专利名称：抑制可卡因诱发的高运动活性的多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抑制可卡因诱发的高运动活性的多肽及其应用。
背景技术：
可卡因，是目前吸食非常普遍的一种成瘾性精神兴奋药物。可卡因成瘾也是对人类健康以及社会安定具有着严重危害的疾病。可卡因急性刺激，可以诱发运动活性增高。这主要是由于可卡因可以抑制突触前膜的多巴胺转运体，从而阻断多巴胺的重摄取，导致突触部位多巴胺浓度增高。可卡因诱发运动活性的程度，则可以反映出机体对于可卡因的行为学敏感性，进而为研究可卡因成瘾的分子机制及其治疗提供某些启示。多巴胺刺激，可以激活突触后膜的多巴胺受体。多巴胺受体，属于典型的G蛋白偶联受体，具有典型的七次跨膜结构。多巴胺受体主要有5种亚型，即D1、D2、D3、D4和D5受体，根据其偶联的G蛋白类型以及对于腺苷酸环化酶的作用，可以分为Dl样受体，包括Dl 和D5受体，以及包括D2、D3和D4受体在内的D2样受体。Dl样受体与兴奋性Ga s蛋白偶联，激活腺苷酸环化酶；D2样受体则相反，与抑制性Gai蛋白偶联，抑制腺苷酸环化酶的活性。多巴胺系统对于运动的调节，主要集中在基底节部位。锥体外系运动受到基底神经节的神经环路调控，黑质-纹状体DA系统是其中重要的神经环节，纹状体是调控中心部位。基底神经节内含直接和间接两种神经环路。直接环路由大脑皮质一纹状体一黑质网状区(SNR)—丘脑一大脑皮质；间接环路大脑皮质一纹状体一苍白球外侧区(GPe)—底丘脑(STN)—苍白球内侧区(GPi)—丘脑一大脑皮质。生理情况下，由黑质网状区和苍白球内侧区输出紧张性抑制冲动，作用于丘脑。时相性兴奋，激活直接环路，使丘脑去抑制，增强丘脑-皮质神经元活动；而激活间接环路，进一步抑制丘脑-皮质神经元活动。其结果是， 直接环路能够增强运动功能，而间接环路抑制运动功能。它们受到黑质-纹状体DA系统调控，Dl受体易化直接环路传递，而D2受体减弱间接环路传递。虽然突触功能不相同，DA对两环路产生的效果是一致的，减弱丘脑-皮质神经元的抑制，易化从皮质始发的运动功能。 而现有研究证据证实，可卡因敏化现象，主要倾向于激活直接环路的Dl受体。研究证据表明，激活Dl受体可以增强可卡因诱发的运动活性。可卡因刺激，突触部位的多巴胺水平增高，进而可以激活黑质纹状体神经元内的Dl受体。通过cAMP/PKA信号通路，Dl受体可以增强这些神经元对于谷氨酸的兴奋性，因而黑质纹状体直接通路的信号传出和所诱发的运动活性。反之，Dl受体敲除的小鼠，对于可卡因的运动活性增强反应减弱甚至消失。
发明内容
本发明的目的是提供了一种抑制可卡因诱发高运动活性的多肽及其应用。本发明提供的多肽，为如下所示a)或b)或C)或d)
a)、由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；b)、由序列表中序列1自5’末端第412-425位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的多肽；C)、由序列表中序列1自5’末端第3四_446位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的多肽；d)、将a)或b)或c)限定的多肽的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的分别有a)或b)或c)限定的多肽衍生的多肽。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。序列表中的序列2由23个氨基酸残基组成，序列表中的序列1由446个氨基酸残基组成。所述多肽的编码基因也是本发明保护的范围。所述基因是如下1)-5)中任意一种的DNA分子1)序列表中序列5所示的DNA分子；2)序列表中序列6自5’末端第1234-1275位核苷酸；3)序列表中序列6自5’末端第985-1338位核苷酸；4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的多肽的DNA分子；5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、 至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有 98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能的多肽的DNA分子。