专利名称：一种靶向-葡聚糖-uspio 复合粒子及其制造方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种靶向氧化铁纳米粒，尤其是一种具有更好的水相稳定性、更好的表面亲水性的靶向-葡聚糖氧化铁纳米粒；本发明还涉及此类纳米粒的制造方法及其应用。
背景技术：
核磁共振成像(Magnetic resonance imaging, MRI)是一项完全无创性检查， 其安全性好，没有离子辐射，可以快速地提供患者全身任何部位、任意方向(矢状面、冠状面、横断面)、任意断层的高分辨率解剖图像，清晰度远远超过计算机断层扫描(Computer AssistedTomography, CT)。MRI应用于人体脑部、神经系统、腹部及心血管造影，对于检测组织坏死、局部缺血和多种恶性肿瘤的探查特别有效，可以满足病灶早期诊断的要求，被视为一种颇具潜力的诊断方法，在临床医学影像学诊断中得到迅速广泛的应用。超顺磁性氧化铁造影剂即为超顺磁性氧化铁颗粒(Superparamagnetic Iron Oxide，SPI0)，为一种核壳结构，由超顺磁性核芯和包被外壳构成。包被外壳由多糖、脂类及表面活性剂等亲水性材料构成，核芯为Y -Fe2O3或!^e3O4晶核，晶核的尺度大小决定了超顺磁性氧化铁造影剂的磁学特性和MRI效率。粒径范围为10-30nm的USPI0，氧化铁核心直径仅为6 lOnm，大部分为单畴晶粒氧化铁。USPIO因粒径小，一定程度上减少了肝脏、脾脏中网状内皮系统对其的吞噬，使得血浆半衰期大幅延长，保证了肿瘤病灶对USPIO的有效结合时间和摄入时间，可作为心血管造影剂和血池造影剂；同时又由于USPIO更多被淋巴结组织及骨髓组织中单核/巨噬细胞摄取，因此可用于肿瘤的淋巴结转移灶探查。在超顺磁性氧化铁的外壳层装配特异性配体分子，称为靶向SPI0，配体有抗体、多肽配体、小分子配体等，借助于受体-配体特异性结合作用，靶向USPIO (超小型超顺磁性氧化铁)可以与体内组织或器官的特异性表面受体结合，从而达到对特定靶细胞、组织、器官进行MRI增强成像的目的。如外表面装配有阿拉伯半乳聚糖的AG-USPIO可以特异地与肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体结合，而不与其它组织细胞结合，达到肝特异性MRI增强成像的目的。采用血管粘附分子-1 (VCAM-I)特异性靶向肽构建的anti-VCAM-Ι-靶向SPIO 可以早期探查动脉粥样硬化病斑。靶向性USPIO是当前及将来SPIO的主要研发热点，由于其所具有的主动性特异靶向作用，应用范围将会被大大扩展，可发展为特定细胞、组织、 器官的靶向MRI造影剂，如肿瘤病灶探查、动脉粥样硬化病斑探查、干细胞移植体内发育示踪、细胞标记等。常规方法制备的葡聚糖表面修饰SPI0，因葡聚糖是依靠表面物理吸附作用包裹在 SPIO核心上，因此葡聚糖表面易从表面脱落，造成葡聚糖SPIO在生理溶液中稳定性差，不适合长期保存。
发明内容
本发明为了解决现有技术中存在的问题，提供一种靶向-葡聚糖-USPio复合粒子，葡聚糖在USPIO表面形成了具有网状结构的共聚物，不但稳定性增强，而且更适合多肽标记，本发明还提供此类网状交联葡聚糖表面修饰的氧化铁纳米粒的制造方法及其应用。本发明的靶向-葡聚糖-USPIO复合粒子，所述靶向-葡聚糖-USPIO复合粒子以USPIO为核心，外层包覆葡聚糖，记为Dextran-USPIO ；单分子葡聚糖上的羟基与环氧氯丙烷反应，通过醚键在葡聚糖上共价结合上环氧基，所述葡聚糖上的环氧基与另一单分子葡聚糖上的羟基反应，将所述外层的葡聚糖交联为网状聚合物，形成靶向-网状 Dextran-USPIO,记为靶向-CLN-Dextran-USPIO。优选的是在所述USPIO和葡聚糖之间还包覆一层油酸钠。