稳定的生长激素化合物的制作方法

专利名称：稳定的生长激素化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗蛋白水解性降解的稳定的生长激素(GH)化合物。
背景技术：
生长激素(GH)是一种由哺乳 动物垂体前叶分泌的多肽激素。依物种而定，GH是一种由大约190个氨基酸残基组成的蛋白质，对应分子量约为22 kDa。GH与细胞表面受体即GH受体(GHR)结合，并通过GH受体发出信号。GH在促进生长、保持正常身体组成、合成代谢和脂质代谢中起关键作用。它还对中间代谢具有直接作用，例如葡萄糖摄取降低、脂解作用(Iipolysis)增加、氨基酸摄取和蛋白质合成增加。该激素还对其它组织发挥作用，包括脂肪组织、肝、肠、肾、骨骼、结缔组织和肌肉。重组hGH已有生产且可市售获得，例如Genotropin (Pharmacia Upjohn)、Nutropin 和 Protropin (Genentech)、Humatrope (Eli Lilly) > Serostim (Serono)、诺地托品(Novo Nordisk)、Omnitrope (Sandoz)、Nutropin Depot (Genentech和Alkermes)。另外,在N末端具有额外甲硫氨酸残基的类似物还以例如 Somatonorm (Pharmacia Upjohn/Pfizer)销售。GH与蛋白质GH家族的其它成员催乳素(PRL)和胎盘催乳激素(PL)有共同的拓扑结构。GH被归类为4螺旋束蛋白质(图I)，显示具有两个保守的二硫键的“上-上-下-下(up-up-down-down) ”拓扑结构。具体而言,野生型人GH (hGH)由191个氨基酸残基组成，并在53、165、182和189位上具有4个半胱氨酸残基，其通过形成分别连接C53与C165和C182与C189的2个分子内二硫键而稳定蛋白质的三维结构(图I)。通过X射线晶体学实验性地测定了以下的hGH结构游离形式(Chantalet L.等(1995) Protein and PeptideLetters 3,333-340)和与其结合蛋白(人GHR (hGHR)的胞外结构域)的复合物(Devos，A. M.等(1992) Science 255,306-312)。这些结构已保藏在蛋白质数据库(PDB)中，并且是可公开获取的(PDB登录代码分别为IHGU和1HWG)。因此，根据已发表的hGH结构，可鉴定出对于hGH与hGHR结合重要的残基。此外，通过核磁共振(NMR)波谱术研究了 hGH的动力学特性(Kasimova M. R.等.J. Mol. Biol. (2002) 318,679-695)。联合地，X 射线和NMR数据可区分结构化良好和定义明确的hGH的区域与结构化较少并且是动态的区域。预期hGH的较少结构化的动态区特别易遭蛋白酶剪切，该区域的适当稳定可导致蛋白水解稳定性改进。已对hGH进行大量诱变以试图产生具有所需化学或生物性质的hGH类似物。具体而言，已描述了用于若干目的的半胱氨酸突变体。US 2003/0162949公开了 GH超基因家族成员的半胱氨酸变体。提供用于产生这些蛋白质的位点特异性的生物活性缀合物的通用方法。所述方法包括将半胱氨酸残基加到蛋白质的非必需区或采用定点诱变用半胱氨酸残基取代蛋白质中的非必需氨基酸，然后通过所加入的半胱氨酸残基，将半胱氨酸反应性聚合物或其它类型的半胱氨酸反应性部分与蛋白质共价偶联。WO 02/055532描述了遗传工程改造的具有至少一个共价连接的非多肽部分的hGH突变体，特别是其中所引入的半胱氨酸残基被用于聚乙二醇化的hGH突变体。
US 5,951,972描述了有生理活性的衍生化天然和重组的哺乳动物和人蛋白质和多肽，其中蛋白质内至少一个天然存在的或掺入的半胱氨酸残基用各种取代基衍生化。详细研究了 hGH的蛋白酶剪切。由残基128-154组成的长环具有例如以下几种蛋白酶的推定的切割位点凝血酶、纤维蛋白溶酶、胶原酶、枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。因此，该部分的hGH显示特别易受蛋白酶剪切影响(Lewis,U. J. Ann.Rev. Physiol. (1984.) 46，33_42)。