专利名称：在制备抗毒素、抗血清中去除病毒的方法
技术领域：
本发明涉及一种去除病毒的方法，尤其是一种在制备抗毒素、抗血清制品过程中， 同时去除残留病毒的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
自2003年以来，国家要求生物行业要对生物提取产品要进行病毒的灭活/去除。 目前对于人血液制品，国内外较为成熟的病毒灭活/去除方法，主要有物理和化学法两大类，其中物理法包括加热、巴氏灭活、光照、纳米膜过滤等等，由于多数蛋白在前三者条件下不稳定，所以应避免采用，纳米膜过滤技术虽有很好的病毒去除作用，但因使用范围受限， 仅适用于分子较小(直径较小)的蛋白，且价格昂贵，因此不实用。化学法主要包括有机溶剂/去污剂(S/D)法、辛酸钠法、低pH法等等，其中S/D法最早用于人血液制品的病毒灭活，但在室温下需要6小时才能灭活病毒，不仅对产品收率有影响，而且有机溶剂/去污剂去除较为麻烦；辛酸钠法是新开发的病毒灭活方法，具有安全、快速和高效的特点；低PH法仅适用于对酸不敏感的样品，一般需要较长的灭活时间。对于动物血清来源的抗毒素、抗血清类生物制品，由于其纯化过程异常复杂，质量控制较难，因此在以动物血液为原料的抗毒素、抗血清(IgG或F(ab’ ) 2)的生产过程中，设置病毒的去除/灭活是非常重要的，只有这样才能保证抗毒素、抗血清类生物制品的安全。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、快速、经济适用的，在制备抗毒素、抗血清过程中，同时能彻底去除血浆中残留病毒的方法。本发明通过下列技术方案完成一种在制备抗毒素、抗血清中去除病毒的方法，其特征在于包括下列步骤
A、将免疫血浆稀释2 4倍体积后，调节稀释液pH值至2.8 3. 6 ；
B、在每IOOml步骤A的稀释液中，加入0.1 Ig胃酶，于四 31°C下消化1 3小时，得消化液；
C、按每IOOml消化液加入13 17g硫酸铵的量，在步骤B的消化液中，加入硫酸铵至形成混悬液，并调节溶液PH值为4. 8 5. 6，然后将混悬液加温至57 59 °C后，保持20 40分钟，再降温至20 35°C，过滤取上清液；
D、将步骤C的上清液pH值调整至7.0 7. 4，并按每IOOml上清液加入15 25g硫酸铵的量，在上清液中加入硫酸铵进行沉淀，静置90 180分钟后，过滤取沉淀物；
E、将步骤D的沉淀物稀释至蛋白含量低于20g/L，调整稀释液pH值为7.7 7. 9，并按每IOOml稀释液加入0. 6 1. Og明矾的量，在稀释液中加入明矾进行沉淀，静置60 120 分钟后，过滤得上清液；F、将步骤E的上清液，按常规浓缩后，得到抗毒素、抗血清中间原液；
G、将步骤F的抗毒素、抗血清中间原液的蛋白浓度调至10 100g/L，通过装填有阴离子交换剂的离子交换吸附柱上样，之后用磷酸盐缓冲液洗柱，收集穿透液；
H、将步骤G收集的穿透液按常规调整效价、蛋白含量、pH值、渗透压，并按常规量加入防腐剂后，经常规除菌、过滤，分装得去除病毒的抗毒素、抗血清制品。所述步骤A、E的稀释是用注射用水或者质量浓度为0. 8 1. 0%的氯化钠溶液进行稀释的。所述步骤A、C、D、E的pH值调整采用1 4mol/L的HCl或NaOH调整。所述步骤G的上样时间为1 3小时。所述步骤G的磷酸盐缓冲液的浓度为10 50mM，pH值为6. 0 8. 0。所述步骤G 的阴离子交换剂，优选 Q Sepharose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow 中的一种。所述抗血清制品包括破伤风抗毒素、抗狂犬病血清或抗蛇毒血清。所述步骤F的上清液还可按下列方法处理将上清液通过3 5万分子量的膜，浓缩体积至五分之一时，在浓缩液中加入20 30mM (毫摩尔)、pH值为6. 0 8. 0、加入量是步骤A的原料血浆体积的2 4倍的PB，进行置换、浓缩，直至硫酸铵含量低于1. 