专利名称：一种预测多发性硬化症接受治疗者的治疗反应的方法
技术领域：
本发明涉及用于预测多发性硬化症(MS)接受治疗者的治疗反应的方法，尤其涉及根据差别化表达的遗传标记物预测MS受治疗者对于IFN-P治疗反应的方法。
背景技术：
多发性硬化(MS)是中枢神经系统的一种炎性疾病。全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study)已证实了免疫系统基因与MS疾病易感性相关,该结论与MS发病机理中免疫机制的作用吻合。业已证实I型干扰素(IFN)生物利用率的增强与各种自身免疫疾病的易感性或严重性相关。业已在大约50%未治疗的MS受治疗者体内检测到I型IFN-调控基因(IRGs)的增强表达，并且，这一现象曾被解释为一类先天性免疫增强的受治疗者的特征。I和II型IFNs调控重叠类型的IRGs。尽管I型IFN是先天性免疫的主要介体，而II型IFN同时参与了先天性和获得性免疫。尽管用IFN-Y作为MS的治疗剂的临床试验没有取得成功，但是I型IFN的临床试验仍在继续，并且若干重组干扰素-P (IFN-^ )产品已被批准用于MS治疗。在上述试验中，IFN-P可降低复发率30%，并且通过磁共振成像目测观察发现，IFN-^抑制了脑损伤形成。然而，不同个体的临床反应不同，并且，其作用机理尚不清楚。随后对所述阶段的三次试验之一的post-hoc数据进行分析发现，大约20%的IFN-^受体被确定为不敏感者(Poor Responder, PR)。不敏感状态已被划分为药理学类型(SP，与IFN-P中和抗体的生成相关)或药物基因组学(即，与IFN-P受体或信号传导成分中的遗传学变体相关)类型。所述受治疗者普遍具有较低的IFN-3生物利用率。尽管该机理明确，但这样的受治疗者仅占PRs受治疗者的少数。在第三类也是最大的类型中，IFN-3的PR群体可能与IFN-P反应的性质相关，这提供了有关一类MS受治疗者发病机理的信息。个体候选基因的基于微阵列的断面表达分析(Microarray-based Cross-sectionalExpression Analyses)和研究支持上述观点。不过，上述所有临床和放射学可变因素都受限于其预测疾病后果的能力，特别是在MS的早期阶段。这种对疾病后果预测的不确定性，意味着某些需要侵入性治疗的MS受治疗者不会接受这种治疗，而其他不必要治疗的受治疗者可能在没有合理根据的前提下因接受侵入性治疗而承受各种副作用所带来的风险
发明内容
本发明总体上涉及用于预测多发性硬化症(MS)接受治疗者的治疗反应的方法，尤其涉及一种根据差别化表达的遗传标记物(Differentially Expressed GeneticMarkers),预测MS受治疗者对干扰素-P (IFN- ^ )治疗的反应的方法。根据本发明的一个方面，提供了一种用于测定所述IFN-P治疗MS受治疗者的效力的方法。所述方法的一个步骤可以包括从所述受治疗者体内获得生物学样品。在获得所述生物学样品之后，可以测定所述至少一种干扰素-调控基因(IRG)或其变体的表达水平。与对照试验相比，所述至少一种IRG或其变体的表达的增强或减弱，可以表明所述受治疗者对于IFN-P治疗的不敏感(respond poorly)。根据本发明的另一方面，提供了一种筛选可用于治疗MS的药剂的方法。所述方法的一个步骤，可以包括提供有关来自对IFN-P治疗不敏感的MS受治疗者的外周血单核细胞(PBMCs)种群。随后，给所述PBMCs—种药剂。然后，可以测定所述PBMCs的一个或多个中至少一种IRG或其变体的表达水平。根据本发明的另一方面，提供一种治疗MS受治疗者的方法。所述方法的一个步骤可以包括从所述受治疗者体内获得生物学样品。在获得所述生物学样品之后，可以测定其所述至少一种IRG或其变体的表达水平。如果所述至少一种IRG或其变体中一种或多种的表达与对照相比增强或减弱，就可以给所述受治疗者服用治疗上有效量的除IFN-P之外的至少一种药剂。根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗MS受治疗者的方法。所述方法的一个步骤可以包括从所述受治疗者体内获得生物学样品。在获得所述生物学样品之后，可以测定所述至少一种IRG或其变体的表达水平。如果所述至少一种IRG或其变体的表达与对照相比增强或减弱，就可以给所述受治疗者服用治疗上有效量的那他珠单抗(natalizumab)。
在结合附图阅读以下说明书内容之后，本发明所属领域的技术人员可以理解本发明的上述和其他特征，其中 :图1是说明本发明的一个方面关于测定干扰素( IFN-^ )治疗多发性硬化症(MS)的受治疗者其效力的方法的流程图；图2是说明根据本发明的另一方面关于一种筛选可用于治疗MS的药剂的方法的流程图；图3是说明根据本发明的另一方面关于一种用于治疗MS受治疗者的方法的流程图；图4是表示通过实时定量PCR计算的OASL的诱导比(IRs)与宏阵列之间的相关性的散布图(示出了 X轴和Y轴的log2标尺)；图5是表不第一次注射IFN-0时干扰素-调控基因(IRGs)数量图；各柱表不初次注射IFN- ^时的各个体受治疗者，柱的高度表示IRs > 2.0的IRGs的数量，治疗反应弱的受治疗者加上阴影；图6表示85个受治疗者在初始时间(X-轴)和6个月(y-轴)时的IFN-P分子反应的一系列散布图；对每一个受治疗者来说，示出了 166个基因中每一个基因在两个时间点的IR，两个时间点之间的分子反应可变性从每一个图中对角线的偏差看出；