优选的是所述USPIO的核心粒径为5-10nm，所述靶向-CLN-Dextran-USPIO的粒径为 15-50nm。优选的是所述USPIO的核心粒径为6-8nm，所述靶向-CLN-Dextran-USPIO的粒径为 20-30nm。优选的是所述复合粒子的靶向为Pl :GARYCRGDCFDG、P4 :ALNGREESP、P6 ARYCRGDCFDALNGREESP、P8 :GAPPRGALNGREESP 中的一种。采用环氧氯丙烷促使Dextran-USPIO表面的葡聚糖交联为网状聚合物，同时在 Dextran-USPIO表面引入活性的环氧基，以便靶向多肽的连接。从而提高了 Dextran在!^e3O4 粒子表面的结合牢度，增强USPIO的表面亲水性，加强复合粒子在水溶液中的分散稳定性， 减少其在体内的非特异性吸附。环氧氯丙烷与葡聚糖中羟基的反应机制是(1)活化反应(主反应)碱性条件下环氧氯丙烷同葡聚糖上羟基反应，通过醚键在葡聚糖上共价结合上环氧基。该末端游离的环氧基可作为多肽连接的活性反应基团，从而在CLN-Dextran-USPIO表面引入靶向多肽。(2)交联反应(副反应)碱性条件下，葡聚糖上的环氧基可以同另一单分子的葡聚糖的羟基反应，从而将葡聚糖交联为网状聚合物，经过交联反应，可以使葡聚糖交联聚合物稳定地包覆在USPIO表面。(3)其他副反应-水解反应环氧氯丙烷高温下长时间与碱液接触会逐步水解生成甘油。通过控制反应时间和pH值来控制主反应和副反应的发生程度，减少副反应 (3)的发生，从而既保证USPIO表面葡聚糖发生交联，生成具有网状葡聚糖表面修饰的 CLN-Dextran-USPIO，同时又保留了部分活性环氧基，用于后续的多肽配体联接。采用硫代硫酸钠滴定法测定环氧基的密度，在25°C时，将活化反应时间控制在 4-8小时比较合适，这样环氧基的密度较高，有利于下一步的偶联反应的进行。一种制造上述靶向-葡聚糖-USPIO复合粒子的方法，包括以下步骤(1)将USPIO悬浮液加入到15%的葡聚糖水中，在80°C的条件下搅拌60分钟，葡萄糖和溶液中四氧化三铁的比例为1 1-9 1，制备得到葡聚糖-USPIO复合粒子；(2)在pH值为11-13的碱性条件下，将纯化后的葡聚糖-USPIO复合粒子和环氧氯丙烷混合，其中，环氧氯丙烷水基磁流体(ν/ν)范围为1 20-1 4，在20-42°C的条件下反应2-8个小时，洗涤、重悬，得到环氧基活化的葡聚糖-USPIO复合粒子的水基磁流体；(3)将缓冲液和靶向多肽加入到环氧基活化的葡聚糖-USPIO复合粒子的水基磁流体中，室温震荡反应5个小时；所得即为靶向-CLN-葡聚糖-USPIO复合粒子。优选的是所述步骤(1)中葡萄糖和溶液中四氧化三铁的比例为7 1。优选的是所述步骤O)中反应温度为30°C，反应时间为3个小时。优选的是所述步骤(3)反应完毕后还可加入甘油，震荡反应8-16个小时。本发明还公开了一种肿瘤特异性MRI成像造影剂，包含上述的靶向-葡聚糖-USPIO复合粒子。考察靶向CLN-Dextran-USPIO对荷瘤裸鼠的磁共振成像效果，在动物水平上考察其血浆半衰期，研究其在动物体内各脏器的生物分布及代谢情况。结果表明 Dextran-USPIO的血浆半衰期约为2. 8hrs, CLN-Dextran-USPIO的血浆半衰期则约为 6. airs，这说明CLN-Dextran-USPIO的稳定性明显提高；同时，因其表面亲水性能的改变， 能够更好地逃避网状内皮系统的吞噬，是更好的肿瘤特异性成像造影剂。荷瘤裸鼠磁共振成像实验表明肿瘤/非瘤组织之间的MR信号为1. 83倍，能够在磁共振图像上更好地显示出5mm以下的肿瘤，具有较大的应用价值。对Target-CLN-Dextran-USPIO的实验动物组织分布和药物代谢研究表明=Target-CLN-Dextran-USPIO可以在肿瘤中特异性浓聚，且主要通过肝脏，脾脏和肾脏进行代谢。