已报道的降解hGH的酶包括凝血酶、纤维蛋白溶酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和激肽释放酶。已对大鼠组织中的hGH降解进行了研究(Garcia-Barros等.J. Endocrinol.Invest. (2000) 23,748-754)。发现在大鼠甲状腺中，有利于在大型和亲脂性氨基酸残基处切割的胰凝乳蛋白酶样蛋白酶首先切割Y143和S144之间的肽键，产生2链分子，接着在Y42和S43之间切割，释放N端肽F1-Y42。再通过胰凝乳蛋白酶样蛋白酶在F146和D147之间切割并再通过羧肽酶的作用，加工2链分子中的裂解环(split loop) o 已报道了产生对蛋白水解性降解稳定的hGH类似物的几种方法。Alam等人(J. Biotech. 65,183-190 (1998))通过特异性点突变，设计了抗凝血酶和纤维蛋白溶酶的hGH突变体。凝血酶特别在R134和T135之间切割hGH，双重突变体R134D, T135P产生抗凝血酶切割的hGH变体，而三重突变体R134D，T135P, K140A产生纤维蛋白溶酶抗性。此外，后一种hGH突变体具有在7天时间内抗人血浆蛋白酶解的抗性。EP534568描述了通过使R134突变成丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或组氨酸而对蛋白水解性降解稳定的hGH突变体。W02004022593/Nautilus描述了通用的高通量定向进化方法，以产生蛋白水解稳定性提高的修饰细胞因子(包括GH变体)。W02006048777/Nautilus特别描述了蛋白水解稳定性改进的修饰的hGH类似物。类似物在 1-55、57、58、60-63、67-87、89-91、93、95-100、102-128、131-132、135-139、141、142、144、148-182、184、185和187-191位含有1_5个突变。半胱氨酸残基的引入可能导致形成不需要的二硫键连接的二聚体，在W02006048777的范围明确不包括氨基酸残基被半胱氨酸取代；在102006048777 (第65页)中阐述“明确避免氨基酸被半胱氨酸残基置换，因为这种改变可能导致形成分子间二硫键”。显然需要开发抗蛋白水解性降解的hGH化合物。这种稳定化合物对蛋白酶剪切应显示出提高的稳定性，同时保持所需的hGH的生物学性质。这种GH分子应提高稳定性、降低清除率和/或延长体内半衰期。此外，蛋白质治疗剂通常需要静脉内或皮下给予，因为其通常不能通过口服而充分利用。蛋白质口服生物利用度低部分是由于胃肠道中的蛋白水解性降解所致。因此，还需要开发可以口服给予以治疗hGH相关病症的hGH化合物。发明概述
本发明涉及生长激素化合物，所述化合物与人生长激素相比，包含一个或多个额外的二硫键和至少一个额外的单点突变。在本发明的GH化合物中，通过将野生型hGH序列中的至少一个氨基酸突变成半胱氨酸而引入至少一个额外的半胱氨酸残基。在本发明的GH化合物中，以一定方式选择一个或多个突变位点，使得(I)将所引入的一个或多个半胱氨酸残基适当置于折叠的蛋白质的三维结构中，以允许形成不存在于野生型蛋白质中的一个或多个额外的二硫键，(2)不破坏hGH的天然结构，(3)与野生型hGH相比，GH化合物对于蛋白酶剪切的稳定性提高或其它功能增强，和(4) GH化合物保持所需的与野生型hGH相关的生物活性。在胃肠道中抗蛋白水解性降解的hGH的这类二硫化物变体可被开发作为口服给予的用于治疗hGH相关病症的药物。附图
简述
图I :与2拷贝hGH结合蛋白结合的hGH的结构(PDB IHWG)。hGH中4个主要螺旋以暗灰色显示，标为m-H4。方向(N — C端)用箭头标示。hGH的N端和C端分别标为N和C。分别连接C53与C165和C182与C189的2个二硫键用黑色棒与球表示。还标记了 L128和D154,分别表不连接H3和H4的长的柔性环中的第一个和最后一个残基。图2 :具有突出显示并标记的4个主要螺旋(H1-H4)的hGH的野生型氨基酸序列。还标记了连接主要螺旋的3个环(L1-L3)。螺旋定义(helix definition)是指与其结合蛋白复合的 hGH (PDB 1HWG)。
定义