图7是10个受治疗者的一系列散布图，表示在24个月时间内具有一致性反应。10个MS受治疗者(5个敏感者，5个不敏感者)在初始时间，6个月，和24个月的宏阵列数据是随机挑选的，以便测试两年时间的反应一致性，前三个柱表示具有弱治疗反应的受治疗者，而后三个柱表示具有良好治疗反应的受治疗者，柱I和4比较初始时间和6个月时的反应，柱2和5比较6和24个月时的反应，柱3和6比较初始时间和24个月时的反应；图8A-B是一系列柱状图，表示反应低下的受治疗者在初次注射IFN-P (图8A)和6个月注射IFN-P (图8B)时的放大的IRG反应(柱状图绘制了反应良好组所有受治疗者和反应低下组所有受治疗者的所有基因的IR);和图9是表示初始时间T2损伤体积(LV)、初始时间的最佳25IRGs、和初始时间T2损伤体积+最佳25IRGs的ROC曲线的图。所述ROC曲线检验了在初始时间测定的25IRGs的能力，预测在随后6个月测定的不敏感性，并且比较用初始时间T2损伤体积进行预测的能力。
具体实施例方式除非另有说明，本申请所使用的所有科技术语均具有常用的含义。本文所提供的定义是为了便于理解本文常用的一些术语，而不是要限定本发明的范围。在本发明的上下文中，术语〃对照〃或〃对照样品〃可以表示用作参照物的任何受试样品或分离的样品。在本文中，术语〃mRNA〃表示基因的转录物。转录物可以包括RNA，如已准备好翻译的和/或处于转录加工的各个阶段(例如，剪接和降解阶段)的成熟的mRNA。在本文中，术语 〃核酸〃或〃核酸分子〃表示单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸链，并且可以包括以与天然存在的核苷酸类似的方式起作用的天然核苷酸的已知类似物。在本文中，术语〃多肽〃和〃蛋白〃包括有一个以上氨基酸亚基的分子。多肽可以是完整的蛋白或可以是蛋白片段，如寡肽或寡肽。所述多肽还可以包括氨基酸亚基的改变，如甲基化或乙酰化。在本文中，术语〃探针〃表示可以通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补碱基配对与具有互补序列的靶核酸结合的寡核苷酸。例如，寡核苷酸探针可以包括天然碱基(即，A，G，C或T)或修饰过的碱基(例如，7-脱氮鸟嘌呤核苷，次黄嘌呤核苷等)。另外，寡核苷酸探针上的碱基可以通过除了磷酸二酯键以外的键结合，只要其不妨碍杂交便可。在本文中，术语〃定量〃在用于基因定量转录水平的场合时，可以表示绝对或相对定量。绝对定量可以通过包含已知浓度的一种或多种靶核酸(例如，对照核酸)并且参照未知和已知靶核酸的杂交强度(例如，通过生成标准曲线)实现。另外，相对定量可以通过比较两个或多个基因之间，或两个或多个处理之间的杂交信号，以便对杂交强度的变化进行定量，并且通过转录水平推断而实现。在本文中，与基因相关的术语〃相对基因表达〃或〃相对表达〃可以表示相同基因表达产物的相对丰度，通常是指不同细胞或组织类型中的mRNA的相对丰度。在本文中，术语"受治疗者"可以表示任何动物，包括，但不局限于，人和非人动物(例如，啮齿类动物，节肢动物，昆虫，鱼类)，非人灵长类，绵羊，牛，反刍动物，兔类动物，猪，公山羊，马，犬，猫，鸟类等)，它们将被用作特定诊断和/或治疗用途的受体。在本文中，术语〃生物学样品〃可以表示从受治疗者或其组成部分获得的身体样品。例如，所述身体样品可以包括"临床样品"，即，来自受治疗者的样品。所述样品可以包括，但不局限于:外周体液，它可以含有或不含有细胞，例如，血液，尿液，血浆，粘液，胆胰液，上清液和血清；组织或细针活组织检查样品(fine needle biopsy samples);以及具有已知诊断、治疗和/或预后病史的存档样品。身体样品还可以包括组织切片，如来自组织学目的的冷冻切片。术语〃生物学样品〃还可以包括通过处理身体样品衍生的任何材料。衍生的材料可以包括，但不局限于从所述生物学样品中分离的细胞(或其后代)，从所述样品中提取的蛋白，和/或核酸分子。所述生物学样品的处理可能涉及过滤、蒸馏、萃取、浓缩、固定化、干扰组分的灭活和添加各种试剂等措施中的一种或多种。在本文中，术语〃干扰素-调控基因〃或"1RG〃可以表示在用至少一种干扰素，如IFN-P处理时其表达与对照相比增强或减弱的任何基因或其变体。IRGs的例子可以包括在表I中所列出的，以及本领域公知的其他基因(例如，参见，Samarajiwa, S.A.et al.,Nucleic Acids Res.37:D852_D857, Jan.2009)。在本文中，术语“变体”在用于描述IRG时可以表示IRG核苷酸序列上的任何变化，并且包括出现在编码和非编码区的改变，包括外显子，内含子和非翻译序列。变化可以包括单个核苷酸取代，一个或多个核苷酸缺失，以及一个或多个核苷酸插入。IRG变体的例子为本领域所公知(例如，参见，Vosslamber, S.et al.，"Interferon regulatory factor5genevariants and pharmacological and clinical outcome of Interferon 旦 therapy inmultiple sclerosis' 基因 and Immunity,在线