所述严格条件为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列5由72个核苷酸组成，序列表中的序列6由1341个核苷酸组成.含有所述编码基因的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系也是本发明保护的范围。所述的多肽、所述的编码基因、所述的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系在制备抑制成瘾药物诱发人或动物高运动活性药物中的应用也是本发明保护的范围。所述成瘾药物为可卡因，所述动物为大鼠，所述高运动活性通过提高运动路程值体现。所述抑制成瘾药物诱发动物高运动活性通过如下1)-3)中至少一种实现1)抑制I型多巴胺受体的磷酸化；2)抑制I型多巴胺受体的细胞质膜定位；3)抑制I型多巴胺受体的下游信号分子的磷酸化；所述I型多巴胺受体的的氨基酸序列为序列表中的序列1 ；所述下游信号分子为ERK(I型多巴胺受体的下游信号分子)和/或CREB (转录 ia^if^AMP EMjti^^·^^ (cAMP response elements binding protein, Ι^,ΤΜ^ CREB))，所述ERK的氨基酸序列为序列表中的序列7 ；所述CREB的氨基酸序列为序列表中的序列8。
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所述抑制I型多巴胺受体的磷酸化是通过所述多肽竞争性抑制I型多巴胺受体的第421位丝氨酸的磷酸化实现的。所述I型多巴胺受体的第421位丝氨酸为序列表序列1自5’末端第412位氨基酸或序列表序列2自5’末端第19位氨基酸。本发明的另一个目的是提供一种抑制可卡因诱发的人或动物高运动活性的药物。本发明提供的药物，其活性成份为所述的多肽、所述的编码基因、所述的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系。本发明的实验证明，本发明发现I型多巴胺受体(D1 dopamine receptor,以下简称D1R，氨基酸残基序列为序列1)可以被蛋白激酶Dl (protein kinase D1，以下简称PKD1) 磷酸化，由于第三胞内环2 位丝氨酸在人类序列中已经突变为丙氨酸，不会被磷酸化，因此只考虑了 C末端的421位丝氨酸。DlR-CT (Dl受体C末端)-S421是根据421位丝氨酸附近的氨基酸残基序列，包含了 PKDl的磷酸化偏好序列选取的核心序列，据此序列，构建具有穿膜能力的TAT融合肽Tat-D1R-CT-S421。体外激酶磷酸化实验表明，Tat-D1R-CT-S421 可以干扰PKD1对DIR-CT的磷酸化，使其磷酸化程度降至对照组的53. 39 士 5. 62 % (P < 0. 05)。背侧纹状体核团注射实验表明，Tat-D1R-CT-S421使PKDl对DlR-CT的磷酸化程度降至对照组的45. 98士 17. 69% (P < 0. 05)。可卡因诱发运动活性行为学实验表明， 与对照组Tat-D1R-CT-S421A相比，在可卡因注射后20_50min，Tat_DlR-CT_S421可以使可卡因诱发的运动活性幅度减弱至对照组的55. 46士 12. 50% (P < 0. 05)。并且这种行为学抑制作用是通过抑制DlR的细胞质膜定位和下游信号转导来实现的。SK-N-MC细胞系实验表明，Tat-D1R-CT-S421可以显著降低DlR的细胞质膜定位和下游信号分子细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，以下简称ERK)的磷酸化程度。背侧纹状体核团注射实验表明，Tat-D1R-CT-S421可以使DlR的细胞质膜定位降至对照组的64. 80 士 12. 95%，而其下游信号分子ERK及转录因子环化AMP反应元件结合蛋白(cAMP response elements binding protein，以下简称CREB)的磷酸化程度以及即刻早期基因 c-fos的蛋白水平显著降低。以上结果表明，Tat-D1R-CT_S421通过干扰PKDl对于DlR C末端421位丝氨酸的磷酸化程度，进而抑制DlR的细胞质膜定位和下游信号转导，继而抑制可卡因诱发的高运动活性。因此，本发明的多肽及其编码基因在抑制可卡因诱发的高运动活性方面具有广阔的应用前景。缩写词D1多巴胺受体(DlR)；可卡因(cocaine)；细胞外信号调节激酶 (extracellular signal-regulated kinase, ERK) ； ￠^ERK(phosphorylated ERK, pERK)；环化 AMP 反应元件结合蛋白(cyclic AMP response element binding protein, CREB)；磷酸化 CREB (phosphorylated CREB, pCREB) ； S卩刻早期基因 c-fos ；多巴胺 (dopamine, DA)。