在本文中，词语“人生长激素(hGH) ”、“hGH wt"和“野生型hGH wthGH) ”可互换使用，均是指具有SEQ ID No. I的氨基酸序列的蛋白质。在本文中，术语“肽”和“多肽”可互换使用，意欲表示相同含义。术语“肽”或“多肽”欲表示由肽键连接的两个或更多个氨基酸的序列，其中所述氨基酸可以是天然的或非天然的。组分氨基酸(constituent amino acid)可来自由遗传密码编码的氨基酸的组，它们可以是并非由遗传密码编码的天然氨基酸和合成氨基酸。非遗传密码编码的天然氨基酸例如Hyp (轻脯氨酸)、Y -羧基谷氨酸(y-carboxyglutamate)、Orn (鸟氨酸)、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括化学合成法制备的氨基酸，例如由遗传密码编码的氨基酸的D-异构体，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aad (a -氨基己二酸)、Aib ( a -氨基异丁酸)、Abu (a-氨基丁酸)、Agl ( a -氨基甘氨酸)、Asu ( a -氨基辛二酸)、Cha ( P -环戍基-丙氨酸)、Chg (环己基甘氨酸)、Dab ( a，y - 二氨基丁酸)、DapU，￠-二氨基丙酸)、Hcy (高半胱氨酸)、Hpr (高脯氨酸)、Nle (正亮氨酸)、Phg (苯甘氨酸)、Hph (闻苯丙氨酸)、INal ( P-(I-萘基-丙氨酸)、2Nal (￠-(2-萘基-丙氨酸)、2Pal (-(2-吡啶基)-丙氨酸、3Pal ( P _ (3_吡啶基)-丙氨酸)、Pip (4-氨基-哌啶-4-羧酸)、Pra (炔丙基-甘氨酸)、Pyr (焦谷氨酸)、Gla ( Y -羧基-谷氨酸)、Hci(高瓜氨酸)、Nva (正缬氨酸)、ne (叔丁基甘氨酸)、￠-丙氨酸、3-氨基甲基苯甲酸和邻氨基苯甲酸。该术语还包括术语“蛋白质”，其可由一条多肽链组成，或者由通过非共价或共价相互作用(例如半胱氨酸桥)连接在一起的两条或更多条多肽链组成。要理解的是，该术语还欲包括这样的肽，除包含额外的二硫键以外，例如还通过例如但不限于以下部分与肽的侧链或主链连接而被衍生化PEG、碳水化合物、脂肪酸、白蛋白结合剂、烷基链、亲脂基团、维生素、胆汁酸或间隔物(spacer)。术语肽包括任何合适的肽，并且可与术语多肽和蛋白质作为同义词使用，除非另有说明或与上下文抵触，只要读者认识到，各种含有氨基酸聚合物的分子的各个类型可能与显著差异有关，从而构成本发明的各个实施方案(例如由多个多肽链组成的肽例如抗体显著不同于例如单链抗体、肽免疫黏附素或单链免疫原性肽)。因此，本文的术语肽一般应理解为是指任何合适大小和组成(就氨基酸的数目和蛋白质分子中相关链的数目而言)的任何合适的肽。此外，本文所述肽可包含非天然存在的和/或非L氨基酸残基，除非另有说明或与上下文抵触。除非另有说明或与上下文抵触(且如果作为术语多肽和/或蛋白质的各个实施方案论述时)，否则术语肽还包括衍生化肽分子。衍生化肽分子是这样的肽分子，其中肽的一个或多个氨基酸残基被化学修饰(例如通过烷基化、酰化、酯形成或酰胺形成)或与一个或多个非氨基酸有机和/或无机原子或分子取代基(例如聚乙二醇(PEG)基团、亲脂性取代基(其任选可通过间隔物残基或基团例如P -丙氨酸、Y -氨基丁酸(GABA)、L/D-谷氨酸、琥珀酸等与肽的氨基酸序列连接)、荧光团、生物素、放射性核素等)缔合，并且衍生化肽分子可另外或备选地包含非必需的、非天然存在的和/或非L氨基酸残基，除非另有说明或与上下文抵触(然而，还应认识到，这种衍生物本身且独立地被视为本发明的独立特征，肽的含义中包括这类分子是为了便于描述本发明，并非意味着裸肽和这种衍生物之间有任何某种的等同性)。这类氨基酸残基的非限制性实例包括例如2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、P -丙氨酸、3 -氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、 3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、锁链素、2，2’ -二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、炔丙基-甘氨酸和抑制素(statine)卤化的氨基酸。