0 g/L，即得抗毒素、抗血清中间原液。所述步骤H收集的穿透液还可按下列方法处理在穿透液中，加入注射用水调整蛋白含量至<100 g/L，再加入氯化钠使氯化钠含量为3.0 6.0 g/L，调节渗透压至 260 400 mOsmol/kg，再加入间甲酚使间甲酚含量< 2. 5 g/L，调整pH值至6. 0 7. 0 ；用 0. 22 μ m的除菌过滤器进行澄清除菌过滤，制成抗毒素、抗血清原液，在冷暗处保存至少1 个月，使原液稳定后，按常规用注射用水稀释后，调整效价、蛋白质浓度、PH值、氯化钠含量以及渗透压，用0. 22 μ m的除菌过滤器进行除菌过滤，按《生物制品分装规程》进行分装，得去除病毒的抗毒素、抗血清制品。本发明具有下列优点和效果采用上述方案，可在制备抗毒素、抗血清制品过程中，同时去除可能存在或污染的病毒，不需要增加额外的工艺步骤，操作简单，稳定性好，不会引入对人体有害的物质，确保制品在临床应用过程中的安全性，也最大限度地保证了制品的生物活性。经检验，本发明去除病毒的方法可分別将样品中8.5 logs水疱性口炎病毒 (Vesicular stomatitis virus, VSV)和 9. 0 logs 的脊髄灰质炎病毒(Poliovirus, PV-I )降到2. 0 2. 3 logs,下降滴度均大于4 logs,证明去除病毒工艺有效，实用价值高。抗毒素、抗血清制品的质量，包括蛋白浓度、比活、纯度等，较国家标准有了较大提高。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作更详细的介绍。实施例1
在制备破伤风抗毒素中去除病毒的方法，包括下列步骤
A、将免疫血浆用注射用水稀释2倍体积后，用2mol/L的HCl调节稀释液pH值至2.8 ；
B、在每100ml步骤A的稀释液中，加入0.Ig胃酶，于下消化3小时，得消化液；
C、按每100ml消化液加入13g硫酸铵的量，在步骤B的消化液中，加入硫酸铵至形成混悬液，并用anol/L的HCl调节溶液pH值为4. 8，然后将混悬液加温至57°C后，保持20分钟， 再降温至20°C，过滤取上清液；
D、用2mol/L的NaOH，将步骤C的上清液pH值调整至7.0，并按每IOOml上清液加入 15g硫酸铵的量，在上清液中加入硫酸铵进行沉淀，静置90分钟后，过滤取沉淀物；
E、将步骤D的沉淀物用注射用水稀释至蛋白含量低于20g/L，用2mol/L的NaOH调整稀释液PH值为7. 7，并按每IOOml稀释液加入0. 6g明矾的量，在稀释液中加入明矾进行沉淀，静置120分钟后，过滤得上清液；
F、将步骤E的上清液按下列方法处理将上清液通过3万分子的膜，浓缩体积至五分之一时，在浓缩液中加入20mM (毫摩尔)、pH值为6. 0、加入量是步骤A的原料血浆体积的4倍的PB，进行置换、浓缩，直至硫酸铵含量低于1. Og/L,即得破伤风抗毒素中间原液。G、将步骤F的破伤风抗毒素中间原液的蛋白浓度调至40g/L，通过装填有DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换剂的离子交换吸附柱上样1小时，之后用浓度为10mM，pH 值为6. 0的磷酸盐缓冲液洗柱，收集穿透液；
H、在步骤G收集的穿透液按下列方法处理在穿透液中，加入注射用水调整蛋白含量至40 g/L，再加入氯化钠使氯化钠含量为3.0 g/L，调节渗透压为沈0 mOsmol/kg，再加入间甲酚使间甲酚含量为2.0 g/L，用2mol/L的NaOH调整pH值至6. 0 ；用0. 22 μ m的除菌过滤器进行澄清除菌过滤，制成破伤风抗毒素原液，在冷暗处保存至少1个月，使原液稳定后，按常规用注射用水稀释后，调整效价、蛋白质浓度、PH值、氯化钠含量以及渗透压，用 0. 22 μ m的除菌过滤器进行除菌过滤，按《生物制品分装规程》进行分装，得去除病毒的破伤风抗毒素制品。实施例2
在制备抗狂犬病血清中去除病毒的方法，包括下列步骤