图1为PKDl对DlR磷酸化位点的鉴定图2为Tat-D1R-CT-S421对PKDl磷酸化DlR C末端421位丝氨酸的影响图3为Tat-D1R-CT_S421对DlR-CT 421位丝氨酸磷酸化的影响
图4为Tat-D1R-CT_S421对可卡因诱发运动活性的影响图5为Tat-D1R-CT_S421减弱DlR在细胞质膜的定位图6为Tat-D1R-CT_S421抑制DlR下游信号转导
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、PKDl (蛋白激酶Dl)磷酸化DlRC末端具体磷酸化位点的鉴定一、连有GST标签的蛋白的制备I型多巴胺受体(以下简称DlR)全长446个氨基酸，属于典型的G蛋白偶联受体， 具有经典的七次跨膜结构，因此将Dl受体分段，分别定义为N末端，第一跨膜结构域，第一胞内环，第二跨膜结构域，第一胞外环，第三跨膜结构域，第二胞内环，第四跨膜结构域，第二胞外环，第五跨膜结构域，第三胞内环，第六跨膜结构域，第三胞外环，第七跨膜结构域，C 末端(图la)。I型多巴胺受体的氨基酸序列为序列表中的序列1，其核苷酸序列为序列6。本实施例中使用如下肽段DlR-CT-WT(序列表中的序列1所示自5’末端第 329-446位氨基酸，DlR蛋白N端起第3四_446位氨基酸肽段)、D1R_CT_S421A (将DlR-CT-WT 的第421位丝氨酸突变为丙氨酸的肽段)、D1R-CT-无关突变(将D1R-CT421位以外的氨基酸残基突变后的肽段，序列4)、D1R-IL3-WT(序列表中的序列1自5’末端第212-268位氨基酸)、D1R-IL3-S229A (将D1R-IL3-WT的第2 位丝氨酸突变为丙氨酸)、D1R_IL3_S256A (将 D1R-IL3-WT 的第 256 位丝氨酸突变为丙氨酸)、D1R_IL3_S2^A+S256A (将 D1R-IL3-WT 的第2 位丝氨酸和第256位丝氨酸同时突变为丙氨酸)，实验时在各肽段前加GST标签。几种带有GST标签的蛋白的制备如下构建原核表达载体然后进行制备。GST-tag 菌体裂解液10mM PMSF/1 XPI/1 XPBS ；GST-tag elution buffer IOmM 还原型谷胱甘肽(Roche), 50mM Tris-Cl (pH8. 0)表1、引物对序列表
6序号质粒名称酶切位点引物1pGEX-5X-1-D1R-IL3BamHi5' - AGCGGATCCCCAGTATCTACAGGATTGCCC -3'Xhol5' - AGCCTCGAGCGTCTCCCTCTTGAAGGACAT -3’2PGEX-5X-1-D1R-CTBamHi5' -AGCGGATCCCCATTATTTATGCTTTTAATGCT -3'XhoI5' - AGCCTCGAGTCAAGTGGAATGCTGTCCACT -3'3pGEX-5X-1-D1R-S421A5‘ -CTGTCCCCAGCCTTAGCGGTCATATTGGACTat-3’5' -ATAGTCCAATATGACCGCTAAGGCTGGGGACAG -3’4PGEX-5X-1-D1R-S229A5' -CAAATCCGGCGCATCGCAGCCTTGGAGAGGGCA -3’5' - TGCCCTCTCCAAGGCTGCGATGCGCCGGATTTG -3’5pGEX-5X-1-D1R-S256A5' -GTCGAATGCGCCCAGGCTGAAAGTTCCTTTAAG -3’5' CTTAAAGGAACTTTCAGCCTGGGCGCATTCGAC 3'分别连有GST标签的蛋白的制备1)各蛋白的编码基因的扩增以雄性SD大鼠(北京大学医学部实验动物科学部) 纹状体(具体提取方法如后所述)cDNA (提取RNA，反转录获得cDNA)为模板，分别以表1中所示序列为引物，进行PCR扩增，分别得到如下多肽片段的PCR产物，将PCR产物进行测序验证，结果产物序列正确DlR-CT-WT的核苷酸序列为序列表中序列6自5’末端第985-1338位核苷酸；氨基酸序列为序列表中序列1自5’末端第3四-446位氨基酸，采用的引物为表1中的引物对 2。D1R-IL3-WT的核苷酸序列为序列表中序列6自5’末端第634-804位核苷酸；氨基酸序列为序列表中序列1自5’末端第212-268位氨基酸，采用的引物为表1中的引物对 1。2)点突变质粒载体的构建采用 Stratagene QuikchangeR XL site-directed mutagenesis kit， USA， CAT# 200517-5进行点突变，具体步骤如下PCR扩增反应体系