公开日
2011 年 4 月 7 日 jPBaranzini etal., Hum.Mol.Genet.15:767, 2009)。本发明总体上 涉及用于预测多发性硬化症(MS)接受治疗者的治疗反应的方法，尤其涉及根据差别化表达的遗传标记物预测MS受治疗者对干扰素-P (IFN- ^ )治疗的反应的方法。本发明基于以下发现:在MS受治疗者群体内，干扰素-调控基因(IRGs)的表达会出现定性差异(即，受调控IRGs的身份)和定量差异(即，受调控IRGs的数量和诱导或抑制的程度)。具体讲，意外地发现被归类为不敏感者的MS受治疗者在第一次和6个月的IFN- ^注射之后，表现出明显放大了的分子反应(即增强和减弱的基因表达)。基于上述发现，本发明提供了一种用于测定所述IFN- ^治疗的MS受治疗者效力的方法，一种确定MS受治疗者是否需要用除了 IFN-P之外的其他治疗剂进行治疗的方法，一种筛选可用于治疗MS的药剂的方法，和用于治疗MS受治疗者的方法。有关MS发病机理的机械论学说的看法一直集中在获得性免疫方面，特别是针对髓磷脂成分的免疫反应。如上文所述，业已意外地发现，被确定为不敏感者状态的IFN-3受体已经具有较高的疾病活性和疾病负担。不希望受理论的约束，相信对I型IFN的反应增强伴随着先天性免疫过程，该过程引发一类MS受治疗者(S卩，不敏感者)的自身免疫发病机理。因此，据信先天性免疫的差异，无论是I型IFN途径上的或间接影响IRGs的表达水平方面的差异，都是不敏感者增强疾病严重性的决定因素。图1是说明根据本发明一个方面的用于测定所述IFN-P治疗MS受治疗者的效力的方法10的流程图。方法10可以包括以下步骤:从MS受治疗者体内获得生物学样品(步骤12);从所述生物学样品中分离至少一种核酸(步骤14);确定至少一种IRG和/或其变体的表达水平(步骤16);和分析所述测定基因的表达水平，确定所述受治疗者是否对IFN-3治疗不敏感(步骤18)。方法10可选择性包括在获得所述生物学样品之前给MS受治疗者服用一定剂量的IFN-P (步骤20)。在本文中，术语〃多发性硬化症〃或"MS"可以包括这样的疾病:其中，大脑和脊髓轴突周围的脂肪髓鞘受损，导致脱髓鞘和瘢疤形成。MS可能包括多种亚型，受治疗者可能受到其中任何一种的困扰。MS亚型的例子可以包括良性MS，静息复发缓和MS，活动复发缓和MS,原发性MS,和继发性MS。复发缓和MS可以包括以完全或部分恢复的急性发作和在两次发作之间无疾病发展的明确定义为特征的MS的临床发病病程。原发性MS可以包括最初以无缓和的发展形式出现的MS的临床发病病程。继发性MS可以包括起初复发缓和，继而以各种速度发展，可能伴随偶尔复发和轻微缓和的MS的临床发病病程。发展性复发MS可以包括从发作开始就发展，间或复发的MS的临床发病病程。一般来说，在复发之后马上出现明显恢复，但在两次复发之间可能出现疾病发作的逐渐恶化。参见图1，在步骤12，可以从MS受治疗者的体内获得至少一种生物学样品。在本文中，术语"生物学样品"以其最广义的含义使用，并且可以包括来自所述受治疗者的任何临床样品。生物学样品的例子可以包括，但不局限于，外周体液，组织或细针活组织检查样品，以及具有已知诊断、治疗和/或预后病史的存档样品。生物学样品还可以包括组织切片，如来自组织学目的的冷冻切片，以及通过处理所述样品衍生的任何材料。在本发明的一个例子中，所述生物学样品可以包括用注射器针头从MS受治疗者的静脉中获得的全血样品。在步骤14，可以从所述生物学样品中分离至少一种核酸。可以按照多种公知方法中的任一种从所述生物学样品中分离核酸。本领域技术人员可以理解的是，一旦检测到一个基因拷贝数的改变，就可以分离基因组DNA。相反，一旦检测到理想的基因表达水平，就可以分离RNA (即mRNA)。分离核酸，如mRNA的方法为本领域技术人员所熟知，(例如，参见，Chapter3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology !Hybridization With Nucleic Acid Probes，Part1.Theory of Nucleic AcidPreparation.P.Ti jssen，ed.Elsevier, N.Y.(1993))。在本发明的一个例子中，RNA可以使用商业化试剂盒，如PAXGENE RNA血液提取试剂盒(PREANALYTIX，Switzerland)在体外从全血样品中分离。