一种产透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种产透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法，属于生物工程【技术领域】。本发明采用兽疫链球菌来源的透明质酸合酶hasA和枯草芽孢杆菌来源的UDP-葡萄糖脱氢酶tuaD，分别置于组成型启动子GAP和TEF1下表达，在毕赤酵母GS115中实现了透明质酸的生产。本发明为高效制备透明质酸奠定了一定的基础，适合于工业化生产应用。
【专利说明】一种产透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产透明质酸的重组毕赤酵母及其构建方法，属于生物工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] 透明质酸（Hyaluronic Acid, HA)，是一种高分子粘性多糖，以其独特的分子结构 和理化性质，使其具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，是目前发现的自然界中保 湿性最好的物质，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领 域。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润 滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。
[0003] HA广泛地存在于各种动物组织内，如鸡冠、关节滑液、软骨、眼玻璃体等，同时发现 HA也存在于产气杆菌、绿脓杆菌和A、B、C溶血性链球菌等部分细菌中。由于动物提取工艺 复杂、效率低以及存在病毒种间交叉感染和其它风险性的感染，因此，微生物发酵法开始逐 渐替代提取法生产HA。基于食品安全和医疗卫生越来越高的要求以及消费者的偏好，应用 食品安全级的微生物发酵生产HA日益受到青睐。
[0004] 本发明在毕赤酵母中构建HA代谢合成途径，实现分泌发酵透明质酸，由于毕赤酵 母可实现高密度发酵，胞外分泌杂质相对少，产品易于分离纯化，同时，本发明更换的启动 子为组成型强启动子，不需要甲醇诱导表达。该发明操作过程简单，且产品纯度高，易于实 现工业化生产制备透明质酸。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种产透明质酸的重组毕赤酵母，是在毕赤酵母中导入两个关键酶 基因，即编码透明质酸合酶的hasA和UDP-葡萄糖脱氢酶的tuaD，完善了毕赤酵母代谢合成 HA的途径，实现了直接以葡萄糖为碳源发酵产HA。
[0006] 这两个基因还可以分别置于组成型强启动子下控制表达。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母为Pichia pastoris GS115。
[0008] 所述透明质酸合酶编码基因hasA可以来源于兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus)、马链球菌(Streptococcus equi)或类马链球菌(Streptococcus equissp)。在本发明的一种实施方式中，编码所述透明质酸合酶的基因hasA来源于兽疫链 球菌。
[0009] 所述UDP-葡萄糖脱氢酶可以来源于链球菌属（Streptococcus species)、大肠杆 菌（Escherichia coli)和芽孢杆菌（Bacillus)。在本发明的一种实施方式中，编码所述 Μ)Ρ-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtiIis)。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母组成型强启动子分别为三磷酸甘油醛 脱氢酶启动子GAP和翻译延伸因子l-α启动子TEF1。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，编码所述透明质酸合酶的基因hasA的核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，编码所述UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 2所述。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述GAP启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述TEFl启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所 /Jn 〇
[0015] 本发明还提供了一种构建所述重组毕赤酵母的方法，是将编码透明质酸合酶的基 因hasA与启动子GAP融合，将编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD与启动子TEFl融合，将 两个融合片段再融合后连接表达载体PPIC9K，转化毕赤酵母得到。
[0016] 本发明还提供了一种应用所述产透明质酸的重组毕赤酵母发酵产透明质酸的方 法，是以甘油、甲醇、山梨醇或葡萄糖等作为碳源，在20-30°C下，发酵48-96h。所得明质酸 分子量大于l〇 6Da。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，碳源采用葡萄糖。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，发酵温度控制为30°C。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，发酵时间控制为96h。
