专利名称：尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的表达及酶活测定的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域；更具体地，本发明涉及通过采用基因工程方法克隆并表达尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶(Uridine Diphosphate Glucose Dehydrogenase,UDP-GlcDH)。
背景技术：
透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)是由N-乙酰氨基葡萄糖与葡萄糖醛酸为双糖单位等摩尔聚合而成的酸性黏多糖，Mr多在IO4 IO7Da之间，不同的Mr具有不同的应用领域。由于HA独特的黏弹性和生理功能，HA已被广泛应用于医药、化妆品和食品领域。C组的兽疫链球菌和马疫链球菌都可以合成HA，鉴于HA在发酵液中以游离状态存在，具有易于分离纯化和工业化生产等优点，因此目前工业上主要采取发酵法获取HA。然而链球菌具有一定的致病性并含有外毒素，而且对于培养基营养条件要求苛刻，利用它发酵生产难于通过代谢调控获得不同分子量的HA等劣势已展现出来，以传统的工艺优化难以克服上述弊端，而采用基因工程手段构建工程菌表达HA则克服了上述缺点，具有成本低，便于代谢调控以及下游纯化工艺便捷等优点，已逐渐成为未来工业化生产HA的优选方法。研究表明，链球菌中的has操纵子是其表达合成HA所必需的，has操纵子是由hasA、hasB和hasC三个基因组成,分别编码着HA合成酶、尿苷二磷酸_葡萄糖脱氢酶和尿苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶，但是对于HA合成代谢具有显著影响的主要是hasA和hasB基因，只要将hasA与hasB基因导入表达菌株并在适宜的培养条件下就有可能获得HA。UDP-GlcDH存在于动物、植物与细菌中，可以将尿苷二磷酸-葡萄糖转化成尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸，后者是形成结构多糖和细胞生长代谢必不缺少的前体物质。Sheng等研究结果表明高表达UDP-GlcDH更有利于HA的生成，因此只有提供丰富的HA前体物质——尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸才能高表达HA，而高表达的UDP-GlcDH则是产生大量尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸的必需条件。因此，本领域非常有必要研究高表达尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的方法，以大量生产透明质酸。
发明内容
本发明的目的在于提供大肠杆菌尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的表达及酶活测定。在本发明的第一方面，提供一种重组表达尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的方法，包括(I)提供表达构建物，其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件噬菌体匕启动子，编码尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的基因ugd ；(2)将(I)的表达构建物转化大肠杆菌，进行升温诱导表达，迅速升温到38_42°C，振荡培养8-15小时；较佳地为9-12小时。在一个优选例中，步骤(2)中，升温诱导表达方法选自
迅速升温到40-42 °C进行恒定温度诱导；迅速升温到40_42°C诱导1±0. 5小时后迅速降温至38±0. 5°C进行恒定温度诱导；或添加终浓度为O. 5-2g/L酵母抽提物后迅速升温到42 ±O. 5°C诱导1±0. 5小时后迅速降温至38±0. 5°C进行恒定温度诱导。在另一优选例中，经转化的大肠杆菌，在升温诱导表达前，还包括先将经转化的大肠杆菌接种到LB培养基中，在37±0. 5°C，200r/min培养12±2小时；之后转接到M9CAA培养基中，在30±O. 5°C,200r/min培养12±2小时；再次转接到M9CAA培养基中，在35±O. 5°C,200r/min 培养 2±O. 5 小时。在另一优选例中，尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的基因ugd的核苷酸序列如SEQ IDNO: I所示。在另一优选例中，在步骤(2)之后，还包括步骤(3):在pH7. 5±0. I条件下测定诱导表达产物的酶活。在另一优选例中，测定酶活的方法包括将大肠杆菌培养产物进行菌体破碎(较佳地，采用超声破碎)，之后在30°C下进行酶活反应，相对于Iml酶反应体系包括5mmol .!/1UDP-葡萄糖,5mmol · L4NAD+, IOOmmol · L^1Tris-HCl 及 5 μ I 酶液；酶活反应后，测定340nm吸光度，根据朗波尔定律Λ A= ε CL和酶活定义获得酶活值。