简言之，可以从MS受治疗者的体内获得至少一种全血样品，然后收集在试管中(例如，无RNase试管)。纯化可始于离心步骤，使细胞在试管中沉淀。然后可以洗涤所述沉淀物，重新悬浮，并且在优化缓冲液中(与蛋白酶K 一起)温育，以促进蛋白消化。可以实施另一个离心步骤，以便使细胞裂解液均匀化，并且除去剩余的细胞碎片。然后，可以将流出的上清液部分转移到新的微量离心机管中。然后可以添加乙醇，以便调整结合条件，接着将所述裂解液加样到核酸纯化柱上。在短暂离心之后，RNA能够选择性地结合在纯化柱的膜上，而污染物从柱中通过。随后可以通过若干有效的洗涤步骤除去其余污染物。例如，在第一和第二个洗涤步骤之间，可以用DNase I处理所述膜，以便除去微量的结合DNA。在所述洗涤步骤之后，可以用洗脱缓冲液洗脱RNA，并且进行热变性。然后，通过额外的琼脂糖凝胶电泳观察可以评估RNA的质量和数量(例如，通过光谱学分析)。
在步骤16，从所述生物学样品中分离的核酸中测定所述至少一种IRQ和/或其变体的表达水平。在本发明的一个例子中，可以根据从所述生物学样品中分离的核酸测定表I中所列举的至少一种IRG和/或其变体(例如，大约4个IRGs和/或其变体)的表达水平。在本发明的另一个例子中，可以根据从所述生物学样品中分离的核酸测定表3中所列举的至少一种IRG和/或其变体(例如，大约4个IRGs和/或其变体)的表达水平。本领域技术人员可以理解的是，为了测定基因的表达水平(以及转录水平)，需要提供包含所述基因的mRNA转录物的核酸样品，或源于所述mRNA转录物的核酸。在本文中，源于mRNA转录物的核酸可以包括这样的核酸:在它的合成中所述mRNA转录物(或其亚序列)最终被用作模板。因此，由mRNA逆转录得到的cDNA，由所述cDNA转录得到的RNA，由所述cDNA扩增的DNA，由扩增的DNA转录得到的RNA等，均可源于所述mRNA转录物，并且对所述衍生产物的检测可以作为所述样品中原始转录物存在和/或丰度的指标。检测基因表达水平和/或活性的方法为本领域所公知。例如，所述用于检测RNA方法的非限定性例子，可以包括Northern印迹分析，RT-PCR, RNA原位杂交(例如，使用DNA或RNA探针与样品中的RNA分子杂交)，原位RT-PCR，和寡核苷酸微阵列(例如，通过源于样品的多核苷酸序列与结合在底物上的寡核苷酸杂交)。在本发明的一个例子中，宏阵列可用于检测所述至少一种IRG和/或其变体的表达水平。本领域技术人员可以理解的是，所述宏阵列可以包括能够与要检测的表达核酸特异性杂交的多种试验探针，并且选择性地包括一种或多种对照探针。试验探针可以包括大小在一定范围(例如，大约5-50个核苷酸)，并且有与特定基因的亚序列互补的序列的寡核苷酸，所述特定的基因的亚序列其表达是被设计成准备进行检测的。因此，所述试验探针能够与靶核酸特异性杂交。可以作为所述宏阵列一部分包含其中的对照探针的例子，可以包括标准化对照，表达水平对照和错配对照。在本发明的另一个例子中，在例2 (参见下文)中所披露的宏阵列可用于检测表I所列基因中至少大约4个基因的表达水平。因为若干原因，检测所述至少大约4个基因(例如，4个基因)的表达水平可能是有利的。为了进行定量检测(例如，qPCR)，例如，出于实用考虑(例如，所需试剂的体积和数量等)，在多元阵列中选择有限数量的基因可能是有用的。另外，可以选择至少大约4个基因以便利用本发明的随机森林模型(random forest model)优化其甄别能力(即，位于RO C曲线下面的面积)。包括所述宏阵列的IRGs可以由大约166种人类cDNAs来代表。简单讲，将DNA点在宏阵列膜上、进行探针标记、和杂交的方案，可以从在体外从全血中分离大约g总RNA开始。然后可以通过使用 SUPERSCRIPT II，在存在 2PdCTP (FNVITROGEN，Carlsbad，CA)的条件下逆转录生成cDNA探针。残余RNA可以通过在大约70° C下碱处理大约20分钟水解，此后可以用G50柱(GE Healthcare, Buckingham-shire, UK)纯化cDNA。然后探针可以在大约10毫升杂交缓冲液中与所述宏阵列膜杂交过夜，随后用低和高强度缓冲液洗涤。接着，用增感荧光屏对所述宏阵列曝光大约两天，随后用ST0R1MAGER (MOLE⑶LAR DYNAMICS,Sunnyvale, CA)扫描。现有技术的方法通常采用高密度寡核苷酸微阵列(microarrays)表征通过IFN-^调控的基因。所述方法可用于鉴定新型IFN-P调控基因，但结果不便于定量，因此，该技术不太适合分析纵向的、差异化的IRG调控。与现有技术的高密度微阵列不同，本发明的宏阵列可以包括从先前的微阵列实验中选择的大约166个IRGs (例如，参见，Schlaak,J.F.et al, J.Biol.Chem.277 =49428-49437,2002 ；和 Rani，M.R.S.et al, Ann.N.YAcadSc1.1182:58-68, 2009)，所述实验证实所述微阵列可以作为其他疾病的指标(例如，IFN_a治疗丙肝病毒)并且证实，所述微阵列是可再生的，灵敏的，和定量的。