCR产物酶切与纯化酶切反应总体积为40 μ L =PCR 回收片段 30. OyL, 10XT buffer 6. 0 μ L, BamHI 2. 0 μ L, Sail 2. Ομ L。37°C作用3. 0h，然后进行琼脂糖凝胶电泳并用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。1. 5pUSZll/P28M 酶切纯化酶切反应总体积为40yL :pUSZll/P28M 质粒 30. 0yL，10XT buffer 6. 0 μ L, BamHI2. OyL, Sail 2. 0 μ L。37°C作用3. Oh,然后进行琼脂糖凝胶电泳并用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。1. 6目的片段SzP与酶切pUSZll/P28M的连接酶切回收PCR产物6. 0μ L，载体pUSZll/P28M酶切回收产物2. 0μ L，10*Τ4连接酶缓冲液1. 0 μ L，T4DNA连接酶1. 0 μ L，混勻各产物后在16°C连接过夜。连接产物转化DH5 α。1. 7大肠杆菌DH5 α感受态细菌的制备和转化DH5 α感受态细菌的制备及连接产物的转化过程详见《分子克隆实验指南》。1. 8重组质粒的提取和鉴定用质粒提取试剂盒提取重组质粒pUSZll/P28S并用PCR和双酶切鉴定，在PCR和双酶切鉴定中都可以见到目的条带。1. 9目的基因SzP序列分析测序工作由invitrogen公司协助完成。测序结果如SEQ ID NO 3所示，克隆入的基因完全符合载体阅读框要求。实施例2重组猪痘病毒的制备及测定2. 1PK15细胞的复苏、培养与冻存在37°C水浴中轻轻振荡融化一管冻存的PK15细胞；用70%的酒精仔细洗涤外壁后放入超净工作台中；把细胞转入一个无菌的15mL的离心管中，加入10%血清的MEM，600g 离心5min，以沉淀细胞；弃去上清，用10. OmL的10%的新生牛血清的MEM重悬细胞，然后加入IOOmL的细胞瓶中；37°C 5%的二氧化碳培养箱中培养。至形成单层，再用胰酶在室温下消化l-3min分离细胞；轻敲细胞瓶壁使细胞移动，用倒置显微镜来观察细胞是否变圆和分离；用新的营养液对细胞按需要分瓶。为了保存细胞亚型的特殊表型，建立细胞贮存库的细
6胞密度必须低于50%。把健康生长处于对数期的细胞完全消化下来；离心，沉淀细胞；用少量含10%血清的MEM重悬细胞；用血细胞计数器进行记数；用50% MEM+10% DMS0+40%新生牛血清使每毫升细胞密度达到1 X IO6个；在1. SmL的冻存管分装1. OmL的细胞；把冻存管放在泡沫盒内置低温冰箱24h ；24h后迅速把低温冰箱的细胞转入液氮中。2. 2重组猪痘病毒的获取用脂质体转染法使穿梭载体PUSZ11/P28S与猪痘病毒(SPV)株VR-363 (购自 ATCC)发生同源重组。提前一天将PK15细胞接种到24孔细胞培养板上，使其长成单层细胞。先用0. 05M0I的SPV感染PK15单层细胞，Ih后将脂质体与穿梭载体的混合液加入到 24孔细胞培养板中。PK15细胞继续在37°C 5%的二氧化碳培养箱中培养4天，待能看到明显的病毒噬斑后，将其反复冻融3次，收获重组猪痘病毒rSPV-SzP原液。2. 3重组猪痘病毒的噬斑纯化在6孔细胞板的每一个孔接种3. OX IO5个细胞，5 %的二氧化碳温箱中静止培养；待细胞长成完全单层后，把重组病毒原液按1 5倍比稀释接种到单层细胞上，37°C吸附1. 