本发明所述“化合物”可以是“蛋白质”或“肽”或“多肽”，不论其修饰方式，其均可以是保持所需要的类似于WthGH的生物活性的“类似物”或“衍生物”或“变体”。当指多肽时本文所用术语“类似物”或“变体”，意指所述肽的修饰形式，其中肽的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代和/或其中一个或多个氨基酸残基从肽中缺失，和/或其中一个或多个氨基酸残基被添加至肽中。氨基酸残基的这类取代或添加或缺失可发生在肽的N端和/或肽的C端和/或肽的N端或C端之间。未规定旋光异构体的所有氨基酸要理解为意指L-异构体。术语“二硫键”或“二硫桥”可互换使用，意欲表示相同含义。在半胱氨酸残基的疏基之间形成蛋白质中的“~■硫键”或“_■硫桥”。术语“额外的半胱氨酸”或“引入的半胱氨酸”可互换使用，意欲表示相同含义。该术语欲包括不存在于野生型hGH中的半胱氨酸残基。为了使结构变化降到最小，通常通过一个或多个氨基酸残基的取代引入一个或多个半胱氨酸残基，以此保持hGH的长度。在环部分中或在螺旋的边界(boarder)可容许额外cys残基的插入,但在螺旋内引入cys残基不太有吸引力。术语“额外的二硫键”或“引入的二硫键”可互换使用，意欲表示相同含义。该术语欲包括在两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键，其中至少一个半胱氨酸残基不存在于野生型hGH中。本文所用术语“额外的单点突变”表示突变(与SEQ ID NO I限定的hGH相比)，其与引入到生长激素化合物中的形成二硫桥的额外半胱氨酸无关。术语“额外的单个cys突变”可用来指引入半胱氨酸残基的点突变。这类突变可以是“额外的单点突变”或甚至是hGH中的更多突变。本文所用术语“衍生物”是指肽或多肽，其中肽的一个或多个氨基酸残基通过将聚合物(例如PEG)、碳水化合物部分、白蛋白结合剂、脂肪酸、亲脂基团、维生素、胆汁酸或间隔物引入生长激素化合物的侧链或主链而进行化学修饰。化学修饰在性质上也可以是暂时的，即其可容易地在体内除去。例如可通过细胞本身或通过在表达后在肽上进行化学修饰，在翻译后引入化学修饰。
本领域所知术语“同一性”是指两个或更多个肽序列间的关系，这通过比较序列来确定。本领域中，“同一性”还指肽之间序列相关性的程度，这通过两个或更多个氨基酸残基的串(string)之间的匹配数目确定。“同一性”测量两个或更多个序列之间相同匹配的百分比，这用由具体的数学模型或计算机程序(即“算法”)得出的缺口比对(如果有的话)来进行。可以通过已知方法容易地计算出相关肽的同一性。这类方法包括但不限于描述于以下文献的方法〖Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.,主编，Oxford University Press, New York, 1988 ；Biocomputing: Informatics and GenomeProjects, Smith, D. ff.,主编，Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysisof Sequence Data,第 I 部分，Griffin, A. M.和 Griffin, H. G.,主编，HumanaPress, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.,Academic Press, 1987 ；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. ^PDevereux, J.,主编，M. Stockton Press, New York, 1991 ;以及 Carillo 等，SIAM J. Applied Math.48, 1073 (1988)。设计了确定同一性的优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。确定同一性的方法在可公开获取的计算机程序中描述。