在本发明的另一方面，提供一种用于重组表达尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶(UDP-GlcDH)的构建物，其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件噬菌体启动子，编码尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的基因ugd。在一个优选例中，所述的编码尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的基因ugd的序列如SEQID NO: I 所示。 在另一优选例中，编码尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的基因Ugd来源于Escherichiacoli YK537 的基因组 DNA。在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。在本发明的另一方面，提供一种基因工程菌，其包含所述的构建物。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图I、表达质粒pBLBugd和pBLYugd的构建示意图。图2、不同诱导温度及培养条件下UDP-GlcDH的活性测定图。附图中的宿主菌均为YK537，+线为质粒pBLBugd转化YK537后所得的工程菌测定的酶活曲线，+线为pBLYugd转化YK537后所得工程菌测定的酶活曲线。
具体实施例方式本发明涉及一种大肠杆菌尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶(简称UDP-GlcDH)的基因克隆、表达以及酶活性测定的方法。本发明将启动子、大肠杆菌UDP-GlcDH的基因(ugd)串联构建表达质粒，将所述表达质粒转化原核菌株，利用该菌株温度诱导表达m)P-GlcDH，并对其酶活性进行测定。采用该表达方法得到的m)P-GlcDH，表达效率高，酶活性高，酶活性保持的持续时间长。术语如本文所用，所述的“表达构建物(或称DNA构建物)”或“表达构建体(或称DNA构建体)”指一种已经通过人为干预修饰，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的DNA片段的单链或者双链DNA分子。如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区域”，代表本领域所共知的含义，表示一个基因的一部分，其含有可供RNA聚合酶结合的DNA序列和转录的起始点。·如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”;“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。表达构建物本发明提供了一种用于重组表达大肠杆菌UDP-GlcDH构建物，其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件噬菌体Pl启动子，编码UDP-GlcDH的基因ugd。作为本发明的优选方式，所述的编码大肠杆菌UDP-GlcDH的基因Ugd序列如SEQID NO: I所示，并且来源于Escherichia coli YK537的基因组DNA。构建物中各元件之间还可包括限制性的酶切位点，这样有利于各元件的有机连接。作为本发明的优选方式，所述的ugd基因的下游具有限制性内切酶HindIII酶切位点。通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。作为本发明的一种具体实施例，构建了两种表达质粒pBLBugd和pBLYugd,这两种质粒被用于直接表达UDP-GlcDH。包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主是大肠杆菌。本发明还提供了包含上述构建物的基因工程菌。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，例如磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。作为一种优选的方式，可用预冷氯化钙处理宿主细胞再升温至42°C作短时处理的方法进行。本发明还提供了包含上述构建物的基因工程菌。包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。较佳地，所述的宿主是大肠杆菌YK537。表达方法本发明还提供了表达UDP-GlcDH的方法，包括(I)提供表达构建物，其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件噬菌体启动子，编码尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的基因ugd; (2)将(I)的表达构建物转化大肠杆菌，进行升温诱导表达，迅速升温到38-42°C，振荡培养8-15小时。UDP-GlcDH被应用于重组表达生产透明质酸(HA)。