A、将免疫血浆用注射用水稀释4倍后，用2mol/L的HCl调节稀释液pH值至3.6 ；
B、在每100ml步骤A的稀释液中，加入Ig胃酶，于31°C下消化1小时，得消化液；
C、按每100ml消化液加入17g硫酸铵的量，在步骤B的消化液中，加入硫酸铵至形成混悬液，并用2mol/L的NaOH调节溶液pH值为5. 6，然后将混悬液加温至59°C后，保持30分钟，再降温至35°C，过滤取上清液；
D、用2mol/L的NaOH，将步骤C的上清液pH值调整至7.4，并按每100ml上清液加入 25g硫酸铵的量，在上清液中加入硫酸铵进行沉淀，静置180分钟后，过滤取沉淀物；
E、将步骤D的沉淀物用注射用水稀释至蛋白含量低于20g/L，用2mol/L的NaOH调整稀释液PH值为7. 9，并按每100ml稀释液加入1. Og明矾的量，在稀释液中加入明矾进行沉淀，静置60分钟后，过滤得上清液；
F、将步骤E的上清液按下列方法处理即将上清液通过5万分子量的膜，浓缩体积至五分之一时，在浓缩液中加入30mM(毫摩尔)、pH值为8. 0的PB，进行置换、浓缩至硫酸铵含量低于0. lg/ml, PB的加入量是步骤A的原料血浆体积的2倍，即得抗狂犬病血清中间原液；
G、将步骤F的抗狂犬病血清中间原液的蛋白浓度调至100g/L，通过装填有DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换剂的离子交换吸附柱上样3小时，之后用浓度为50mM，pH 值为8. 0的磷酸盐缓冲液洗柱，收集穿透液；
H、将步骤G收集的穿透液按下列方法处理在穿透液中，加入注射用水调整蛋白含量
5至60 g/L，再加入氯化钠使氯化钠含量为6.0 g/L，调节渗透压为400 mOsmol/kg，再加入间甲酚使间甲酚含量为2. 2 g/L,用2mol/L的NaOH调整pH值至7. 0 ；用0. 22 μ m的除菌过滤器进行澄清除菌过滤，制成抗狂犬病血清原液，在冷暗处保存至少1个月，使原液稳定后，按常规用注射用水稀释后，调整效价、蛋白质浓度、PH值、氯化钠含量以及渗透压，用 0. 22 μ m的除菌过滤器进行除菌过滤，按《生物制品分装规程》进行分装，得去除病毒的抗狂犬病血清制品。实施例3
在制备抗狂犬病血清中去除病毒的方法，包括下列步骤
A、将免疫血浆用注射用水稀释3倍后，用质量浓度为1.0%的氯化钠溶液调节稀释液pH 值至3. 2 ；
B、在每IOOml步骤A的稀释液中，加入0.5g胃酶，于30°C下消化2小时，得消化液；
C、按每IOOml消化液加入15g硫酸铵的量，在步骤B的消化液中，加入硫酸铵至形成混悬液，并用质量浓度为1. 0%的氯化钠溶液调节溶液pH值为5. 2，然后将混悬液加温至58°C 后，保持25分钟，再降温至30°C，过滤取上清液；
D、用质量浓度为1.0%的氯化钠溶液，将步骤C的上清液pH值调整至7. 2，并按每IOOml 上清液加入20g硫酸铵的量，在上清液中加入硫酸铵进行沉淀，静置150分钟后，过滤取沉淀物；
E、将步骤D的沉淀物用注射用水稀释至蛋白含量低于20g/L，用质量浓度为1.0%的氯化钠溶液调整稀释液PH值为7. 8，并按每IOOml稀释液加入0. Sg明矾的量，在稀释液中加入明矾进行沉淀，静置90分钟后，过滤得上清液；
F、将步骤E的上清液按下列方法处理即将上清液通过5万分子的膜，浓缩体积至五分之一时，在浓缩液中加入30mM(毫摩尔)、pH值为7. 0的PB，进行置换、浓缩至硫酸铵含量低于0. lg/ml, PB的加入量是步骤A的原料血浆体积的3倍，即得抗狂犬病血清中间原液；
G、将步骤F的抗狂犬病血清中间原液的蛋白浓度调至100g/L，通过装填有DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换剂的离子交换吸附柱上样3小时，之后用浓度为30mM，pH 值为7. 0的磷酸盐缓冲液洗柱，收集穿透液；