本发明的有益效果是本发明采用了环氧氯丙烷法制备了一种具有网状交联葡聚糖表面修饰的 USPIO(Cross-linked Network-USPIO, CLN-Dextran-USPIO)复合粒子，葡聚糖在USPIO表面形成了具有网状结构的共聚物，不但稳定性增强，而且更便于和靶向多肽进行结合。同时解决了网状交联、多肽标记这两个问题，优选的是后期又加入了甘油，残余环氧基同甘油反应，使甘油分子结合在纳米粒上，从而进一步改善纳米粒表面亲水性。通过实验研究表明CLN-Dextran-USPIO具有更好的表面亲水性，其在水相中的稳定性也明显改善。采用普鲁士兰染色法和铁标准曲线测定法测定本发明的复合粒子同肿瘤细胞的体外结合，表明Target-CLN-Dextran-USPIO具有更好的结合能力，荷瘤裸鼠实验也表明该种 Target-CLN-Dextran-USPIO在肿瘤MRI成像诊断方面具有潜在的应用价值。
图1为本发明中油酸钠-纳米狗304的Tg-DSC图。图2为本发明中油酸钠-纳米Fe53O4的透射电镜照片。图3为本发明中油酸钠-纳米!^e3O4的XRD图。图4为本发明中油酸钠-纳米Fe53O4的红外谱图。图5为本发明中葡聚糖-USPIO的红外图谱。图6为本发明中靶向-CLN-Dextran-USPIO的环氧化交联反应的红外光谱图。图7为本发明中靶向-CLN-Dextran-USPIO的环氧氯丙烷处理接多肽的红外光谱图。图8为本发明的靶向-CLN-Dextran-USPIO的SEM投射电镜照片。图9为本发明的靶向-CLN-Dextran-USPIO的体外HUVEC细胞结合实验对比图。图10为本发明的靶向-CLN-Dextran-USPIO结合细胞后的铁含量对比图。图11为本发明的靶向-CLN-Dextran-USPIO的血浆半衰期的测定图。图12-13为本发明的靶向-CLN-Dextran-USPIO在荷瘤裸鼠体中的磁共振成像及其组织分布图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。下文中，超微型超顺磁性氧化铁纳米微粒为USPIO(Ultrasmall Superparamagnetic IronOxide)；葡聚糖-USPIO 为 Dextran-USPIO ；网状葡聚糖-USPIO 为 CLN-Dextran-USPIO(Cross-1inked Network-Dextran-USPI0)；和配体结合后的 CLN-Dextran-USPIO 为靶向-CLN-Dextran-USPIO，也可记为 Target-CLN-Dextran-USPIO。实施例1靶向杂合多肽的合成采用固相多肽合成法合成多肽，合成的4个靶向多肽的氨基酸序列分别为Pl GARYCRGDCFDG ；P4 :ALNGREESP ；P6 :ARYCRGDCFDALNGREESP ；P8 :GAPPRGALNGREESP。合成在 FMOC-Tyr-Wang-Resin树脂上完成，树脂溶涨和脱保护后，采用Fmoc保护氨基酸，依照标准的HBTU+NMM或DIC+H0BT缩合法依次进行氨基酸耦联。缩合完成后切割洗涤。合成后进行氧化环化。SHIMADZU高效液相色谱仪进行纯化。鉴定采用质谱仪。样品密封后_20°C保存。 本发明采用的多肽PI、P4、P6、P8购买自上海辉瑞生物科技有限公司。实例2油酸钠-Dextran-USPIO的制备首先配制i^eCl2/FeCl3混合液和NaOH溶液，各物质用量下表所示
权利要求