确定2个序列之间同一性的优选计算机程序方法包括 GCG 程序包，包括 GAP (Devereux 等，Nucl. Acid. Res. j_^，387 (1984) ；GeneticsComputer Group, University of Wisconsin, Madison, ffis.)、BLASTP> BLASTN 和 FASTA(Altschul 等，J. Mol. Biol. 215,403-410 (1990))。BLASTX 程序可公开获自美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)和其它来源(BLAST 手册，Altschul 等 NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894 ；Altschul 等，同上)。众所周知的Smith Waterman算法也可用于确定同一丨丨生。例如，运用计算机算法GAP (Genetics Computer Group, University ofWisconsin, Madison, Wis.),针对其相应氨基酸的最佳匹配,对待确定序列同一1丨生百分比的两个肽进行比对(“匹配跨度(matched span) ”，由算法确定)。缺口开放罚分(gapopening penalty)(经计算为平均对角线(average diagonal)的三倍；“平均对角线”是所用比较矩阵对角线的平均值；“对角线”是通过具体比较矩阵赋予每个完全匹配氨基酸的分值或数目)，缺口延伸罚分(其通常为{分数(1/10)}乘以缺口开放罚分)以及比较矩阵(例如PAM 250或BLOSUM 62)与算法结合使用。算法还利用了标准比较矩阵(对于PAM250 比较矩阵参见 Dayhoff 等，Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, (1978)；对于 BLOSUM 62 比较矩阵参见 Henikoff 等，PNAS USA 89,10915-10919 (1992))。肽序列比较的优选参数包括下列参数
算法Needleman 等，J. Mol. Biol. 48,443-453 (1970);比较矩阵Henikoff 等，PNAS USA 型，10915-10919 (1992)的 BLOSUM 62 ;缺口罚分12，缺口长度罚分4，相似性阈值
具有上述参数的GAP程序是有用的。运用GAP算法，上述参数对于肽比较是默认参数(连同末端缺口无罚分)。术语“蛋白酶”意欲包括具有催化肽键水解切割能力的所有酶。蛋白酶可以是胞内、胞外或膜结合的蛋白酶、蛋白水解酶或肽酶，并包括哺乳动物肠腔的蛋白酶和哺乳动物血浆中存在的蛋白酶。蛋白酶可以是内切蛋白酶和外切蛋白酶两种类型。术语“抗蛋白水解性降解”或“对蛋白水解性降解的稳定性提高”或“对蛋白酶剪切的稳定性提高”或“蛋白水解稳定性改进”或“蛋白水解稳定性”可互换使用，意欲表示相同含义。如果与本发明的hGH化合物联用，则该术语意欲表示与野生型hGH相比，所述hGH化合物的多肽链在特定情况下以较慢的速度被蛋白酶剪切。蛋白质的蛋白酶剪切速度可通过本领域技术人员已知的几种技术测定。测量hGH 或hGH化合物降解速率的测定法的实例描述于实施例5。本发明还涉及可用于改进hGH化合物的药理性质的方法。这些药理性质可为例如延长功能性体内半衰期、血浆体内半衰期、平均滞留时间、降低肾清除率。术语“功能性体内半衰期”以其标准意义使用，即达到肽(例如生长激素化合物)的50%生物活性的时间，其中生长激素化合物仍然存在于机体/靶器官中，或肽(例如生长激素化合物)的活性是其起始值的50%时的时间。作为测定功能性体内半衰期的备选方法，可测定“体内血浆半衰期”和延长作用，即在被清除前50%的肽在血流中循环的时间。血浆半衰期的测定通常比测定功能性半衰期更简单，血浆半衰期的大小常常是功能性体内半衰期大小的良好指示物。发明详述
