专利名称：病毒体颗粒的生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用植物中表达的病毒抗原尤其是流感抗原生产一种新型病毒体颗粒以及包含这些病毒体颗粒的疫苗尤其是流感疫苗。
背景技术：
流感，通常称为flu，是一种最古老和最常见的疾病。它是由不同症状像发烧、冷战、咳嗽、咽喉痛和头疼表征的一种急性呼吸道疾病。它是由呼吸道分泌物通过喷嚏或咳嗽传递的真正的接触性传染病。尽管在大部分时间里流感是一种温和的病毒感染，但其也是造成婴儿、老年人以及免疫系统受损的成人中高发病率和死亡率的原因(Cox N.J.,AnnuRev Med,2000, 51:4-7-421)。抗流感的疫苗基于流感病毒表面蛋白(血凝素，HA)，其是保护性抗原。现有的流感疫苗包含来自三个不同流感毒株的HA抗原，流感A Hl NI和H3N2以及流感B病毒。由于抗原性漂移的结果的季节性流感病毒的新毒株的出现需要每年修正流感疫苗组合物。抗原性漂移周期性地(平均每20年)导致大流行病并且目前2009年流感大流行病的高致病性HlNl毒株是值得注意的公共卫生问题。疫苗接种仍然是最有效和最经济的预防流感病毒感染的方式，尤其是在面对危险的流感大流行病时。而且，全世界季节性流感疫苗产品的生产能力限于4亿个剂量，其远远不能满足在世界范围内对高危成人接种疫苗所必须的十亿个剂量(Emmanuel E.J.和Wertheimer A., Science 2006,312:854-855)。流感病毒血凝素(HA)的抗体在流感疫苗的保护性能力中起到重要作用。该分子包含靶细胞受体的结合位点并且其可变球状结构域表现大部分的中和表位(Wiley D.C.，Wilson LA.和 Skehel J.J., Natu`re 1981,289:373-378)。商业化的季节性流感疫苗基于失活或者活力减弱的流感病毒(Nichol K.L.和 Treanor J.J.，JID，2006，194 (Suppl.2)，S111-S118)。基于亚单位疫苗方法(尤其是使用杆状病毒表达的重组HA的)已经在临床研究中被检测(Goj1.A，等人，JID, 2008，1998 =635-638)。通常，花费大约6个月制造大批量的基于新出现的病毒的新疫苗，其代表开发普遍性疫苗的重要阻碍。在2009年流感大流行病的高致病性HlNl毒株的实例中，第一例于2009年3月于墨西哥被报道(参见WHO网站)而最初的相应疫苗Focetria (Novartis)和Pandemrix (Glaxo-SmithKline)于2009年9月24日在欧洲获得EMEA的批准(参见EMEA网站)。这两者都是在鸡蛋中生产的并且由于基于鸡蛋的疫苗生产显然导致疫苗的相当低的滴度以及相应相当低的免疫原性，因此两个实例中必须加入佐剂。因此，至今主要生产工艺仍旧包括基于鸡蛋的技术，而其不能生产将世界上所有高危成人免疫所必需数目的疫苗剂量。通常，生产一个剂量的疫苗需要一个鸡蛋。所述工艺面临几个限制:-困难并且耗时的后勤，归因于所需要的大量的鸡蛋；-生产规模和能力的限制；-在大流行的禽流感和大流行的2009年流感的实例中生产来源的问题；
-生产工艺对污染的敏感性；-生产工艺的复杂性和持续时间(6个月)；-尽管有若干纯化步骤，但是疫苗可能含有痕量的鸟类蛋白，其可能导致疫苗中所不期望的变态反应。在2009年流感的高致病性的HlNl毒株的实例中，基于鸡蛋的疫苗生产部分导致了疫苗的相当低的滴度和相应相当低的免疫原性，使得必需加入佐剂。当今基于细胞的技术开始与基于鸡蛋的工艺竞争。最先进的技术基于称为MDCK(马-达二氏犬肾)的犬肾细胞系。其具有一些优点，如由于细胞可被冷冻并且储存直至生产工艺开始因而后勤工艺比较简单。该系统同样对产品的污染较不敏感并且疫苗本身不含有可能导致变态反应的残留的痕量鸡蛋蛋白。使用Vero和PER.C6细胞培养物的其他基于细胞的技术正处于开发中。抗2009年流感的高致病性的Hl I毒株的疫苗，Cel-vapan (Baxter ;在非洲绿猴肾异倍体细胞中生产，未加佐剂)，于2009年10月I日在欧洲获得EMEA的批准(参见EMEA网站)。然而，不管所用的细胞系，就大量生产而言，这些生产工艺仅具有有限的生产能力。然而大量生产适当流感抗原的快速可用性是面对流感流行或大流行的威胁时所必需的。绿色生物技术为克服与现有的流感疫苗生产体系(鸡蛋和哺乳动物细胞培养物)有关的数量问题提供了一个机会。植物的另一个优势在于它们不具有动物病原体，这使得它们成为用于生物制药的更安全的生产有机体。然而，在植物中生产流感抗原也不是没有缺点。使用植物材料的污染可能导致有害的变态反应并且妨碍药物批准。因此，在分离和纯化来自植物提取的流感抗原时必须非