5h ；弃去感染液，用DHanks缓冲液轻轻地洗两次；在一无菌的100. OmL的玻璃瓶中加入10. OmL的2XMEM和10. OmL的2%低熔点琼脂糖，充分混勻后置37°C水浴锅中；按每孔 3. OmL加入6孔板中，37°C 5 %的二氧化碳温箱中静止培养3_5天，观察噬斑；待能观察到明显的噬斑后，按每孔2. OmL加入含80 μ g/mL X-gal和2%低熔点琼脂糖的MEM细胞培养液，继续培养1-2天，重组病毒中的LacZ基因充分表达后，病毒噬斑部分将会形成蓝色的斑点；用灭菌枪头挑取含蓝色噬斑的琼脂糖凝胶块放入无菌离心管中，加入200. 0μ L的无菌 PBS，将琼脂块捣碎后反复冻融三次；12000rpm离心5min ；收获的病毒接种于一新的6孔细胞培养板中，重复7次。2. 4重组猪痘病毒滴度的测定按病毒学操作手册介绍的方法，用含青霉素和链霉素的DHanks缓冲液将病毒作 10倍梯度稀释。然后分别接种于长满PK15细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种 8个孔，每孔接种100 μ L。同时设定阴、阳性对照。3715%0)2温箱培养2h后，换维持液继续培养。逐日观察细胞病变，并按Reed-Muech法计算病毒滴度。滴度为106 24PFU/mL。2. 5PCR检测重组猪痘病毒取出同步接种重组猪痘病毒的PK15细胞和接种野生型猪痘病毒的PK15细胞各一管，用Geneaid病毒核酸提取试剂盒按其说明提取病毒DNA，以提取的DNA为模板，进行PCR 检测SzP基因。结果表明重组猪痘病毒中含有SzP基因片段，而对照的猪痘病毒野毒中扩增不出SzP基因。2. 6ffestern bloting检测目的蛋白SzP的表达按5M0I将重组猪痘病毒rSPV-SzP接种到PK15细胞单层上，37°C 5%的二氧化碳温箱中培养2天，使病毒大量增殖；弃去细胞培养液，并用灭菌PBS冲洗两次，加入少量灭菌 PBS，用细胞刮子将单层细胞刮下，收获细胞；反复冻融两次，使重组猪窦病毒充分释放，进行SDS-PAGE电泳，同时设SPV野毒感染的阴性对照和PK15细胞空白对照；再将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转印到PVDF膜上；然后用5%脱脂奶封闭，置4°C冰箱中过夜；次日将膜放入含1 5000稀释的含一抗(SzP单抗)的封闭液中置37°C摇床中50rpm作用lh，将膜取出用TBST洗三次，每次5min，再将膜放入含1 10000稀释的含酶标二抗(HRP标记的SPA)的封闭液中，同样条件作用lh，再用TBST洗三次，每次5min，将膜放入“沉淀型TMB单组份底物”中，使其显色。结果表明目的蛋白SzP在重组猪痘病毒中有较高效率的表达，而在阴性对照和空白对照中则没有目的蛋白出现。2. 7间接免疫荧光实验在24孔细胞培养板上接种PK15细胞，使其长成细胞单层；用DHanks缓冲液将重组猪痘病毒进行稀释，按15PFU/孔接种细胞，同时设定阴性对照；在37°C 5%的二氧化碳温箱中温育60h ；弃去营养液，用PBS洗涤细胞，然后弃去PBS ；加入-20°C预冷的甲醇，固定 IOmin ；用PBST冲洗3次后加入含10% BSA的PBST，37°C封闭Ih ；加入抗SzP的单抗，37°C 孵育Ih ；PBST冲洗3次，加入罗丹明标记的羊抗小鼠IgG-R 二抗，37°C作用0. 5h ；最后用 PBST冲洗3次后，在荧光显微镜下观察。结果表明A组接种了重组猪痘病毒，感染的PK15细胞胞浆内出现了明显的荧光； 而阴性对照组B组接种了猪痘病毒野毒，未观察到荧光。实施例3重组猪痘病毒疫苗的免疫保护实验3. 1重组猪痘病毒的小白鼠免疫试验取32只4周龄健康清洁级ICR小白鼠随机分成四组，每组8只；一组用2*107PFU 的重组猪痘病毒rSPV-SzP肌肉注射免疫，其余三组分别为用野生型猪痘病毒免疫的阴性对照、用灭活的ATCC 35246菌体免疫的阳性对照及用PBS免疫的空白对照；在初次免疫后的第14天和第35天按相同方法分别进行二免和三免；每天观察实验小鼠，以记录其免疫反应；在初次免疫的前一天及第6、13、20、27、34、41和48天小鼠眼眶采血，分离血清，用间接 ELISA法测其抗体效价。