H、将步骤G收集的穿透液按下列方法处理在穿透液中，加入注射用水调整蛋白含量至60 g/L，再加入氯化钠使氯化钠含量为4. 5 g/L，调节渗透压为300 mOsmol/kg，再加入间甲酚使间甲酚含量为2. 0 g/L，用质量浓度为1. 0%的氯化钠溶液调整pH值至6. 5 ；用 0. 22 μ m的除菌过滤器进行澄清除菌过滤，制成抗狂犬病血清原液，在冷暗处保存至少1个月，使原液稳定后，按常规用注射用水稀释后，调整效价、蛋白质浓度、PH值、氯化钠含量以及渗透压，用0. 22 μ m的除菌过滤器进行除菌过滤，按《生物制品分装规程》进行分装，得去除病毒的抗狂犬病血清制品。实施例4
在制备抗蛇毒血清中去除病毒的方法，包括下列步骤
A、将免疫血浆用注射用水稀释3倍后，用质量浓度为0.8%的氯化钠溶液调节稀释液pH 值至3. 4 ；
B、在每100ml步骤A的稀释液中，加入0.3g胃酶，于下消化3小时，得消化液；
C、按每100ml消化液加入13g硫酸铵的量，在步骤B的消化液中，加入硫酸铵至形成混悬液，并用质量浓度为0. 8%的氯化钠溶液调节溶液pH值为5. 0，然后将混悬液加温至57°C 后，保持35分钟，再降温至，过滤取上清液；
D、用质量浓度为0.8%的氯化钠溶液，将步骤C的上清液pH值调整至7. 0，并按每IOOml 上清液加入18g硫酸铵的量，在上清液中加入硫酸铵进行沉淀，静置90分钟后，过滤取沉淀物；
E、将步骤D的沉淀物用注射用水稀释至蛋白含量低于20g/L，用质量浓度为0.8%的氯化钠溶液调整稀释液PH值为7. 7，并按每IOOml稀释液加入0. 6g明矾的量，在稀释液中加入明矾进行沉淀，静置60分钟后，过滤得上清液；
F、将步骤E的上清液，按常规浓缩后，得到抗蛇毒血清中间原液；
G、将步骤F的抗蛇毒血清中间原液的蛋白浓度调至80g/L，通过装填有QSepharose Fast Flow阴离子交换剂的离子交换吸附柱上样2小时，之后用浓度为30mM，pH值为7. 2的磷酸盐缓冲液洗柱，收集穿透液；
H、将步骤G收集的穿透液按常规调整效价、蛋白含量、pH值、渗透压，并按常规量加入防腐剂后，经常规除菌、过滤，分装得去除病毒的抗蛇毒血清制品。下面是利用本发明的方法进行病毒去除以及对去除效果的检测实例，去除效果的检测依据为国药监注[2002]第160号文，验证实验由本公司与武汉大学一中国典型培养物保藏中心完成。1.各取三批破伤风免疫血浆(蛋白浓度50 80g/L)，分别加入水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV，滴度为8. 0 TCID50/ml)和脊髄灰质炎病毒 (Poliovirus，PV-1，滴度为:9.0 TCID50/ml)为指示病毒，混勻；
2.将上述含有指示病毒的破伤风免疫血浆，照本发明实施例1的方法进行破伤风抗毒素的制备，同时进行去除病毒验证；
3.取样进行病毒滴度检测；
4.同时留存部分病毒作对照；
5.病毒检测
采用96孔培养板微量法培养4天观察，用Karber法计算病毒滴度，以评估去除/灭活病毒效率。病毒去除验证方案设未处理的含病毒阳性对照、系统空白对照(含病毒)。验证结果见表1、表2。滴度计量单位TCID50/ml。结论本去除病毒工艺可分別将样品中8.5 logs水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)和 9· 0 logs 的脊髄灰质炎病毒(Poliovirus，PV-1 )降到 2.0 2. 3 logs，且重复三次检测数据相近，证明去除病毒方法有效。
表1.去除VSV病毒结果
权利要求
