专利名称：多组分骨组织工程支架材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种多组分骨组织工程支架材料及其制备方法，属于骨修复生物材料技术。
背景技术：
目前，各类骨科疾病越来越严重，骨修复与再生是一普遍而复杂的临床问题。许多人由于缺乏理想的替代材料而死亡。目前的植骨材料主要有自体骨、同种异体骨、经特殊处理的异种骨，但是这些策略均存在一定的局限性，使用受到限制。支架基骨组织工程策略是解决骨缺损的有效途径。理想的骨组织工程材料应该具有合适的生物降解性，力学性能和生物相容性。应该为细胞和组织的生长提供适宜的微环境，它不仅要为细胞的生长提供支撑作用，更重要的是要为细胞的生长提供诱导特性，促进新的骨组织的再生。羟基磷灰石/高聚物复合材料可以很好地模拟天然骨的结构和组成，是一种理想的骨组织工程支架材料。HA/高聚物可以通过直接混合羟基磷灰石(HA)晶体与高聚物获得，但是这种方法制备的复合物中，HA颗粒分散不均勻，容易发生团聚现象。而且在材料降解过程中HA颗粒可能从支架材料中脱离出来，从而损伤周围的组织。通过生物矿化制备的复合材料，其高聚物表面形成HA涂层，这种制备方法可以很好地通过高聚物的特性来调控HA晶体的大小以及形貌，同时这种材料具有很好的生物相容性，但是由于细胞与材料直接接触的是HA涂层，所以其中的高聚物组分在使用过程中所起的作用是微乎其微的。这与在短期内最大限度地模拟天然骨的组成和结构的要求还有一定的差别。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多组分骨组织工程支架材料及其制备方法，以该方法制得的骨组织工程支架材料具有与天然骨相似的结构及优良的力学性能，克服了传统支架中HA颗粒分散不均一，容易团聚的缺点，同时可发挥各组分的作用，在骨组织工程中具有很好的应用前景。本发明是通过以下技术方案加以实现的，一种多组分骨组织工程支架材料，其特征在于，该多组分骨组织工程支架材料由下列组分及其质量含量百分比组成，且各组分质量百分比含量之和为100%
壳聚糖3. 6% 63%， 明胶3% 56. 7%, 果胶0. 6% 56. 7%, 纳米羟基磷灰石10% 72%。上述的多组分骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于包括以下过程
(1)将果胶溶于去离子水中，制备成浓度为每毫升含1 4毫克的果胶溶液；将壳聚糖溶解于1% 3%的乙酸溶液中，制备成浓度为每毫升含2 4毫克壳聚糖的乙酸溶液；
(2)将硝酸钙溶于步骤(1)所制备的果胶溶液中，配制成含钙离子浓度为0.05 0. 5mol/L的混合溶液，记为A溶液；将磷酸二氢钠溶于步骤(1)所制备的壳聚糖乙酸溶液中，配制成含磷酸根离子浓度为0. 30 0. 3mol/L的混合溶液，记为B溶液；
(3)按钙离子与磷酸根物质量之比为1.67:1，将步骤(2)制备的B溶液滴加到A溶液中；并用NaOH溶液调节pH值为3. 0-13. 0 ；搅拌6 20小时，得到混合液；
(4)将步骤(3)得到的混合液，静置6到48小时，经离心分离，收集固体分并用去离子水洗涤至洗涤液PH为7，最后冷冻干燥获得粒径为10-100 nm的纳米羟基磷灰石/壳聚糖-果胶复合物(nHCP)；
(5)将每毫升含有2、毫克的明胶水溶液与每毫升含2 4毫克壳聚糖的乙酸溶液，按两种溶液中的壳聚糖与明胶的质量比为(3 7) (7 3)的比例进行搅拌10 12小时混合；形成壳聚糖-明胶(CG)溶液；
(6)按纳米羟基磷灰石/壳聚糖-果胶复合物(nHCP)的质量含量为10% 90%，将步骤(4)所制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖-果胶复合物(nHCP)，加入步骤(5)所制备的壳聚糖-明胶溶液中，超声分散5 20 min，使其形成均一的分散液；