结果见图2。结果表明重组猪窦病毒免疫的小鼠血清抗体效价明显高于其他三组。3. 2攻毒保护试验最后一次免疫后两周，所有的小鼠均腹腔接种对数生长期的SEZ 0. 2mL，约为5倍的LD50(5*104CFU)；每天观察小鼠的变化，并记录死亡率，连续观察10天；10天仍未死亡的小鼠，施以安乐死；对死亡小鼠进行剖检并分离病原菌，染色及PCR检测均证明是马链球菌兽疫亚种。结果(图3)表明重组猪痘病毒疫苗对小鼠的免疫保护率可高达62. 5%。综上所述，本发明所述的重组猪痘病毒疫苗能够在免疫动物体内大量增殖，表达目的蛋白SzP，能够诱导动物体内产生较高效价的抗体，并对免疫动物产生良好的保护作用，是一种理想的新型疫苗。
权利要求
1.一种用于预防和/或治疗马链球菌兽疫亚种引发疾病的疫苗组合物，其中含有重组猪痘病毒和一种或多种药物学上可接受的载体或佐剂，该重组猪痘病毒包含猪痘病毒载体和马链球菌兽疫亚种类M蛋白的编码基因。
2.权利要求1中所述的重组猪痘病毒，该重组猪痘病毒包含猪痘病毒载体和马链球菌兽疫亚种类M蛋白的编码基因。
3.权利要求1或2所述的疫苗组合物，其中所述的马链球菌兽疫亚种类M蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
4.权利要求1至4中任一项所述的疫苗组合物，其中所述的猪痘病毒载体为VR-363。
5.权利要求2所述的重组猪痘病毒在制备用于预防和/或治疗马链球菌兽疫亚种引发疾病的药物中的用途。
6.权利要求5所述的用途，其中所述的马链球菌兽疫亚种引发疾病为猪链球菌病。
7.一种制备重组猪痘病毒的方法，该方法包括(1)利用特异性引物对扩增马链球菌兽疫亚种类M蛋白的编码基因；(2)把SzP基因克隆入穿梭载体pUSZl1/P28M中，然后通过PCR和酶切鉴定，获得含有 SzP基因的穿梭载体pUSZll/P28S ；(3)让含有SzP基因的穿梭载体pUSZll/P28S与猪痘病毒同源重组，获得重组猪痘病毒 rSPV-SzP。(4)纯化重组猪痘病毒rSPV-SzP。
8.权利要求7所述的方法，其中所述的特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示
9.权利要求7或8所述的方法，其中所述的让含有SzP基因的穿梭载体PUSZ11/P28S 与猪痘病毒同源重组的具体操作为用猪痘病毒(SPV)感染PK15单层细胞，2小时后用脂质体转染法加入穿梭载体PUSZ11/P28S，二者发生同源重组。PK15细胞在常规条件下培养 4天后，反复冻融3次，获得最初的重组猪窦病毒rSPV-SzP。
10.权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述的纯化重组猪痘病毒rSPV-SzP的具体操作为将所述重组猪痘病毒rSPV-SzP经倍比稀释，接种PK15单层细胞，使其在3_4 天内形成独立的蓝色噬斑，挑取单独的病毒噬斑，适当稀释后再次接种PK15单层细胞，重复6次，直至最后得到的重组猪痘病毒能够稳定遗传。
全文摘要
本发明属于生物制药领域。本发明提供了一种重组疫苗，其中含有重组猪痘病毒和一种或多种药物学上可接受的载体和/或佐剂，该重组猪痘病毒包含猪痘病毒载体和马链球菌兽疫亚种类M蛋白的编码基因。本发明所述的重组猪痘病毒疫苗能够在免疫动物体内大量增殖，表达目的蛋白SzP，能够诱导动物体内产生较高效价的抗体，并对免疫动物产生良好的保护作用。
文档编号A61P31/04GK102198268SQ20111007656
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者范红结, 蔺辉星, 陆承平 申请人:范红结, 蔺辉星, 陆承平