有利的是，通过本发明的宏阵列(macroarrays)可检测较小数量的基因，提供了用于评估IFN-^-调控的基因表达聚集和定量的测定方法。在步骤18，可以分析所述测定的基因表达水平，以便确定所述IFN-P治疗的效力，例如，所述测定的基因表达可以与对照的基因表达水平(例如，没有MS的一个或多个受试者)进行比较。在本发明的一个例子中，与所述对照相比，表I所列基因中至少大约4个基因和/或其变体表达水平的增强或减弱，可以表明所述受治疗者对IFN-P的治疗不敏感。除了表现出增强或减弱的基因表达水平之外，尽管进行治疗，不敏感者还可能表现出连续性神经功能恶化。用于评估MS受治疗者神经功能恶化的方法为本领域所公知，并且可以包括，例如，定量MRI分析，扩张能力丧失状态量表(EDSS)(例如，EDSS得分提高至少大约
0.5可以作为神经功能恶化的指标)，以及多发性硬化功能复合物。在本发明的另一个例子中，下列基因和/或其变体中至少一个(例如，大约4个)的增强或减弱的表达水平(与对照相比)可以表明所述受治疗者对IFN-P治疗不敏感:
2-50AS ;衔接蛋白；Akt-2 ；AP0L3 ；ATF2 ；Bad ;Bcl_2 ；BST2 ;C1_INH ；Clorf29 ；Clr ；C1S ;半胱天冬酶 I (Caspasel);半胱天冬酶 7 ;半胱天冬酶 9 ；CCR1 ;CD3e ；CEACAM ；c-myc ；C0MT ；CREB ； CXCL11 ；CXCR4 ；CYB56 ；DDX17 ；Def-a3 ;人弹性蛋白酶 2 (Elastase2) ;Fas_L ；FK506 ；FLJ20035 ；G1P3 ；Gadd45 ；GATA3 ；GBP2 ；HLADP ；HLADRA ；Hou ；HPAST ；Hsfl ；Hsp90 ；ID0 ；TFI16 ；IF1-17 ；IFN-44 ；IFI60 ；IFIT1 ；IFIT2 ；IFIT5 ；IFITM2 ；IFITM3 ；IFN-17 ；IFNARl ；IFNAR2 ；IFNGRl ；IFNGR2 ；IL15 ；IL18BP ；IL1RN ；IL2 ；IL2Rg ；IL6 ;Int_6 ;IP_10 ；IRF2 ；ISG15-L ；ISG20 ；ISGF3g ；LICAM ；MAP2K3 ；MAP2K4 ；MAP3K14 ；MAP3K3 ；MAP3K4 ；MAP3K7 ；MAP4K1 ；MAPK13 ；MAP7 ；Met-onco ；MMP-1 ;MMP_9 ；MT1H ；MT1X ；MT2A ；MX1 ;NF-1L_6 ；NFkB ;NMI ;NT5e:0ASL ;P4HA1 ;p53 ;p57Kip2 ;PA1-1;PDK1 ;PDK2 ;P13K ;PKR ;网蛋白；PLSCR I ；PSMB9 ；RCNI:RGS2 ；RH0 ⑶P ;RIG_1 ；SERPIN:SNN ；S0CS-1 ；STATI ；STAT2 ；STAT4 ；TFEC ；TGFbR2 ；TGFbR3 ；TIMP-1 ；TNF-a ；TNFAI P6 ；TORlB ；TRAIL ；UBE2L6 ；USP118 ；VegFC ；蝰毒素(Viperin)和 WARS。在本发明的另一个例子中，下列基因和/或其变体中至少一个(例如，大约4个)的增强或减弱的表达水平(与对照相比)可以表明所述受治疗者对IFN-P治疗的不敏感:TRAIL ；RIG-1 ；2-50AS ；STATI ；P13-激酶;IL_15 ;IP_10 ;MM1 ；P4HA1 ;半胱天冬酶 7 ；PD2 ；ATF-2:TNF-a ；RGS2 ；SNN ；hsp90 ；c-myc ;A1_AT ；FILA-DRA ；C0MT ；NFKB ；HLA-DP ；TIMP-1 ；CXCR4 ;和 IL-2。在本发明的另一个例子中，下列基因和/或其变体中至少一个(例如，大约4个)的增强的表达水平(与对照相比)可以表明所述受治疗者对IFN-P治疗的不敏感=TRAIL ；RIG-1 ；2-50AS ；STAT I ；PI3-激酶;IL_15 ;IP_10 ；MMP-1 ；P4HA1 ;半胱天冬酶 7 ；PDK2 ；ATF-2 ； TNF-a ;和 RGS2。
在本发明的另一个例子中，下列基因和/或其变体中至少一个(例如，大约4个)的减弱的表达水平(与对照相比)可以表明所述受治疗者对IFN-P治疗的不敏感:SNN ；hsp90 ；c-myc ;A1_AT ；HLA-DRA ；C0MT ；NFKB ；HLA-DP ；TIMP-1 ；CXCR4 ;和 IL-2。 本发明另一方面可以包括确定MS受治疗者是否应该还要用除IFN- ^之外的治疗剂治疗。例如，与对照相比，当MS受治疗者的至少一种IRG和/或其变体(例如，表I所列基因中至少大约4个基因)具有增强或减弱的表达水平时，所述受治疗者就可以用除IFN-3之外的治疗剂治疗。除IFN-P之外的MS疗法为本领域所公知，并且可以包括，例如，醋酸格拉太咪尔,米托蒽醌,和那他珠单抗，以及其他疗法(例如,维生素D)。