高表达UDP-GlcDH有利于HA的生成，因此只有提供丰富的HA前体物质——尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸才能高表达HA，而高表达的UDP-GlcDH则是产生大量尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸的必需条件。所述的噬菌体启动子为一种温敏强启动子，其可在一定的诱导温度下启动下游基因的表达。然而，很多蛋白不适合在高于40°C的情况下表达。本发明人发现，UDP-GlcDH蛋白可以在42°C表达，但是经常会在细胞内产生大量包涵体，导致实际酶活很低或几乎测不到；针对包涵体，无法在活体细胞内通过复性手段将包涵体转变为可溶性蛋白。因此，针对UDP-GlcDH的特点，本发明人经过深入研究以及反复实验，最终确定采取先升温至较高温度，再适当降温的表达方法。较佳地，采取的温度诱导方法为迅速升温到40-42°C诱导1±0. 5小时后迅速降温至38±0. 5°C进行恒定温度诱导；或添加终浓度为O. 5-2g/L酵母抽提物后迅速升温到42±0. 5°C诱导1±0. 5小时后迅速降温至38±0. 5°C进行恒定温度诱导。作为最优选的方式，添加终浓度为O. 5-2g/L酵母抽提物后迅速升温到42±0. 50C诱导1±0. 5小时后迅速降温至38±0. 5°C进行恒定温度诱导，这一条件下，可以大大提高UDP-GlcDH的表达量。作为本发明的优选方式，经转化的大肠杆菌，在升温诱导表达前，还包括先将经转化的大肠杆菌接种到LB培养基中，在37±0. 5°C，200r/min培养12±2小时；之后转接到M9CAA培养基中，在30±O. 5°C,200r/min培养12±2小时；再次转接到M9CAA培养基中，在35±O. 5°C,200r/min培养2±0. 5小时。上述步骤的应用，为菌体的生长提供了合适的条件，使得在诱导表达前达到合适的菌体量以及菌体状态，有利于后续的诱导表达和高表达。作为本发明的优选方式，尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的基因Ugd的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。较佳地，其来源于Escherichia coli YK537的基因组DNA。本发明将PL启动子、大肠杆菌UDP-GlcDH的基因(ugd)串联构建表达质粒，将所述表达质粒转化原核菌株，利用该菌株温度诱导表达UDP-GlcDH，并对其酶活性进行了测定。采用该表达方法得到的m)P-GlcDH，表达效率高，酶活性高，酶活性保持的持续时间长。酶活测定作为合成透明质酸的重要参与中间物质，有必要实时了解细胞内尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的酶活。因此，本发明人还优化了尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的酶活测定方法。经过反复研究，本发明人发现，在酶活测定的反应体系中，调节pH值7. 5，可以测得最高的酶活性；而当PH值大于或等于8. O时，则基本上测不到酶活性，因此，作为本发明的优选方式，在重组表达后，在PH7. 5±0. I条件下测定诱导表达产物的酶活。更优选的，测定酶活的方法包括将大肠杆菌培养产物进行菌体破碎(较佳地，采用超声破碎)，之后在30°C下进行酶活反应,相对于Iml酶反应体系包括5mmol . PUDP-葡萄糖，5mmol · T1NAD+，IOOmmol · PTris-HCl及5 μ I酶液；酶活反应后，测定340nm吸光度，根据朗波尔定律ΛΑ= ε CL和酶活定义获得酶活值。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆 布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用到的基因、引物的合成，DNA的抽提及回收，DNA测序等，均是上海生工生物工程技术服务有限公司的产品或提供的服务；酶、dNTPs和DNA Marker则采用了 TaKaRa公司的产品；各种生化试剂均采购自上海国药和SIGMA公司。实施例中，LB培养基及M9CAA培养基均加入氨苄青霉素，终浓度为100 μ g · Iiir10实施例I、大肠杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶表达载体的构建I、大肠杆菌基因组DNA提取取大肠杆菌BL21(DE3)与大肠杆菌YK537甘油菌转接于LB培养基中，过夜培养，次日参照DNA抽提试剂盒方法提取基因组总DNA，并用紫外分光光度计测定其纯度。2、引物的设计与合成通过对NCBI中已公布的大肠杆菌CFT073(NC_004311)，大肠杆菌BL21(DE3)(NC_012971. 2，NC_012892. 2)，大肠杆菌K_12 (NC_000913)的ugd基因的保守序列对比，设计出ugd基因的上游引物和下游引物。上游引物(ugd-F):5’ GGATCCATGAAAATCACCATTTCCGGTA 3’ (内含 BamHI 位点)(SEQ ID NO:2)ο下游引物(ugd-R):5’ CCCAAGCTTATTAGTCGCTGCCAAAGAGATCG3，(内含 Hind III位点)(SEQ ID NO:3)ο3、PCR 反应分别以大肠杆菌BL21 (DE3)与YK537的基因组DNA为模板，以ugd_F和ugd-R为引物，进行PCR扩增获得ugd基因。