7)将步骤(6)获得的分散液与质量含量为0. 25%的戊二醛溶液按体积比为(10 2) 1，搅拌下将其混合得到铸模液，将铸模液加入模具中，在温度为-20°C -60°C下预冻8小时以上，得到的凝胶在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到支架材料；
(8)将步骤(7)得到的支架材料在质量浓度为1% 5%的氢氧化钠溶液中浸泡3 8小时，除去残留的乙酸，再将其置于质量浓度为21 5%的硼氢化钠溶液中浸泡3 8小时，除去游离的戊二醛，用去离子水反复冲洗、浸泡至溶液呈中性，然后再次在温度为-20°C -60°C下预冻8小时以上，再次于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，最终得到多组分骨组织工程支架材料(nHCP/CG)。本发明的优点在于，方法过程简单，所获得的羟基磷灰石尺寸和形貌可由壳聚糖-果胶基质的组成、钙离子的浓度以及反应的PH值等控制。形成的纳米羟基磷灰石尺寸均一(如图1)；在此基础上制备的多组分多孔支架的孔隙率大于80%，具有大量的连通的孔径为100 300 μ m的适合于细胞生长的微孔，孔径的大小由预冻温度决定。nHCG复合物在支架中分散均一(如图2)。该支架的力学性能可由交联度以及nHCG的含量来控制，压缩强度可达13. 45MPa，与松质骨的压缩强度极为接近。同时该支架材料可为促进成骨细胞的粘附和生长，具有良好的生物相容性，动物实验发现可快速促进骨缺损的修复，在骨组织工程领域具有很好的应用前景。
图1为以本发明实施例一所制得的纳米羟基磷灰石/壳聚糖-果胶复合物(nHCP) 的透射电镜照片。图2为本发明实施例一所得的多组分骨组织工程支架材料的扫描电镜照片。
具体实施例方式
实施例所用的主要原料为壳聚糖(脱乙酰度95%，相对分子质量20万，青岛海汇生物制品有限公司)、果胶、明胶(Sigma公司，美国)。其他试剂例如乙酸(CH3COOH)、硝酸钙 (Ca (NO3) 2 ·4Η20)、磷酸二氢钠((NaH2PO4 ·2Η20)戊二醛(OHC(CH2)3CHO)、氢氧化钠(NaOH)、 硼氢化钠(NaBH4)等均为分析纯。实施例一
将Ig果胶溶于去IOOmL去离子水中，制备成浓度为l%(w/v)的果胶溶液；将Ig壳聚糖溶解于IOOmL 1%的乙酸溶液中，制备成浓度为l%(w/v)壳聚糖的乙酸溶液；将4. 723g硝酸钙(Ca (NO3)2 · 4H20)溶于果胶溶液中，1. 653g磷酸二氢钠(NaH2PO4 · 2H20)溶于壳聚糖溶液中；将上述含有磷酸盐的壳聚糖溶液滴加到含有钙离子的果胶溶液中，其中的钙离子与磷酸根物质量之比为1. 67，并用质量浓度为5%的NaOH溶液调节pH值为9，搅拌6小时，静置 48小时，保持pH为9。离心分离，收集固体分，并用去离子水冲洗直至溶液pH值为7，在温度为-20°C下预冻，再经冷冻干燥获得纳米羟基磷灰石/壳聚糖-果胶复合物(nHCP)。将Ig壳聚糖溶于质量浓度为21的50mL醋酸中，配制成浓度为壳聚糖溶液；将Ig明胶在50°C的温度下将其溶于50mL去离子水中，配制成浓度为鋒M明胶水溶液；将上述壳聚糖溶液与明胶溶液混合，搅拌10小时；将2g nHCP复合物加入100 mL的壳聚糖-明胶混合溶液中，超声(600W)分散10 min，使其形成均一的分散液；然后在分散液中加入质量浓度为0. 25%的戊二醛溶液10mL，搅拌50s，迅速倒入模具中，放入_50°C的低温下预冻8小时以上，将预冻好的凝胶在真空冷冻干燥机中冷冻干燥；将冻干后的支架在质量浓度为5%的氢氧化钠溶液中浸泡8小时，除去残留的乙酸。再将其置于质量浓度为 2%的硼氢化钠溶液中浸泡8小时，除去游离的戊二醛，用去离子水反复冲洗、浸泡至溶液呈中性，再次放入-50°C的低温下预冻8小时以上，将预冻好的凝胶在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到多组分骨组织工程支架材料(nHCP/CG)。实施例二