其他MS疗法可以包括目前用于MS治疗的临床研究的方法，如阿仑单抗，达利珠单抗，肌苷，BG00012,芬戈莫德，拉喹莫德和NEUROVAX。下面将更详细地说明本发明的用于治疗MS患者的方法。在步骤20，所述方法10可选择性包括在获得所述生物学样品之前给MS受治疗者施用一定剂量的IFN-P。所述IFN-P剂量可以作为单一制剂输送，这可以降低基因表达测定(即，在步骤16)的干扰。可以给MS受治疗者施用的IFN-P剂量的例子包括IFN-P-1a(例如，AVONEX，REB1F)和 IFN-P-1b (例如，B SERON，EXTAV1A)。所述 IFN-P 剂量可以通过任何一种已知的途径给药，如血管内注射。在给所述受治疗者施用所述FN-P剂量之后，可以获得至少一种生物学样品(如上文所述)。可以在一个或多个时间点获得所述生物学样品。例如，可以在用IFN-P剂量之后大约12小时从MS受治疗者的体内获得全血样品。应当理解的是，在第一个IFN-@剂量之后，还可以给受治疗者用额外剂量的IFN-P。例如，可以给受治疗者用第一个剂量的IFN-P，然后在用第一个剂量大约12小时之后收集生物学样品，然后在大约6个月用第二个剂量的IFN-3，随后再次收集生物学样品。在获得所述生物学样品之后，可以从所述样品中分离至少一种核酸(如上文所述)。同样如上文所述，随后可以利用，例如，宏阵列之类测定所述至少一种IRG和/或其变体的表达水平。一旦测定了所述至少一种IRG和/或其变体的表达水平，就可以对所述表达水平进行分析(如上文所述)。例如，所述测定的基因表达水平可以与所述对照的基因表达水平进行比较。所述对照可以从一个或多个未患MS的受试者体内分离、从没有用IFN-P治疗的受试者体内获得、或在用IFN-P治疗之前从受试者体内获得。例如，当表I所列基因中至少大约4个基因的所述基因表达测定水平增强或减弱(与所述对照相比)时，所述受治疗者可能对IFN-0治疗反 应不敏感。尽管IFN- ^是最常用的MS疾病改善治疗剂，其作用机理尚不十分清楚，并且没有对个性化治疗进行指导的生物学标记。根据以下发现:MS受治疗者对IFN-P注射的放大的分子反应是先天性免疫反应驱动发病机理的一类受治疗者的标志，本发明优选提供了用于鉴定被定义为对IFN-P治疗不敏感状态的少数受治疗者的方法10。正如下面将更详细讨论的，本发明因此能够为每一个MS受治疗者定制疾病改善治疗方案。图2表示本发明另一方面，包括用于筛选治疗MS的制剂的方法30。方法30可以包括以下步骤:提供一个来自MS受治疗者的外周血单核细胞(PBMCs)群体(步骤32);给所述PBMCs使用一种制剂(步骤34);从所述PBMCs中至少分离一种核酸(步骤36);测定至少一种IRG和/或其变体的基因表达水平(步骤38);和分析测定的基因表达水平(步骤40)。在步骤32，可以从患有MS并且是IFN-P治疗不敏感者的受治疗者的体内获得PBMCs群体。确定所述受治疗者是否是不敏感可以按照上述方法10完成。例如，与对照相t匕，具有至少一种IRG和/或其变体(例如，表I所列基因中大约4个基因)增强或减弱的表达水平的MS受治疗者可以被表征为不敏感者。本领域技术人员可以理解的是，存在若干种用于分离PBMCs的方法。例如，PBMCs可以利用不同密度梯度离心方法从全血样品中分离。一般，可以将抗凝全血在分离介质上铺层，然后离心。在离心步骤结束时，目测可见有若干层(从顶部到底部):血浆/血小板；PBMCs ;分离介质；和红细胞/粒细胞。可以除去PBMC层并且洗涤以便除去所有污染物(例如，血红细胞)。在洗涤之后，可以用本领域公知的方法验证细胞类型和细胞活力。所述PBMCs随后可以在体外培养一段时间，并且是在足以促进形成充分融合的细胞层的条件下培养。在步骤34，可以给所述PBMCs群体使用至少一种药剂。可以给所述PBMCs群体使用的药剂包括可能用于MS治疗的候选物的任何生物学部分，化合物，或药物。所述药剂的例子可以包括生物制剂，药用化合物，多肽，蛋白，核酸和小分子。在步骤36，可以从所述PBMCs群体中分离至少一种核酸。从细胞群体中分离核酸的方法为本领域所公知。例如,可以利用公知的RNA提取方法从所述PBMCs群体中分离RNA。如上文所述，在步骤38，可以测定所述至少一种IRG和/或其变体(例如，表I所列基因中大约4个基因)的表达水平。例如，宏阵列可用于检测基因表达水平。一旦确定所述至少一种IRG和/或其变体(例如，表I所列基因中大约4个基因)的表达水平，就可以在步骤40分析所述测定的表达水平(如上文所述)。例如，所述测定的基因表达水平可以与对照的基因表达水平进行比较。当所述测定的基因表达水平增强或减弱(与对照相比)时，所使用的试剂就可能不宜用作MS治疗的候选物。相反，当所述基因表达水平没有增强或减弱(与所述对照样品相比)时，所使用的试剂就可能用于MS治疗的候选物。图3表示本发明另一方面，包括用于治疗MS受治疗者的方法50。