[0020] 在本发明的一种实施方式中，挑取重组毕赤酵母单克隆，以YH)培养基活化，然后 接种于发酵培养基，200rpm、3(TC培养96h。
[0021] 所述发酵培养基含：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/LK2HP0 4,11. 8g/LKH2P04， 1XYNB(13. 4g/L)，500X 生物素 lml/L(4Xl(T4g/L)，甘油 lml/L，添加 2g/L 的 MgSO4,葡萄 糖浓度为5%。
[0022] 本发明利用毕赤酵母产透明质酸酶，与其他工程菌相比，该发明具有非常大的应 用优势。首先，本发明过程中使用的宿主为分泌型真核表达宿主，胞外分泌杂质少，产品易 于分离纯化；其次，以葡萄糖等廉价碳源为底物，可进行高密度发酵获得高转化率，再次，毕 赤酵母表达系统无内毒素及其它热源物质，不会对产物的医用食品安全带来隐患。基于应 用分析，本发明方法在工业上用于制备透明质酸具有潜在而非常广泛的价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1所示为重组质粒构建示意图。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1透明质酸合酶hasA基因和UDP-葡萄糖脱氢酶tuaD基因的克隆
[0025] 本发明所用的透明质酸合酶hasA基因来源于为兽疫链球菌Streptococcus zooepidemicus ATCC 35246 和 UDP-葡萄糖脱氧酶基因来源于 Bacillus subtilis， Streptococcus zooepidemicus 菌株在接种与 5ml M17 液体培养基，在 37°C 200rpm 培 养 16h。Bacillus subtilis 接种于 5mlLB 液体培养基，在 37°C 200rpm 培养 16h。Pichia pastoris GS115接种于5ml ΥΗ)液体培养基，置于200rpm 30°C培养24h。分别收集菌体， 采用细菌基因组提取试剂盒提取三菌株的基因组DNA。
[0026] 根据已公布的基因组信息序列，分别设计引物hasA-F/hasA-R、tuaD-F/tuaD-R, 以提取的基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，分别扩增获取hasA和tuaD 基因。以Pichia pastorisGS115基因组为模板,设计引物gap-F/gap-R和tef-F/tef-R分 别扩增GAP和TEFl启动子。
[0027] 引物序列信息：5' -3'方向
[0028] hasA-F ：TGAACAACTATTTCGAAACGATGAGAACATTAAAAAACCTCATAAC
[0029] hasA-R ： TGTCTAAGGCGAATTAATTCTTATAATAATTTTTTACGTGTTCCCCAGTC
[0030] tuaD-F ： CATTTTAGTTATTCGCCAACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGGAACAGG
[0031] tuaD-R ： CCGGAATTCTTATAATAATTTTTTACGTGTTCCCCAGTCAGC
[0032] gap-F ： CTTGATTCGAGCTCTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTC
[0033] gap-R：AGGTTTTTTAATGTTCTCATCGTTTCGAAATAGTTGTTCAATTG
[0034] tef-F：GAACACGTAAAAAATTATTATAAGAATTCCGGATAACTGTCGCCTCTTTTATCTGCCGC
[0035] tef-R ：ATGACAGCTATTTTTTTCATGTTGGCGAATAACTAAAATGTATGTAG
[0036] 序列表所示为本发明所述核苷酸序列信息：
[0037] (I)SEQ ID NO. 1序列信息为兽疫链球菌来源的透明质酸合成酶编码序列；
[0038] (2) SEQ ID NO. 2序列信息为枯草芽孢杆菌来源的UDP-葡萄糖脱氢酶编码序列；
[0039] (3) SEQ ID NO. 3序列信息为毕赤酵母组成型启动子GAP的基因序列；
[0040] (4) SEQ ID NO. 4序列信息为毕赤酵母组成型启动子TEFl的基因序列。
[0041] 实施例2重组质粒PAPT9K的构建
[0042] 采用上述扩增的DNA片段hasA、tuaD、GAP和TEF1，分别采用融合PCR进行启动子 和目的基因的融合。具体操作程序如下：hasA和GAP片段各取2 μ 1混合于PCR管内，加入 无菌水21 μ 1和25 μ 12x super pfu Master Mix (杭州宝赛生物科技有限公司），混勻后 置于 PCR 仪，按如下程序运行：94°C 3min，[94°C 30s，50°C 30s，72°C lmin] X 10, 72°C 5min。 无引物自融合PCR结束后，立即加入引物gap-F和hasA-R各I μ 1，混勻后按如下程序运行： 94°C 3min，[94°C 30s，55°C 30s，72°C lmin] Χ32, 72°C 5min。PCR 产物经 1% 的琼脂糖凝胶 电泳后，切胶回收目标条带，获得GAP-hasA片段。