将Ig果胶溶于去IOOmL去离子水中，制备成浓度为1% (w/v)的果胶溶液；将Ig壳聚糖溶解于IOOmL 1%的乙酸溶液中，制备成浓度为l%(w/v)壳聚糖的乙酸溶液；将2. 362g硝酸钙(Ca (NO3)2 · 4H20)溶于果胶溶液中，0. 827g磷酸二氢钠(NaH2PO4 · 2H20)溶于壳聚糖溶液中；将上述含有磷酸盐的壳聚糖溶液滴加到含有钙离子的果胶溶液中，其中钙离子与磷酸根物质量之比为1. 67，并用质量浓度为5%的NaOH溶液调节pH值为9，搅拌6小时，静置 48小时，保持pH为9。离心，并用去离子水冲洗直至溶液pH值为7，在温度为-20°C下预冻，再经冷冻干燥获得纳米羟基磷灰石/壳聚糖-果胶复合物(nHCP)。将Ig壳聚糖溶于质量浓度为21的50mL醋酸中，配制成浓度为21 (w/v)壳聚糖溶液；将Ig明胶在50°C的温度下将其溶于50mL去离子水中，配制成浓度为m (w/v)明胶水溶液；将上述壳聚糖溶液与明胶溶液混合，搅拌10小时；将Ig nHCP复合物加入100 mL 的壳聚糖-明胶混合溶液中，超声(600W)分散10 min，使其形成均一的分散液；然后在分散液中加入质量浓度为0. 25%的戊二醛溶液10mL，搅拌50s，迅速倒入模具中，放入_50°C的低温下预冻8小时以上，将预冻好的凝胶在真空冷冻干燥机中冷冻干燥；将冻干后的支架在质量浓度为5%的氢氧化钠溶液中浸泡8小时，除去残留的乙酸。再将其置于质量浓度为 2%的硼氢化钠溶液中浸泡8小时，除去游离的戊二醛，用去离子水反复冲洗、浸泡至溶液呈中性，再次放入-50°C的低温下预冻8小时以上，将预冻好的凝胶在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到多组分骨组织工程支架材料(nHCP/CG)。
实施例三
将Ig果胶溶于去IOOmL去离子水中，制备成浓度为l%(w/v)的果胶溶液；将0. 5g壳聚糖溶解于IOOmL 1%的乙酸溶液中，制备成浓度为0. 5%(w/v)壳聚糖的乙酸溶液；将4. 723g 硝酸钙(Ca (NO3)2 · 4H20)溶于果胶溶液中，1. 653g磷酸二氢钠(NaH2PO4 · 2H20)溶于壳聚糖溶液中；将上述含有磷酸盐的壳聚糖溶液滴加到含有钙离子的果胶溶液中，其中钙离子与磷酸根物质量之比为1. 67，并用质量浓度为5%的NaOH溶液调节pH值为9，搅拌6小时，静置48小时，保持pH为9。离心，并用去离子水冲洗直至溶液pH值为7，在温度为-20°C下预冻，再经冷冻干燥获得纳米羟基磷灰石/壳聚糖-果胶复合物(nHCP)。将Ig壳聚糖溶于质量浓度为21的50mL醋酸中，配制成浓度为21 (w/v)壳聚糖溶液；将Ig明胶在50°C的温度下将其溶于50mL去离子水中，配制成浓度为m(w/v)明胶水溶液；将上述壳聚糖溶液与明胶溶液混合，搅拌10小时；将Ig nHCP复合物加入100 mL壳聚糖-明胶混合溶液中，大功率超声(600W)分散10 min，使其形成均一的分散液；然后在分散液中加入质量浓度为0. 25%的戊二醛溶液20mL，搅拌50s，迅速倒入模具中，放入_50°C 的低温下预冻8小时以上，将预冻好的凝胶在真空冷冻干燥机中冷冻干燥；将冻干后的支架在质量浓度为5%的氢氧化钠溶液中浸泡8小时，除去残留的乙酸。再将其置于质量浓度为m的硼氢化钠溶液中浸泡8小时，除去游离的戊二醛，用去离子水反复冲洗、浸泡至溶液呈中性，再次放入-50°C的低温下预冻8小时以上，将预冻好的凝胶在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到多组分骨组织工程支架材料(nHCP/CG)。