1.一种在制备抗毒素、抗血清中去除病毒的方法，其特征在于包括下列步骤A、将免疫血浆稀释2 4倍体积后，调节稀释液pH值至2.8 3. 6 ；B、在每IOOml步骤A的稀释液中，加入0.1 Ig胃酶，于四 31°C下消化1 3小时，得消化液；C、按每IOOml消化液加入13 17g硫酸铵的量，在步骤B的消化液中，加入硫酸铵至形成混悬液，并调节溶液PH值为4. 8 5. 6，然后将混悬液加温至57 59 °C后，保持20 40分钟，再降温至20 35°C，过滤取上清液；D、将步骤C的上清液pH值调整至7.0 7. 4，并按每IOOml上清液加入15 25g硫酸铵的量，在上清液中加入硫酸铵进行沉淀，静置90 180分钟后，过滤取沉淀物；E、将步骤D的沉淀物稀释至蛋白含量低于20g/L，调整稀释液pH值为7.7 7. 9，并按每IOOml稀释液加入0. 6 1. Og明矾的量，在稀释液中加入明矾进行沉淀，静置60 120 分钟后，过滤得上清液；F、将步骤E的上清液，按常规浓缩后，得到抗毒素、抗血清中间原液；G、将步骤F的抗毒素、抗血清中间原液的蛋白浓度调至10 100g/L，通过装填有阴离子交换剂的离子交换吸附柱上样，之后用磷酸盐缓冲液洗柱，收集穿透液；H、将步骤G收集的穿透液按常规调整效价、蛋白含量、pH值、渗透压，并按常规量加入防腐剂后，经常规除菌、过滤，分装得去除病毒的抗毒素、抗血清制品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤A、E的稀释是用注射用水或者质量浓度为0. 8 1. 0%的氯化钠溶液进行稀释的。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤A、C、D、E的pH值调整采用1 4mol/L 的 HCl 或 NaOH 调整。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤G的磷酸盐缓冲液的浓度为10 50mM, pH 值为 6. 0 8. 0。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤G的上样时间为1 3小时，阴离子交换剂为 Q Sepharose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow 中的一禾中。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤F的上清液按下列方法处理将上清液通过3 5万分子量的膜，浓缩体积至五分之一时，在浓缩液中加入20 30mM、pH值为6. 0 8. 0、加入量是步骤A的原料血浆体积的2 4倍的PB，进行置换、浓缩，直至硫酸铵含量低于1.0 g/L，即得抗毒素、抗血清中间原液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤H收集的穿透液按下列方法处理在穿透液中，加入注射用水调整蛋白含量至< 100 g/L，再加入氯化钠使氯化钠含量为 3.0 6.0 g/L，调节渗透压至260 400 mOsmol/kg，再加入间甲酚使间甲酚含量< 2. 5 g/ L，调整pH值至6. 0 7. 0 ；用0. 22 μ m的除菌过滤器进行澄清除菌过滤，制成抗毒素、抗血清原液，在冷暗处保存至少1个月，使原液稳定后，按常规用注射用水稀释后，调整效价、蛋白质浓度、PH值、氯化钠含量以及渗透压，用0. 22 μ m的除菌过滤器进行除菌过滤，分装，得去除病毒的抗毒素、抗血清制品。
全文摘要
本发明提供一种在制备抗毒素、抗血清中去除病毒的方法，它将免疫血浆稀释并调节pH值后，经胃酶消化、加温变性、明矾吸附、超滤浓缩/脱盐、离子交换层析得收集液，经除菌过滤后，分装得抗毒素、抗血清制品。这样即可在制备抗毒素、抗血清过程中，同时除去原料血浆中可能存在的病毒。本发明所提供的抗毒素、抗血清的病毒去除方法具有简单、快速、经济适用的特点，在生产过程中能彻底去除原料血浆中可能存在的病毒，保证产品的质量。
文档编号A61K35/16GK102512449SQ201210004549
公开日2012年6月27日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者吴笛, 杨冬, 罗靖雄 申请人:玉溪九洲生物技术有限责任公司