方法50可以包括以下步骤:从MS受治疗者的体内获得生物学样品(步骤52);从所述生物学样品中分离至少一种核酸(步骤54);测定所述至少一种IRG和/或其变体的基因表达水平(步骤56);分析所述测定的基因表达水平(步骤58);和给所述受治疗者施用至少一种药剂(步骤60)。方法50可选择性地包括在获得所述生物学样品之前给MS受治疗者用一定剂量的IFN- β(步骤 62)。在步骤52，可以从MS受治疗者的体内获得至少一种生物学样品。如上文所述，例如，所述生物学样品可以包括用注射器针头从受治疗者静脉血管中获得的全血样品。在步骤54，可以从所述生物学样品中分离至少一种核酸(如上文所述)。例如，可以使用PAXGE E RNA血液提取试剂盒从全血样品中分离RNA。接着，可以在步骤56测定所述至少一种IRG和/或其变体的表达水平，如上文所述，例如，杂交宏阵列可用于检测表1所列基因中至少大约4个基因的基因表达水平。一旦确定了所述至少一种IRG和/或其变体的表达水平，就可以在步骤58分析所述测定的基因表达水平(如上文所述)。例如，所述测定的基因表达水平可以与所述对照的基因表达水平进行比较。当所述测定的基因表达水平增强或减弱(与对照相比)时，所述受治疗者可能是IFN-P治疗的不敏感者。相反，当所述基因表达水平没有增强或减弱(与所述对照样品相比)时，所述受治疗者可能是IFN-P治疗的候选人。在步骤60，可以给所述受治疗者施用治疗有效量的至少一种药剂。给所述受治疗者用的具体药剂取决于事先确定的所述受治疗者的反应状态。例如，如果所述受治疗者是不敏感者，就可以给所述受治疗者用治疗有效量的除IFN-P之外的药剂，如那他珠单抗。相反，如果所述受治疗者是不敏感者，就可以给所述受治疗者用治疗有效量的一种药剂，如IFN-^。应当理解的是，治疗的类型，剂量，方案，和治疗时间可以根据受治疗者的病理学严重性和/或预后而改变。本领域技术人员可以调整治疗的类型，剂量，方案，和治疗时间。优选的是，方法50提供了一种用于治疗MS受治疗者的方案，受治疗者不用使用不必要的药物，反过来，由于能够节省不必要的成本，这对于医疗保健体系来说是十分有利的。还可以理解的是，方法50可选择性包括在获得所述生物学样品之前(如上文所述)，在步骤62给MS受治疗者用一定剂量的IFN- ^的步骤。还可以理解的是，作为方法10，30，和50的一部分，本发明还可以包括蛋白或多肽分离和检测技术。例如，可以用公知方法分离并检测由本发明的IRGs和/或其变体编码的蛋白，多肽，和/或其变体。为此，可以从MS受治疗者的体内获得生物学样品(如上文所述)。然后，用公知技术处理所述生物学样品，以便分离由本发明的IRG和/或其变体编码的蛋白，多妝，和 / 或其变体。例如，参见，Protein Purification Protocols, Humana Press(1996)。然后可以利用一种或多种公知技术的组合检测所述分离的蛋白，多肽，和/或其变体，如蛋白微阵列，免疫染色，免疫沉淀反应，电泳(例如，2D或3D)，Western印迹，分光光度法，和BCA测定。在检测所述蛋白，多肽，和/或其变体之后，可以分析所述蛋白，多肽，和/或其变体的含量。当所述蛋白，多肽，和/或其变体的含量增加或减少(与对照样品相比)时，所述受治疗者可能是IFN-@治疗的不敏感者。相反，当所述蛋白，多肽，和/或其变体的含量没有增加或减少(与所述对照样品相比)时，所述受治疗者可能是IFN-P治疗的候选人。下面的例子只是用于说明目的的，而不是要限定权利要求的范围，权利要求附在说明书之后。
实施例1 述 临床方案 克利夫兰诊所(CC)的机构审查委员会批准了该项研究。所有受治疗者都提供了书面知情同意文书。如果受治疗者具有临床孤立综合征(CIS)或复发缓和MS，开始是通过肌内注射I FN-P-1a治疗，以前从未接受过治疗，并且随后在CC MS中心跟踪观察，他们就是合适人选。共有99位受治疗者参与了该研究。在初始时间、6、12、和24个月时均对每一个受治疗者进行检查。在3和18个月，电话联系受治疗者，评估治疗适应性并查明副作用。在初始观察时间、6个月和24个月，在临床研究单位采集血液，在即将IFN- ^注射之前和注射之后准确的12小时进行IRG分析，并且对所述受治疗者进行标准化脑MRI扫描，以便定量评估损伤和脑萎缩。在每一次检测时，对受治疗者进行神经学检测，以便测定Kurtzke扩张能力丧失量表得分(Kurtzke，J.F.，Neurology33:1444-1452，1983)，多发性硬化功能组合得分(Rudick，R.A.et al, Mult.Scler.8:359_365，2002)，和间歇性复发或疾病病史；还给受治疗者提供了结构问卷，以表征其流感样综合征，肌痛，受寒，疲劳，头痛，和体力下降。在6和24个月检测血清中的IFN-中和抗体。