常注意。 在增强疫苗效力并由此克服可用性问题的另一个方法中，开发了免疫增强性重建流感病毒体(IRIV)。IRIV包含一种抗原或者掺入还含有磷脂混合物，一种必需的重建的功能病毒被膜，以及流感血凝素蛋白(HA)的病毒体的多种抗原的组合(参见例如W01992/19267)。采用例如来源于失活的甲型肝炎病毒的抗原，这些IRIV显示非常好的结果。然而在这些IRIV疫苗中，没有检测到抗HA的抗体，表明没有对HA抗原的免疫响应，因此使用“空”的IRIV，即仅使用流感血凝素蛋白，作为“独立”疫苗似乎是不可行的。因此，现有领域“空” IRIV被认为是佐剂而不是疫苗。近来，绿色生物技术和IRIV方法的组合被公开(W0 2009/009876 ；W02009/076778)。在这些实验中，在植物中生产病毒样颗粒(VLP)并且从植物材料分离。这一新方法允许大量生产VLP颗粒。然而不幸的是，VLP显示相当低的免疫原性，使得必须另外使用有效力的佐剂。尽管已经测试若干方法以增强植物来源流感抗原的效力，但是还没有植物来源的流感疫苗获得批准。因此，本发明所基于的技术问题是提供新的疫苗，尤其是抗流感的疫苗，其克服了与本领域中所用的方法有关的生产限制(例如就疫苗的数量、重复性和纯度而言)而同时保持疫苗的免疫原性。现有领域没有提供也没有建议之前提及的技术问题即可以大量生产并具有高重复性和纯度以及同时高免疫原性的疫苗尤其是流感疫苗的解决方案。
本发明通过提供权利要求中表征的实施方案解决的上文的技术问题。通过使用这些实施方案，提高疫苗尤其是流感疫苗的生产能力和品质变得可能。本发明可在疫苗和疫苗生产的所有领域尤其是流感疫苗中获得应用。
发明内容
本发明提供一种病毒体颗粒，其包含(i)在植物中重组生产的病毒抗原和(ii)脂双层，其中所述脂双层由下列特征中的至少一个表征:a)在所述脂双层中锚定的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸(bisacy 1xypropy I cysteine)辄合物；b)在所述脂双层中没有锚定的植物甾醇；c)在所述脂双层中锚定的至少一种动物甾醇；d)与在所述病毒的宿主细胞的质膜中发现的相同的脂双层的质膜组成；e)在所述脂双层中没有锚定的植物来源的鞘脂。在特定的实施方案中，本发明涉及合成生产的病毒体颗粒，其包含(i)烟草属植物中重组生产的流感血凝素(HA)抗原和(ii) 脂双层，其中所述脂双层包含在所述脂双层中锚定的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物。本发明还提供了含有根据本发明的病毒体颗粒的疫苗，任选地与适合的药学上可接受的物质稀释剂组合。本发明还提供生产病毒体颗粒的方法，其包括下列步骤:a)在植物中重组生产病毒抗原；b)生产磷脂混合物，其由下列特征中的至少一个表征:至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物；无植物甾醇；至少一种动物甾醇；如同在所述病毒的宿主细胞的质膜中发现的质膜组成；和/或无鞘脂；c)将流感病毒抗原与所述磷脂的混合物重建以形成所述病毒体颗粒。本发明还提供根据本发明的病毒颗粒、根据本发明的疫苗或由根据本发明的方法生产的病毒颗粒用于预防感染性传染病的用途。
附图显示:图1:制备病毒体的流程的原理:(a)植物中表达的HA流感抗原(b)磷脂的混合物(c)将含有HA的流感spike亚单元抗原与磷脂一起溶解于去污剂(d)除去去污剂之后含有表面上携带流感spike蛋白包括HA的重建的膜的病毒体颗粒。图2:梯度银染