PCR条件95°C预变性lOmin，然后每个循环94°C变性lmin，57°C退火lmin，72°C延伸I. 5min，共32个循环，最后72°C延伸IOmin0来自大肠杆菌BL21(DE3)与YK537的ugd基因，两者的DNA序列同源性为98. 37%。大肠杆菌BL21 (DE3)所含ugd基因的DNA序列在GenBank已公布(BL21 (DE3)来源的为NC_012971. 2, NC_012892. 2)，YK537来源的与BL21 (DE3)来源的基因的氨基酸同源性为99. 74%，仅在184位氨基酸出现差异。4、表达载体的构建将质粒pBLMVL2 (参见《生物化学与生物物理学报》，2003, 35 (2) : 167-171 ;或《生物化学与生物物理学报》，clts857基因的克隆、修饰及温敏诱导表达载体，1994年26卷4期)进行EcoRI酶切处理,将处理后的开环质粒再采用Mung Bean Nuclease进行黏性末端的平滑化，平滑化后放入65°C水浴15min热处理，再采用Hind III酶切，最后采用低熔点胶电泳分离并使用胶回收试剂盒回收处理后载体JtPCR回收后的ugd基因采用HindIII单酶切，将以上处理完的载体和ugd基因扩增产物采用T4DNA连接酶进行16°C过夜连接，次日转化到E. coli TOPlO中涂布于氨苄平板(含氨苄IOOyg . πιΓ1)并挑选单克隆，对抽提质粒采用BamHI、HindIII双酶切和PCR鉴定，将筛选得到的阳性克隆接种于LB培养基中37°C培养12 16h，抽提质粒分别获得pBLBugd与pBLYugd，构建示意图如图I。pBLBugd中Bugd,代表大肠杆菌BL21 (DE3)的ugd基因，pBLYugd中Yugd代表大肠杆菌YK537的ugd基因。感受态细胞的制备将10μ1 ΥΚ537甘油菌接种至3ml LB培养基中，37°C 200rpm培养过夜，取100 μ I菌液再接入3ml LB培养基中，37°C 200rpm培养至A6qq O. 3 O. 4，然后4，OOOrpm离心10分钟，弃上清，菌体以预冷的钙溶液(O. lmol/1 CaCl2)洗涤，4，OOOrpm离心10分钟，菌体重悬于200 μ I的钙溶液中备用。转化取重组质粒适量加入上述制备的感受态细胞中，冰浴30分钟，然后于42°C热休克90秒，随后加入800 μ I 1^培养基，于371，100印111，振摇30分钟，取10(^1涂布含10(^8/ml氨苄青霉素的LB平板(琼脂含量为I. 5%)，37°C倒置培养过夜。实施例2、大肠杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶的表达及酶活性测定I.菌种培养取重组大肠杆菌的甘油菌先接种到LB培养基中37°C，200r/min培养12小时，紧接着按照2%的接种量分别转接到M9CAA培养基(含1%酸水解酪蛋白和1%葡萄糖的M9培养基)中30°C，200r/min培养12小时，次日按照10%接种量分别再次转接到M9CAA摇瓶培养基(含1%酸水解酪蛋白和1%葡萄糖的M9培养基)中，35°C，200r/min继续培养2小时后进入温度诱导阶段。2.温度诱导采取选自以下的一种方式进行温度诱导A.迅速升温到38°C进行恒定温度诱导，振荡培养10h。B.迅速升温到40°C进行恒定温度诱导，振荡培养10h。C.迅速升温到42°C进行恒定温度诱导，振荡培养10h。D.迅速升温到40°C诱导Ih后迅速降温至38°C进行恒定温度诱导9h(两阶段诱导)。E.迅速升温到42°C诱导Ih后迅速降温至38°C进行恒定温度诱导9h(两阶段诱导)。F.添加酵母抽提物(终浓度为lg/L)后迅速升温到42°C诱导Ih后迅速降温至38°C进行恒定温度诱导9h (两阶段诱导)。3.大肠杆菌UDP-GlcDH的测定UDP-GlcDH的酶活定义为30°C条件下该反应体系中每分钟生成2 μ molNADH为1U。 分别于诱导前和诱导后每隔2h取一次样，首先菌液3ml在12000r/min离心，弃上清后在4°C条件下重悬浮于Iml PBS(pH 7. 5，IOmM)溶液中，在冰浴条件下选取300V电压，超声3s间歇5s对菌体进行超声破碎20min，离心取上清作为粗提液。以Iml反应体系为酶活测定体系，其中包括5mmol · I^1UDP-葡萄糖,5mmoI · L4NAD+, IOOmmol ·L^1Tris-HCKpH 7. 5)及5 μ I粗酶液。酶活反应在30°C下进行，用紫外分光光度计(UV-2100Spectrophotometer)检测340nm处吸光度的增加来确定反应体系中NADH的生成，蛋白的浓度采用Bradford方法测定。此外，利用同样的样品，本发明人还进行了酶活测定体系pH8. O (其它条件不变)情况下的酶活测定，结果测定获得的酶活非常弱，接近于无酶活性。UDP-GlcDH酶活的计算根据朗波尔定律Λ A= ε CL和酶活定义，其中Λ A为酶促反应初期I分钟吸光度的增加值，ε为NADH在340nm处的摩尔吸光系数，C为NADH浓度，L为比色皿厚度，本实验计算中ε取NADH微摩尔消光系数为O. 0062 4 ^ · cnT1。