专利名称：负载干细胞的心包膜、及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种医用材料，尤其涉及一种用于盆底重建及腹壁疝气修补的负载干細胞的脱細胞心包膜、及其制备方法和应用。
背景技术：
盆底损伤及功能退化造成的女性盆底器官脱垂(Pelvic Organ ftx)lapSe，P0P)和压カ性尿失禁(Stress Urinary Incontinence, SUI)严重影响女性生活质量，并已成为较为突出的社会生活问题。造成女性盆底器官脱垂的原因包括产伤、神经肌肉的损伤、环境因素及遗传因素等。治疗盆底器官脱垂，除了功能训练外，手术重建是主要的治疗方法。传统的外科治疗行阴道前后壁修补和子宮切除术，两者均不能提高组织本身的强度，未能达到盆底解剖结构重建的目的，故术后复发率高。近年来，合成网片材料在盆底重建手术中得到了广泛应用，随机对照试验表明应用网片的盆底重建手术的术后复发率明显低于传统盆底修补木。盆底重建手术中使用的合成网片材料多为聚丙烯、聚乙烯网片，其孔隙率较高，组织融合较佳，具有良好的生物力学性能。如杨苹等在《聚丙烯网片在治疗女性盆底障碍性疾病手术中的应用研究》(河北医药， 2010年第18期)一文中公开了使用人工合成聚丙烯网片进行盆底修补和重建，具有经济， 微创，盆底整体修复可保留子宮，并发症少，术后复发率低等优点，近期效果肯定；李怀芳等在《聚丙烯网片在女性全盆底功能重建中的应用》(中国实用妇科与产科杂志，2007年第8 期)一文中探讨了聚丙烯网片在保留子宮的同时进行盆底重建的可行性和有效性，中、短期疗效稳定。但是人工合成网片仍存在较多并发症，如侵蚀(Erosion)、暴露(Exposure)、感染(Infection)、疼痛(Pain)、性交不适(Dyspareunia)等影响患者术后生活质量。Daniel Altman等人对比分析了传统外科手术和使用聚乙烯补片手术的两种患者，結果，使用聚乙烯补片与传统修补术相比，短期改善效果更好，但是有更多的术后并发症和返エ修补的需要。从目前盆底修复和重建外科的发展趋势来看，网片修补比传统修补术有更好的应用前景，网片的材质也在不断的经历尝试和革新，但是仍需要制备具有更高改善率和更少并发症的网片，因此，制备新的盆底重建医用材料是盆底重建领域的重要研究内容。
发明内容
针对目前盆底重建材料存在的缺陷，本发明提供了一种用于盆底重建的新的材料、以及所述材料的制备方法，以脱細胞心包膜为基材，负载干細胞，制成一种负载干細胞的心包膜补片。本发明的第一个目的是提供一种制备所述负载干細胞心包膜的方法，步骤包括 步骤1，将心包膜进行脱細胞、化学交联改性制备脱細胞心包膜；
步骤2，将脱細胞心包膜与干細胞共培养，得到负载干細胞脱的細胞心包膜。
其中，所述干细胞选自脂肪干細胞、骨髄间充质干細胞、羊膜干細胞。其中，所述心包膜可以是牛心包膜、羊心包膜、猪心包膜。本发明所述的制备负载干細胞的心包膜的方法，步骤2中所述共培养方法包括: 干細胞的分离和培养；消化收集培养后的干細胞接种于脱細胞心包膜上，然后进行培养。其中，干細胞接种于脱細胞心包膜时的接种浓度优选为IX IO4个/cm2。其中，所述消化收集的培养后的干細胞优选为第4代干細胞。其中，所述培养温度为优选为35 38 °C，更优选为37で。本发明的第二个目的是提供ー种上述方法制备的负载干細胞的心包膜。本发明的第三个目的是提供ー种上述负载干細胞的心包膜的应用，所述负载干细胞的心包膜用于制备盆底重建及腹壁疝气修补材料。优选地，所述盆底重建材料为负载干細胞的心包膜补片。所述负载干細胞的心包膜补片厚度优选为(0. 5士0. 2)mm。本发明制备的负载干細胞的心包膜补片，干細胞与心包膜粘附性良好，細胞分泌基质旺盛，通过增殖检测，干細胞在心包膜上增值速度快，说明具有良好的生物相容性。本发明所述负载干細胞的心包膜补片，可用于临床盆底重建及腹壁疝气修补外科，能够制作成一种新的重建材料，为减少重建术后并发症提供有意义的參考。
图1为HE染色观察脱細胞牛心包膜照片； 图2为扫描电镜观察脱細胞牛心包膜照片；
图3为兔脂肪干細胞原代培养第二天倒置相差显微镜照片； 图4为荧光倒置相差显微镜观察兔脂肪干細胞在脱細胞牛心包膜； 图5为扫描电镜观察兔脂肪干細胞在脱細胞牛心包膜上粘附生长情况照片； 图6为兔脂肪干細胞牛心包膜体外复合培养增殖曲线图。
具体实施例方式本发明提供了一种负载干細胞的心包膜、所述负载干細胞心包膜的制备方法和应用，利用化学交联的脱細胞心包膜与干細胞共培养，最终获得负载干細胞的脱細胞心包膜。下面通过具体实施了对本发明负载干細胞的心包膜、及其制备方法和应用进行详细的介绍和描述，以使更好地理解本发明内容，但是应当理解的是，下述实施例并不限制本发明范围。实施例1