本发明涉及GH化合物，与hGH相比，所述化合物具有一个或多个额外的二硫键和至少一个额外的单点突变。在半胱氨酸对之间形成二硫键，其中通过点突变将一个或两个半胱氨酸引入野生型hGH序列中。选择突变位点，使得所引入的半胱氨酸残基适当位于折叠蛋白质的三维结构中以允许形成二硫键。可通过合适的宿主生物表达可溶形式的hGH的合适半胱氨酸突变体，或采用生长激素化合物的标准再折叠条件从包涵体中回收，获得具有额外二硫键的折叠蛋白质，这是本领域技术人员众所周知的(Cabrita和Bottomley,Biotechnology Annual Review 10, 31-50 (2004))。用于引入额外二硫键的候选位置的鉴定可用计算方法辅助，例如使用实验测定的与其2拷贝结合蛋白复合的hGH (PDB登录代码1HWG)的三维结构。引入二硫键的合适位置的选择可基于以下文献所述二硫键的距离和几何标准Dombkowski A. , A. , Bioinformatics 19, 1852-1853 (2003)和 Petersen 等，Protein Eng. J_2，535-548 (1999)。选择这样的半胱氨酸突变体，使得引入的二硫键不破坏蛋白质的天然结构，并且对与hGH有关的所需要生物活性具有最小的负面影响。因此，构建这样的化合物，使得引入的二硫键不损害与hGHR的相互作用。已从IHWG中鉴定出对受体相互作用重要的hGH区。因此，可通过分析IHWG结构，指导引入二硫键的合适位置(其对生物活性而言是中性的)的选择。可选择这样的半胱氨酸突变体，使得引入的二硫键提供对蛋白酶剪切的稳定性提高。蛋白质对蛋白酶切割的敏感性部分由所述蛋白质的一级氨基酸序列确定。蛋白酶可以是相对无特异性的，或者可以以可变的选择性程度识别一级氨基酸序列中的特定基序。然而，用作底物的蛋白质分子的三维结构和动力学强烈影响蛋白水解稳定性。高度柔性和动态的环结构特别易受蛋白酶催化的切割的影响，而结构化良好的区域一般不太如此。因此，可通过引入二硫键稳定蛋白质的动态区，来获得保护以免于蛋白酶剪切。本发明的一个方面涉及生长激素化合物，与SEQ ID NO I限定的hGH相比，所述生长激素化合物包含一个或多个额外的二硫键和至少一个额外的单点突变。如下文中所述，本发明的生长激素化合物的多肽优选与由SEQ ID NO I确定的人生长激素具有高水平的同一性。因此，本发明的一个实施方案提供稳定的GH化合物，通过将一个或多个额外的二硫键引入由SEQ ID No. I限定的hGH中而使所述化合物抗蛋白水解性降解。在一个实施方案中，生长激素化合物对于下文中进一步描述的蛋白酶解是稳定的。在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物的蛋白水解稳定性通过将二硫键引入环区段和螺旋结构之间而实现。
在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物的蛋白水解稳定性通过将二硫键引入环区段内而实现。在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物的蛋白水解稳定性通过将二硫键引入环区段之间而实现。 在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物的蛋白水解稳定性通过将二硫键引入螺旋之间而实现。在本发明的一个实施方案中，至少一个引入的二硫键连接生长激素化合物的2个半胱氨酸残基，其中至少一个所述半胱氨酸残基不存在于野生型hGH中。在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物的引入的二硫键位于采用以下文献描述的距离和几何标准而选择的半胱氨酸残基之间Dombkowski A., A.,Bioinformatics 19, 1852-1853 (2003)和 Petersen 等，ProteinEng. 12(7)，535-548(1999)。在本发明的一个实施方案中，生长激素化合物的引入的二硫键使连接H3和H4的环(L3，残基128-154)稳定，即引入的二硫键中的至少一个半胱氨酸位于包含残基128-154的区段中(图I和2)。如上所述，本发明涉及生长激素化合物，其包含连接多肽的环区段和螺旋区段或在多肽的环区段内或连接多肽的环区段或连接多肽的螺旋区段的额外的二硫键。任何这类额外的二硫键的定位均是为了参照SEQ ID NO I限定的hGH多肽描述的本申请的目的。提供连接螺旋、环和环与螺旋的键(linkage)的cys突变的非限制性实例列举在下表I中。表I
权利要求
1.生长激素化合物，所述化合物与由SEQID NO I限定的人生长激素(hGH)相比，包含一个或多个额外的二硫键和至少一个额外的单点突变。