1.一种靶向-葡聚糖-USPIO复合粒子，其特征是所述靶向-葡聚糖-USPIO复合粒子以USPIO为核心，外层包覆葡聚糖，记为Dextran-USPIO ；单分子葡聚糖上的羟基与环氧氯丙烷反应，通过醚键在葡聚糖上共价结合上环氧基，所述葡聚糖上的环氧基与另一单分子葡聚糖上的羟基反应，将所述外层的葡聚糖交联为网状聚合物，再通过网状交联葡聚糖表面的环氧基，连接上靶向多肽，形成靶向-网状Dextran-USPIO，记为靶向-CLN-Dextran-USPIO。
2.根据权利要求1所述的复合粒子，其特征是在所述USPIO和葡聚糖之间还包覆一层油酸钠。
3.根据权利要求1所述的复合粒子，其特征是所述USPIO的核心粒径为5-lOnm，所述靶向-CLN-Dextran-USPIO 的粒径为 15_50nm。
4.根据权利要求3所述的复合粒子，其特征是所述USPIO的核心粒径为6-8nm，所述靶向-CLN-Dextran-USPIO 的粒径为 20_30nm。
5.根据权利要求1所述的复合粒子，其特征是所述复合粒子的靶向为Pl GARYCRGDCFDG、P4 :ALNGREESP、P6 :ARYCRGDCFDALNGREESP、P8 :GAPPRGALNGREESP 中的一种。
6.一种制造如权利要求1所述的靶向-葡聚糖-USPIO复合粒子的方法，其特征在于 包括以下步骤(1)将USPIO悬浮液加入到15%的葡聚糖水溶液中，在80°C的条件下搅拌60分钟，葡萄糖和溶液中四氧化三铁的比例为1 1-9 1，制备得到葡聚糖-USPIO复合粒子；(2)在pH值为11-13的碱性条件下，将纯化后的葡聚糖-USPIO复合粒子和环氧氯丙烷混合，其中，环氧氯丙烷水基磁流体(v/V)范围为1 20-1 4，在20-42°C的条件下反应2-8个小时，洗涤、重悬，得到环氧基活化的葡聚糖-USPIO复合粒子的水基磁流体；(3)将缓冲液和靶向多肽加入到环氧基活化的葡聚糖-USPIO复合粒子的水基磁流体中，室温震荡反应5个小时；所得即为靶向-CLN-葡聚糖-USPIO复合粒子。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征是所述步骤(1)中葡萄糖和溶液中四氧化三铁的比例为7 1。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征是所述步骤( 中反应温度为30°C，反应时间为3个小时。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征是所述步骤C3)反应完毕后还可加入甘油，震荡反应8-16个小时。
10.一种肿瘤特异性MRI成像造影剂，包含如权利要求1-5任一项所述的靶向-葡聚糖-USPIO复合粒子。
全文摘要
本发明公开了一种靶向-葡聚糖-USPIO复合粒子及其制造方法和应用，所述靶向-葡聚糖-USPIO复合粒子以USPIO为核心，外层包覆葡聚糖，记为Dextran-USPIO；单分子葡聚糖上的羟基与环氧氯丙烷反应，通过醚键在葡聚糖上共价结合上环氧基，所述葡聚糖上的环氧基与另一单分子葡聚糖上的羟基反应，将所述外层的葡聚糖交联为网状聚合物，形成靶向-网状Dextran-USPIO。葡聚糖在USPIO表面形成了具有网状结构的共聚物，不但稳定性增强，且表面亲水性也大为改善，通过实验研究表明CLN-Dextran-USPIO具有更好的表面亲水性，其在水相中的稳定性也明显改善，网状葡聚糖交联葡聚糖修饰层的存在使得此复合粒子和肿瘤细胞具有更好的结合能力，荷瘤裸鼠实验也表明其在肿瘤MRI成像诊断方面具有潜在的应用价值。
文档编号A61K49/18GK102397565SQ20111034139
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月2日 优先权日2011年11月2日
发明者史景云, 吴秋芳, 张霖倩, 粟波, 赵印敏, 陈晋, 陈雪梅 申请人:上海华明高技术(集团)有限公司, 上海市肺科医院