图3:光子相关光谱(PCS)图4:小鼠中病毒体颗粒的免疫原性
具体实施例方式本发明的一个方面涉及提供一种病毒体颗粒，其包含(i)在植物中重组生产的病毒抗原和(ii)脂双层，其中所述脂双层由下列特征中的至少一个表征:a)在所述脂双层中锚定的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物；b)在所述脂双层中没有锚定的植物甾醇；c)在所述脂双层中锚定的至少一种动物甾醇；d)与在所述病毒的宿主细胞的质膜中发现的相同的脂双层的质膜组成；e)在所述脂双层中没有锚定的植物来源的鞘脂。如本文所用的，术语“病毒体颗粒”是指具有脂双层的颗粒，所述脂双层含有磷脂的混合物，因此类似基本上重建的功能病毒被膜。在特定的实施方案中，所述脂双层是单膜双层(unilamellar bilayer)的形式。如本文所用的，术语“病毒抗原”是指促进抗体生成并可导致免疫响应的任何病毒抗原。在一个实施方案中，这样的病毒抗原是来源于正粘病毒科家族的抗原。在特定的这些实施方案中，抗原是流感来源的抗原，在一些实施方案中，流感A、B或C来源的抗原。在某些实施方案中，抗原选自流感糖蛋白。在某些实施方案中，流感抗原选自由血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、M1-蛋白、M2-蛋白、NSl-蛋白、NS2 (NEP)-蛋白、P A-蛋白、PBl-蛋白、PB l-f2-蛋白和PB2-蛋白组成的组一种或多种。在特定的实施方案中，病毒抗原是血凝素(HA)。在另外的实施方案中，流感血凝素选自由H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 H16 组成的组，特别地是 Hl。在另外的实施方案中，涵盖这些病毒抗原的缺失、插入或加入突变体(即具有缺失的、插入的或增加的氨基酸或氨基酸序列的蛋白)。同样，涵盖嵌合体(即融合蛋白或不同来源的蛋白-络合物)、化学修饰蛋白(例如聚乙二醇化的蛋白)和修饰的蛋白(例如用另外的非天然的氨基酸)。在一个实施方案中，植物来源的抗原来自于流感血凝素。在另外的实施方案中，病毒抗原来自于选自由H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15和H16组成的组的流感血凝素，特别地是Hl。在特定的实施方案中，病毒抗原，例如血凝素HA包含跨膜区或其衍生物。在本发明的某些实施方案中，病毒抗原位于病毒体颗粒的脂双层中。在某些实施方案中，血凝素(HA)是生物学上有活性的。如本文所用的，术语“生物学上有活性的”是指基本上显示天然HA的全部生物学活性并且由此能够介导本发明的病毒体颗粒与它们的靶细胞经由包含唾液酸的受体吸附的HA或其衍生物。而且，这些HA组分可通过将抗流感抗体循环来识别。生物学活性是本发明的病毒体颗粒的必要特征。
不限于任何理论，本发明的病毒体颗粒的HA组分的功能可如下解释:I)其与靶细胞上含有唾液酸(N-乙酰神经氨酸)的受体结合以起始病毒体颗粒-细胞相互作用；
2)其介导病毒体颗粒通过膜融合事件进入细胞质并由此最终导致其释放；和3)其起到“识别抗原”的作用，因为大多数人类可被认为是对HA “预处理的”，原因在于事先通过疾病或接种疫苗暴露。因此，这些病毒体颗粒的必要特征在于它们在它们的表面携带生物学上有活性的病毒糖蛋白(HA)或其衍生物，避免不期望的HA抗原在其可能被非特异性降解的细胞内胞质体(endocytosome)中的长期停留。最重要的是抗原应当适合巨噬细胞和其他辅佐细胞的事实。为了这一目的，病毒体颗粒的颗粒性质是优点，因为其模拟了微生物的颗粒实体。