本实验测定酶活体系为Iml (Vt)，加入超声后粗酶液是为5 μ I (Ve)，比色皿厚度为1cm，其中参照Bradford方法测定粗蛋白浓度为Cp(mg/ml),贝U有酶活(U/mg) = AA . Vt/(2 ε L . Ve .Cp)，将本实验体系代入数值即为MF-GlcDH酶活的计算公式U/mg=AA/(0. 062 X Cp)。由图2可以看出在不同诱导条件下和培养条件下均出现UDP-GlcDH的超表达(含有空载体的YK537 (pBLMVL2)具有宿主菌自身的ugd基因，但是由于其微量表达和测定体系灵敏度等原因，在本酶活测定中未检测到UDP-GlcDH酶活)，尤其是采取前述“2.温度诱导”中F条件所得YK537 (pBLYugd)的UDP-GlcDH的酶活性最高。综上可见，大肠杆菌UDP-GlcDH的克隆和表达质粒的构建成功，结合两阶段升温诱导方式可以显著提高M)P-G1 cDH活性，延长UDP-GlcDH在胞内保持高活性的持续时间，从而为后续hasA基因参与在大肠杆菌中高表达HA提供了保证，为HA的链延伸提供了充足的时间。并且，MF-GlcDH在pH7. 5的体系中酶活性最高，大肠杆菌在此pH值下的生长情况也较好。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种重组表达尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的方法，包括 (1)提供表达构建物，其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件噬菌体启动子，编码尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的基因ugd ； (2)将(I)的表达构建物转化大肠杆菌，进行升温诱导表达，迅速升温到38-42°C，振荡培养8-15小时。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，升温诱导表达方法选自 迅速升温到40-42°C进行恒定温度诱导； 迅速升温到40-42°C诱导1±0. 5小时后迅速降温至38±0. 5°C进行恒定温度诱导；或 添加终浓度为O. 5-2g/L酵母抽提物后迅速升温到42±0. 5°C诱导1±0. 5小时后迅速降温至38±0. 5°C进行恒定温度诱导。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，经转化的大肠杆菌，在升温诱导表达前，还包括先将经转化的大肠杆菌接种到LB培养基中，在37±0. 5°C,200r/min培养12±2小时；之后转接到M9CAA培养基中，在30±0. 5°C，200r/min培养12±2小时；再次转接到M9CAA 培养基中，在 35±O. 5°C,200r/min 培养 2±O. 5 小时。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的基因ugd的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，在步骤(2)之后，还包括步骤(3):在pH7. 5±0. I条件下测定诱导表达产物的酶活。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，测定酶活的方法包括 将大肠杆菌培养产物进行菌体破碎，之后在30°C下进行酶活反应，相对于Iml酶反应体系包括 5mmol · L 1UDP-葡萄糖，5mmol · I. 1NAD + , 10Ommol · L 1Tris-HCl 及 5 μ I 酶液；酶活反应后，测定340nm吸光度，根据朗波尔定律ΛΑ= ε CL和酶活定义获得酶活值。
7.一种用于重组表达尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的构建物，其从5’至3’端依次包括以下操作性连接的元件 噬菌体匕启动子，编码尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的基因ugd。
8.如权利要求7所述的构建物，其特征在于，所述的编码尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的基因ugd的序列如SEQ ID NO: I所示。
9.如权利要求8所述的构建物，其特征在于，所述的构建物是表达载体。
10.一种基因工程菌，其特征在于，其包含权利要求7-9任一所述的构建物。
全文摘要
本发明涉及尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶的表达及酶活测定。本发明人将PL启动子、大肠杆菌UDP-GlcDH的基因(ugd)串联构建表达质粒，将所述表达质粒转化原核菌株，利用该菌株温度诱导表达UDP-GlcDH，并对其酶活性进行测定。采用该表达方法得到的UDP-GlcDH，表达效率高，酶活性高，酶活性保持的持续时间长。
文档编号C12R1/19GK102936603SQ20121042780
公开日2013年2月20日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者钱悦, 侯永泰, 吴剑英, 陈奕涵, 甘人宝, 周庆玮, 荣绍丰 申请人:上海昊海生物科技股份有限公司