2.权利要求I的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含一个或多个连接环区段与螺旋区段的额外的二硫键。
3.前述权利要求中任一项的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应于 SEQ ID NO I 中的 R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/1138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C 和 / 或 V185C/S188C。
4.权利要求1-3中任一项的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含一个或多个额外的二硫键，其中其至少一个半胱氨酸存在于对应于SEQ ID NO I的AA 128-154的环3 (L3)中。
5.权利要求4的生长激素化合物，其中所述生长激素化合物包含一个或多个连接L3与螺旋2 (H2)或环I (LI)的额外的二硫键。
6.权利要求3的生长激素化合物，其中所述化合物包含至少一对突变，所述突变对应于 SEQ ID NO I 中的 H21C/M170、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C 和 / 或 R94C/D107C。
7.前述权利要求中任一项的生长激素化合物，其中与由SEQID NO I限定的人生长激素(hGH)相比，所述生长激素化合物的蛋白酶稳定性提高。
8.前述权利要求中任一项的生长激素化合物，其中至少一个额外的单点突变存在于对应于 SEQ ID NO I 的 1-55、57、58、60-63、67-87、89-91、93、95-100、101、102-128、131-132、135-139、141、142、144、148-182、184、185 和 / 或 187-191 位的一个或多个位置。
9.前述权利要求中任一项的生长激素化合物，其中至少一个额外的单点突变存在于对应于 SEQ ID NO I 的 40、41、42、55、57、62、101、134、136、139、142 和 / 或 144 位的位置。
10.前述权利要求中任一项的生长激素化合物，其中至少一个额外的单点突变存在于LI (对应于 SEQ ID NO I 的 AA 36-71)和 / 或 L3 (对应于 SEQ ID NO I 的 AA 128-154)中。
11.前述权利要求中任一项的生长激素化合物，其中至少一个额外的单点突变存在于LI的中区(对应于SEQ ID NO I的AA 40-65)和/或L3的中区(对应于SEQ ID NO I的AA 135-148)。
12.前述权利要求中任一项的生长激素化合物，其与SEQID NO I限定的人生长激素相t匕，包含正好I个额外的二硫键和至少一个额外的单点突变。
13.13.用于制备具有对蛋白水解性降解的稳定性提高的生长激素化合物的方法，所述方法包括以下步骤 a.与SEQ ID No. I限定的人生长激素(hGH)相比，在所述生长激素化合物中引入一个或多个额外的二硫键和至少一个额外的单点突变。
14.药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项的生长激素化合物和一种/多种药学上可接受的载体。
15.治疗其中患者获益于循环生长激素化合物的量增加的疾病或状态的方法，所述方法包括给予患者有效量的权利要求1-12中任一项的生长激素化合物或权利要求14的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及生长激素(GH)化合物，所述化合物具有额外的二硫键和至少一个额外的单点突变，使得所述化合物具有蛋白水解性降解抗性。
文档编号A61P5/00GK102834109SQ201180006742
公开日2012年12月19日 申请日期2011年1月24日 优先权日2010年1月22日
发明者H.德穆特, C.B.S.希奥特, L.诺斯科夫-劳里森, J.陈, P.泰格森 申请人:诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司