MRI分析所述MRI获取结果包括在注射标准剂量的礼(0.1 mmol/kg)之前和之后获得的T2-加权的流体衰减反转恢复(FLAIR)图像，T2-和质子密度-加权的快速双回波自旋回波图像，和Tl-加权的自旋回波图像。利用内部开发的图像分析软件测定脑主质级分(BPF), T2损伤体积，H低强度损伤体积，钆-强化损伤体积和数量，新T2损伤数量，和扩大的T2损伤数量。利用全自动分割软件根据FLAIR图像计算BPF (Rudick, R.A.et al,J.Neuroimtnunol.93:8-14,1999)。有关损伤分析方法的细节以前业已公开(Cohen, J.A.etal’Mult.Scler.14:370-382, 2008)。简单讲，在FLAIR和T2/PD图像中自动分割T2高强度损伤，并且利用交互软件进行目测检验，以便校正误分类的损伤。将6个月的跟踪图像记录到初始时间，并进行强度标准化。将初始时间T2损伤掩蔽施加于同时记录的6个月的图像上，以确定持久性损伤。然后，从所述记录的、强度标准化的6个月图像中扣除初始时间图像，以便自动确定6个月时的新的和扩大的T2损伤。利用交互软件目测检验所述新的和扩大的T2损伤，以便产生最终计数。
RNA分离利用PAXGENE RNA血液提取试剂盒(PreAnalytix, Switzerland),按照生产商的说明，在体外从血液中提 取RNA，并且通过乙醇沉淀浓缩。通过分光光度法(吸光度比值为280/260nm)评估RNA的质量和数量，并且通过琼脂糖凝胶电泳进行额外的目测观察。RNA样品在-80° C下保存。
用宏阵列进行基因分析用于cDNA宏阵列分析的详细方法是按照公开的方法进行的(Schlaak，J.F.etal, J.Biol Chem.277，49428-49437，2002 ;Rani，M.R.S.et al, Ann.N.Y Acad Sc1.1182:58-68,2009)。常规宏阵列上的IRGs由从Unigene数据库中筛选的166种人类cDNAs代表。在表I中示出了所述宏阵列上所有基因的名称和GenBank登录号。
表1:选择用于定制宏阵列的166种I型干扰素响应基因的名称和GenBank登录号
权利要求
1.一种预测干扰素-P (IFN-0 )在多发性硬化症(MS)接受治疗者体内的治疗效力的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: 从所述受治疗者体内获得生物学样品；和 确定至少一种干扰素-调控基因(IRG)和/或其变体的表达水平； 其中，与对照试验相比，所述至少一种IRG和/或其变体表达的增强或减弱均表明所述受治疗者对IFN-P的治疗不敏感。
2.如权利要求1所述的方法，其所述生物学样品包括全血。
3.如权利要求2所述的方法，还包括从所述全血样品中分离RNA。
4.如权利要求1所述的方法，还包括在获得所述生物学样品之前给予所述受治疗者一定剂量的IFN-3。
5.如权利要求4所述的方法，还包括在给予一定剂量的IFN-P后约12小时之内获得所述生物学样品。
6.一种筛选可用于治疗MS的药剂的方法，该方法包括以下步骤: 提供从IFN-P治疗不敏感的MS受治疗者体内获得的外周血单核细胞(PBMCs)群体； 给所述PBMCs使用一种药剂；和 确定至少一种IRG和/或其变体在所述一个或多个PBMCs中的表达水平。
7.如权利要求6所述的 方法，与对照试验相比，其中所述至少一种IRG和/或其变体的表达增强或减弱表明所述药剂不是用作MS治疗的候选药物。
8.一种治疗MS接受治疗者的方法，该方法包括以下步骤: 从所述接受治疗者体内获得生物学样品； 确定至少一种IRG和/或其变体的表达水平；和 与对照试验相比，如果所述至少一种IRG和/或其变体中的一种或多种表达显示增强或减弱的话，则给所述受治疗者施用除IFN-P之外的治疗有效量的至少另一种药剂。
9.如权利要求8所述的方法，所述生物学样品包括全血。
10.如权利要求9所述的方法，还包括从所述全血样品中分离RNA。
11.如权利要求8所述的方法，还包括在获得所述生物学样品之前对所述受治疗者给予一定剂量的IFN-3。
12.如权利要求11所述的方法，还包括在给予一定剂量的IFN-P后约12小时之内获得所述生物学样品。
13.一种用于治疗MS受治疗者的方法，该方法包括以下步骤: 从所述受治疗者体内获得生物学样品； 确定至少一种IRG和/或其变体的表达水平；和 与对照试验相比，如果所述至少一种IRG和/或其变体的表达显示增强或减弱的话，给所述受治疗者施用治疗有效量的那他珠单抗。
14.如权利要求13所述的方法，所述生物学样品包括全血。
15.如权利要求14所述的方法，还包括从所述全血样品中分离RNA。
全文摘要
本发明提供了一种用于预测干扰素-β(IFN-β)在患有多发性硬化症接受治疗者体内的治疗效力的方法。所述方法的一个步骤可以包括从所述受治疗者体内获得生物学样品。在获得所述生物学样品之后，可以测定所述至少一种干扰素-调控基因(IRG)和/或其变体的表达水平。与对照相比，所述至少一种IRG和/或其变体的增强或减弱的表达可以表明所述受治疗者对IFN-β的治疗不敏感性。
文档编号A61K48/00GK103140235SQ201180036119
公开日2013年6月5日 申请日期2011年6月17日 优先权日2010年6月18日
发明者理查德·A.·拉迪克, 理查德·M.·兰塞霍夫 申请人:克利夫兰临床基金会