[0043] 同理，按上述操作融合PCR获得TEFl-tuaD片段。回收的两个融合片段 GAP-hasA和TEFl-tuaD，在按上述融合PCR操作，将两片段进行融合，获得目标片段 GAP-hasA-TEFl-tuaD。由于在引物gap-F和tuaD-R两端分别引入了 SacI和NotI限制性酶 切位点，将载体PPIC9K进行SacI和EcoRI双酶切，去掉AOX启动子和α -因子信号肽，重组 目标片段GAP-hasA-TEFl-tuaD同样采取SacI和EcoRI双酶切，回收后与已双切的pPIC9K 载体连接，转化大肠杆菌JM109宿主，对鉴定出的阳性克隆提取质粒进行测序，比对分析重 组质粒PAPT9K构建成功，质粒构建示意图如附图1所示。
[0044] 实施例3重组毕赤酵母产HA的菌株构建
[0045] 重组质粒PAPT9K采用Sail线性化后，按毕赤酵母操作手册，电转Pichia pastoris GS115宿主，以MD平板（组氨酸缺陷型筛选标记）筛选阳性重组子。同时，为筛 选多拷贝插入的宿主，以含有不同浓度抗生素g418的YH)平板进行高拷贝筛选。本发明中 采用的发酵重组菌株为4mg/ml筛选出来的阳性重组菌株，命名为PAPTGS115。
[0046] 实施例4重组毕赤酵母PAPTGS115菌株的摇瓶发酵
[0047] 挑取PAPTGS115重组菌单克隆接种于5ml YH)培养基，置于200rpm3(TC过夜培养。 16h后接种于250ml三角摇瓶（装液量25ml)中，发酵培养基为BMGY :酵母提取物10g/L， 蛋白胨 20g/L，3g/LK2HP04,11. 8g/LKH2P04,1 X YNB (13. 4g/L)，500 X 生物素 lml/L (4 X l(T4g/ L)，甘油lml/L，添加2g/L的MgS04,葡萄糖浓度为5 %。按I %的接种量转接与BMGY摇瓶， 置于 200rpm30°C培养 96h。
[0048] 收集发酵液，IOOOOrpm下室温离心lOmin。发酵液上清转移置另一离心管中，加入 2倍体积的无水乙醇充分混匀沉淀发酵液中的透明质酸。室温下静置lh，再IOOOOrpm下室 温离心20min，去除干净液体，白色沉淀加入发酵液等体积的IMNaCl溶液充分溶解，适当稀 释后，采用Bitter-Muir硫酸咔唑法检测HA酸含量，对照组为Pichia pastoris GS115同 等条件下发酵液的回收物。经测定PAPTGS115重组菌株的HA产量为0. 36g/L。
【权利要求】
1. 一种产透明质酸的重组毕赤酵母，是在毕赤酵母中导入透明质酸合酶基因hasA和 Μ)Ρ-葡萄糖脱氢酶基因tuaD。
2. 根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，两个基因分别以组成型强启动 子控制表达。
3. 根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，以毕赤酵母（Pichia pastoris) GS115为宿主。
4. 根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述透明质酸合酶基因hasA来 源于兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus)、马链球菌（Streptococcus equi)或类 马链球菌（Streptococcus equissp) 〇
5. 根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于，所述UDP-葡萄糖脱氢酶来 源于链球菌属（Streptococcus species)、大肠杆菌（Escherichia coli)或芽抱杆菌 (Bacillus)〇
6. 根据权利要求1-5任一所述的重组毕赤酵母，其特征在于，编码所述透明质酸合酶 的基因hasA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，编码所述UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
7. 根据权利要求2所述的重组毕赤酵母，其特征在于，hasA、tuaD分别由三磷酸甘油醛 脱氢酶启动子GAP和翻译延伸因子l-α启动子TEFl控制表达。
8. -种应用权利要求1-5, 7任一所述重组毕赤酵母发酵产透明质酸的方法，其特征在 于，是以甘油、甲醇、山梨醇或葡萄糖作为碳源，在20-30°C下，发酵48-96h。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，碳源采用葡萄糖，20〇rpm、30°C，发酵96h ; 发酵培养基含：酵母提取物 l〇g/L，蛋白胨 20g/L，3g/LK2HP04,11. 8g/LKH2P04,1 X YNB13. 4g/ L，500 X生物素lml/L，甘油lml/L，添加2g/L的MgSO4，葡萄糖浓度为5 %。
10. -种构建权利要求1-5, 7任一所述重组毕赤酵母的方法，其特征在于，将编码透明 质酸合酶的基因hasA与启动子GAP融合，将编码TOP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD与启动子 TEFl融合，将两个融合片段再融合后连接表达载体，转化毕赤酵母得到。
【文档编号】C12N15/81GK104212732SQ201410467077
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】陈坚, 堵国成, 康振, 金鹏 申请人:江南大学