而且，因为所有人类都具有抗流感抗原HA的抗体(来自之前的流感感染或来自于疫苗接种)，因此快速形成抗体-抗原络合物(免疫络合物)。然而这些免疫络合物不仅加速识别抗原的进入巨噬细胞还加速识别抗原进入淋巴小结，其中抗原被长期保留在滤泡树突状细胞表面的细胞外位点中。这些长期的细胞外显露当然是疫苗的优选特征，因为其多功能的免疫-激发作用(免疫原性)。进入巨噬细胞和淋巴小结的这一过程称为调理作用。而且，通过抗体的结合具有抗原免疫原性的另一个结果。然而，溶液中一种给定的抗原，A，将仅与在其表面呈现具有抗A特异性的抗体分子的B细胞结合，而免疫络合物可经由Fe受体粘附于任何B细胞。因为输入淋巴管中的B细胞进入淋巴结的B细胞区域的能力，经由Fe受体的这一非特异性结合是天然感染中可能的一种途经，通过所述途经所述抗原被运输至淋巴组织中的淋巴小结和其他地方(Nossal, G.J.V., New GenerationVaccines (ed.Woodrow, G.C.和 Levine, Μ.Μ.), Marcel Dekker, Inc.，(1990)85)。该机制可能辅助经由单核细胞的运输。因此，病毒体颗粒表面上流感抗原的存在有利于调理作用的免疫机制。在一个实施方案中，本发明的病毒颗粒含有完整的HA，其作为550个氨基酸的单个多肽链而在植物中合成，随后通过除去精氨酸329 (相应于HA[Influenza A virus (A/Tff/36/04 (H3N2))]的精氨酸345)而剪切为两个链HAl (36，334道尔顿)和HA2 (25，750道尔顿)。这些链可任选地通过包括HAl位点14的半胱氨酸和HA2位点137的半胱氨酸的二硫键共价连接并且所述双链单体可非共价结合以在IRIV的表面上形成三体。这些HAl或HA2肽可获得自天然或合成来源或者通过基因工程获得。而且，大剂量纯蛋白抗原的突然使用包括激活免疫响应中的抑制通路的风险，尤其是如果使用静脉内途经时；参见 Nossal, G.J.V.，New Generation Vaccines, MarcelDekker, Inc.New York, Basle (eds.Woodrow, Levine), (1990)85。另一方面，缓慢释放允许抗原对广泛分布的树突细胞和巨噬细胞大大过量，并且其同样确保抗原在克隆增殖的最初爆发后仍然可获得，由此允许某些方面的二次响应。因此，如病毒体颗粒所表现的抗原的缓慢释放对于疫苗来说是另一个有利特征。如本文所用的，术语“在植物中重组生产的”是指蛋白包括糖基化蛋白通过植物宿主中的表达而重组生产。在本发明的背景下，术语“植物宿主”是指任何适于异种蛋白的重组表达的任何植物。在特定的实施方案中，植物表达宿主是烟草属植物、尤其是本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)。在本发明的某些实施方案中，植物中重组生产的病毒抗原具有植物表达宿主的碳水化合物分布特征。与在植物中产生完整的病毒样颗粒(VLP)的本领域技术相反，仅在植物中生产并纯化病毒抗原(例如HA蛋白)。之后将抗原与并非在植物中生产的磷脂的混合物一起重建。如之前提及的，现有领域的方法通常在植物中生产整个VLP，即抗原以及磷脂混合物并且另外的蛋白具有植物来源。之后将VLP从植物产品中纯化并且通过自发的凝集而形成。尽管这样的“一步法”程序具有简单的优点，但是其也具有一些缺陷。首先，其使得生产不含杂质的VLP实际上是不可能的。然而，与植物材料一起的杂质对于变态或其他有害身体反应的危险来源。因此，对于这些VLP组成的疫苗来说制药批准是很难的。第二，自发凝集和颗粒形成使得任何进一步的工艺控制都是不可能的。这导致尺寸和组成上不均匀的颗粒。第三，其不能够同时配制佐剂达到它们成为VLP的一部分的效果。相反，佐剂仅可以在颗粒形成已经发生之后被加入。本发明克服了所有这些缺陷。首先，其具有其产生非常纯的病毒体颗粒的优点，因为在植物中仅产生病毒抗原(例如HA蛋白)，而磷脂和颗粒的其他组分通过化学或生物化学手段从非植物来源生产。令人惊讶地，本发明的纯的病毒体颗粒显示出与现有领域VLP相比增强的免疫原性。不限制于任何理论，假定因为纯的病毒体颗粒不含有植物糖脂并且更类似于“天然”病毒体的结构，抗原(例如HA蛋白)的重要表位没有被遮蔽并且因此本发明的病毒体颗粒导致更强的免疫响应。其次，向病毒抗原(例如HA蛋白)有控制地加入磷脂(和其他成分)允许受控的颗粒组成。这意味着颗粒的尺寸以及它们的组成可以根据个体需要被精确地控制并且调节。