5XPrimeSTAR buffer10 μ 1
dNTP mix2μ 1
D1R-CT-WT/D1R-IL3-WTIOOng
DMSO2. 5μ 1
5，primer(lOOng/μ 1)1. 25μ 1
3，primer(lOOng/μ 1)1. 25μ 1
PrimeSTAR HS polymerase1 μ 1
力口 ddH20 至 50 μ 1
反应条件
权利要求
1.一种多肽，为如下所示a)或b)或c)或d):a)、由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；b)、由序列表中序列1自5’末端第412-425位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的多肽；c)、由序列表中序列1自5’末端第329-446位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的多肽；d)、将a)或b)或c)限定的多肽的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的分别有a)或b)或c)限定的多肽衍生的多肽。
2.权利要求1中所述多肽的编码基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)-5)中任意一种的DNA分子1)序列表中序列5所示的DNA分子；2)序列表中序列6自5’末端第1234-1275位核苷酸；3)序列表中序列6自5’端第985-1338位核苷酸；4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的多肽的 DNA分子；5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98% 或至少具有99%同源性且编码具有相同功能的多肽的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系。
5.权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述的编码基因或权利要求4所述的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系在制备抑制成瘾药物诱发人或动物高运动活性药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述成瘾药物为可卡因，所述动物为大鼠， 所述高运动活性通过提高运动路程值体现。
7.一种抑制可卡因诱发的人或动物高运动活性的药物，其活性成份为权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述的编码基因或权利要求4所述的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系。
全文摘要
本发明公开了一种抑制可卡因诱发高运动活性的多肽及其应用。本发明提供的多肽，为如下所示a)或b)或c)或d)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；b)由序列表中序列1自5′末端第412-425位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的多肽；c)由序列表中序列1自5′末端第329-446位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的多肽；d)将a)或b)或c)限定的多肽的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的分别有a)、b)或c)限定的多肽衍生的多肽。本发明的实验表明，本发明的多肽对于降低机体对于可卡因刺激的行为学敏感性具有重要意义。
文档编号A61K48/00GK102276731SQ20111023507
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月16日 优先权日2011年8月16日
发明者康凯, 王宁, 王韵, 苏萍 申请人:北京大学