权利要求
1.一种多组分骨组织工程支架材料，其特征在于，该多组分骨组织工程支架材料由下列组分及其质量含量百分比组成，且各组分质量百分比含量之和为100% 壳聚糖3. 6% 63%，明胶3% 56. 7%,果胶0. 6% 56. 7%,纳米羟基磷灰石10% 72%。
2.一种制备权利要求1所述的多组分骨组织工程支架材料的方法，其特征在于包括以下过程(1)将果胶溶于去离子水中，制备成浓度为每毫升含1 4毫克的果胶溶液；将壳聚糖溶解于1% 3%的乙酸溶液中，制备成浓度为每毫升含2 4毫克壳聚糖的乙酸溶液；(2)将硝酸钙溶于步骤(1)所制备的果胶溶液中，配制成含钙离子浓度为0.05 0. 5mol/L的混合溶液，记为A溶液；将磷酸二氢钠溶于步骤(1)所制备的壳聚糖乙酸溶液中，配制成含磷酸根离子浓度为0. 30 0. 3mol/L的混合溶液，记为B溶液；(3)按钙离子与磷酸根物质量之比为1.67:1，将步骤(2)制备的B溶液滴加到A溶液中；并用NaOH溶液调节pH值为3. 0-13. 0 ；搅拌6 20小时，得到混合液；(4)将步骤(3)得到的混合液，静置6到48小时，经离心分离，收集固体分并用去离子水洗涤至洗涤液PH为7，最后冷冻干燥获得粒径为10-100 nm的纳米羟基磷灰石/壳聚糖-果胶复合物；(5)将每毫升含有2、毫克的明胶水溶液与每毫升含2 4毫克壳聚糖的乙酸溶液，按两种溶液中的壳聚糖与明胶的质量比为(3 7) (7 3)的比例进行搅拌10 12小时混合；形成壳聚糖-明胶溶液；(6)按纳米羟基磷灰石/壳聚糖-果胶复合物的质量含量为10% 90%，将步骤(4)所制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖-果胶复合物，加入步骤(5)所制备的壳聚糖-明胶溶液中，超声分散5 20 min，使其形成均一的分散液；(7)将步骤(6)获得的分散液与质量含量为0.25%的戊二醛溶液按体积比为(10 2) 1，搅拌下将其混合得到铸模液，将铸模液加入模具中，在温度为-20°C -60°C下预冻8小时以上，得到的凝胶在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到支架材料；(8)将步骤(7)得到的支架材料在质量浓度为1% 5%的氢氧化钠溶液中浸泡3 8小时，除去残留的乙酸，再将其置于质量浓度为21 5%的硼氢化钠溶液中浸泡3 8小时，除去游离的戊二醛，用去离子水反复冲洗、浸泡至溶液呈中性，然后再次在温度为-20°C -60°C下预冻8小时以上，再次于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，最终得到多组分骨组织工程支架材料。
全文摘要
本发明公开了一种多组分骨组织工程支架材料及其制备方法。所述的多组分骨组织工程支架材料由壳聚糖、明胶、果胶和纳米羟基磷灰石按质量百分比组成。其制备方法过程选用壳聚糖和果胶，运用共沉积技术制备的羟基磷灰石/壳聚糖-果胶复合物，其中羟基磷灰石的粒径在10-100nm；将nHCP分散到壳聚糖-明胶溶液中，以戊二醛交联后冷冻干燥获得多组分骨组织工程多孔支架材料。本发明制备的支架材料，其中nHCP在支架中分散均匀，不易团聚；支架材料的孔径为100-300μm，孔隙率大于80％；可促进成骨细胞的粘附和生长，具有良好的生物相容性，可望作为一种新型的骨组织工程生物材料。
文档编号A61L27/22GK102406963SQ20111034144
公开日2012年4月11日 申请日期2011年11月2日 优先权日2011年11月2日
发明者刘玉玺, 姚芳莲, 尹建伟, 李俊杰 申请人:天津大学