而且，免疫原性可以通过精细调节颗粒的组成来改进。如本文所用的，“磷脂的混合物”包含天然或合成的磷脂或其混合物。至少其含有选自甘油磷脂(例如磷酸卵磷脂或磷脂酰乙醇胺)和胆固醇的组的一种或多种化合物，尤其是磷酸卵磷脂和/或磷脂酰乙醇胺。颗粒的受控凝集允许将佐剂掺入(即包埋或锚定于)颗粒自身的脂双层中。为了增强免疫原性，在一些实施方案中，所述脂双层包含至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物，其被锚定在脂双层中产生为疫苗接种所准备的稳定的颗粒。将二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物掺入病毒体颗粒的脂双层中的优点在于病毒体颗粒表面、抗原分布和佐剂分布之间的理想比例可以保持稳定。
在本发明的背景下，术语“二酰氧基丙基半胱氨酸”是指通式I的分子
权利要求
1.一种合成生产的病毒体颗粒，其包含Q)烟草属植物中重组生产的流感血凝素(HA)抗原和(ii)脂双层，其中所述脂双层包含在所述脂双层中锚定的至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物。
2.根据权利要求1所述的病毒体颗粒，其中所述流感血凝素(HA)抗原位于所述病毒体颗粒的脂双层中。
3.根据权利要求1或2所述的病毒体颗粒，其中所述二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物选自由MALP-2、聚乙二醇化的二酰氧基丙基半胱氨酸和4-ARM- 二酰氧基丙基半胱氨酸所组成的组，特别地为 BPP-Glyc-Cys-4-arm-PEG。
4.根据权利要求3所述的病毒体颗粒，其中所述二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物选自由MALP-2和S-[2, 3_ 二(酸氧基)-(2R)-丙基]-L-半胱;酸基_竣基聚乙二醇所组成的组。
5.根据权利要求4所述的病毒体颗粒，其中所述所述二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物是S-[2, 3- 二(掠榈酸基氧基)-(2R)_丙基]-L-半胱酸基_羧基聚乙二醇。
6.一种疫苗，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的病毒体颗粒，所述病毒体颗粒任选地与适合的药学上可接受的物质稀释剂组合。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其与适合的药学上可接受的物质佐剂组合。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的疫苗，其用于鼻施用。
9.一种生产病毒体颗粒的方法，其包括下列步骤: a)在植物中重组生产流感血凝素(HA)抗原； b)生产磷脂混合物，其包含至少一种二酰氧基丙基半胱氨酸轭合物；和 c)将所述病毒抗原与所述磷脂的混合物重组以形成所述病毒体颗粒。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的病毒体颗粒、根据权利要求6至8中任一项所述的疫苗或通过权利要求9的方法生产的病毒体颗粒用于预防流感的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其包括向有需要的患者施用适当剂量的根据权利要求I至5中任一项所述的病毒体颗粒、根据权利要求6至8中任一项所述的疫苗或通过权利要求9的方法生产的病毒体颗粒。
全文摘要
本发明涉及使用植物中表达的病毒抗原尤其是流感抗原生产一种新型病毒体颗粒以及包含这些病毒体颗粒的疫苗尤其是流感疫苗。
文档编号A61K39/145GK103154251SQ201180047873
公开日2013年6月12日 申请日期2011年9月29日 优先权日2010年9月30日
发明者马里亚·迪纳罗 申请人:佛兰瓦克斯有限责任公司