步骤1，将牛心包膜进行脱細胞、化学交联改性制备脱細胞牛心包膜牛心包膜从正常小牛壁层心包膜中获取，经过脱細胞、清洗、抗病毒和环氧乙烷化学交联改性处理后，冻干，电子束消毒备用。成品脱細胞牛心包膜材料为瓷白色膜状物，柔软，富有弾性。图1为HE (苏木精-伊红)染色脱細胞牛心包膜在200倍放大倒置相差显微镜下观察的照片，从图中可以看出，脱細胞牛心包膜由呈波浪状、染成红色的胶原纤维组成，光滑面纤维排列紧密，粗糙面纤维排列疏松，无细胞残留。
扫描电镜100倍放大观察脱細胞牛心包膜，电镜照片见图2，可见脱細胞牛心包膜纤维排列致密且方向较一致，纤维保存完好，无细胞残留。步骤2，将脱細胞牛心包膜与干細胞共培养，得到负载干細胞脱細胞牛心包膜 2. 1.兔脂肪干細胞(rADSCs)的分离和培养
取兔腹股沟部皮下脂肪组织2. (Γ3. Og,充分剪碎后，加入0. 1% I型胶原酶溶液20mL， 在37°C恒温摇床消化60min后，2000r/min离心lOmin，除去上清液并获得高密度的细胞沉淀物，加入培养液使細胞重悬，此即为脂肪干細胞。按IO6个/mL的細胞密度接种于培养皿内，加入培养液至8mL。将接种好細胞的培养皿置于37°C、体积分数为5%C02、100%饱和湿度的条件下，培养4 后首次换液。倒100倍放大置相差显微镜下观察见大量的细胞贴壁和漂浮的血細胞(图3)，細胞伸展呈成纤维细胞样，生长有方向性。用PBS反复轻轻冲洗去除漂浮的細胞，加入培养液。隔天换液，細胞融合至80%传代。本实施例中选用第4代rADSCs进行实验。2. 2. Dio标记的rADSCs接种于脱細胞牛心包膜材料
消化收集第4代rADSCs后，用无血清的LG-DMEM调整细胞浓度至5 X IO5个/mL。每毫升细胞悬液加5μ 的DiO染液，混合均勻。放入培养箱孵育20min，1500r/min离心5min，弃上清。用含10%FBS的LG-DMEM液清洗2次后把标记好的rADSCs按1 X IO4个/cm2接种在大小为IOmmX IOmmXO. 5mm的脱細胞牛心包膜材料上，置于37°C培养箱培养4小时后加GM 液，以刚没过材料为宜，继续培养，隔天换液。倒置荧光显微镜观察細胞形态，扫面电镜观察細胞的生长状态。100倍倒置荧光显微镜观察(图4和图5) :DiO标记的兔脂肪干細胞-脱細胞牛心包复合物体外培养5d吋，可见带绿色荧光的細胞均勻黏附于脱細胞牛心包膜材料上；细胞形态呈纤维样或卵圆形，以卵圆形为主(图4)。100倍扫描电镜观察兔脂肪干細胞-脱細胞牛心包膜复合物体外培养5d时，细胞与材料黏附良好，細胞分泌基质较旺盛，与脱細胞牛心包膜材料连成一体(图5)。收集第4代rADSCs重悬后，以1 X IO4个/cm2的密度接种于脱細胞牛心包膜支架材料上，置37°C培养箱培养4小时后加培养液，以刚没过材料为宜，继续培养，隔天换液。接种后1，2，3，4，5，6，7，8天取样本做DNA含量检测各复合物碾碎后分別放入EP管中，加入 500 μ L蛋白酶K (0. 5mg/mL)溶液56°C水浴过夜，12000g离心10分钟，收集上清液。各待测样本40 μ L加入黑色96孔板，各孔加入160 μ L Hoechest 33258工作液，37°C避光孵育 20min,轻弹板孔后，酶标仪測定荧光强度，激发波长为360nm，发射波长465nm，通过DNA含量计算細胞数量。兔脂肪干細胞-脱細胞牛心包膜复合物的体外増殖检测(图6)兔脂肪干細胞在脱細胞牛心包上増殖良好，3、d时增势速度最快，6d时兔脂肪干細胞在脱細胞牛心包上增殖达到顶峰，以后増殖基本趋缓，说明rADSCs与牛心包膜具有良好的生物相容性。实施例2
參照实施例1所述方法，采用猪心包膜作为基材，将小鼠骨髄间充质干細胞接种于脱細胞猪心包膜上共培养，DNA定量法测定显示小鼠骨髄间充质干細胞在交联脱細胞猪心包膜上増殖良好，DIO染色标记跟踪小鼠骨髄间充质干細胞在交联脱細胞猪心包膜上生长良好，扫描电镜观察示小鼠骨髄间充质干細胞在交联脱細胞猪心包膜上的形态正常，分泌细胞基质旺盛。将本发明上述实施例制备的负载干細胞的心包膜制成用于盆底重建的补片，动物实验表明，相比于人工合成网片(聚乙烯和聚丙烯)，几乎不会出现新的压カ性尿失禁，并且没有出现并发症；此外还可以用于腹壁疝气修补。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
权利要求
1.一种制备负载干細胞的心包膜的方法，其特征在干，步骤包括 步骤1，将心包膜进行脱細胞、化学交联改性制备脱細胞心包膜；步骤2，将脱細胞心包膜与干細胞共培养，得到负载干細胞脱細胞心包膜。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在干，所述干细胞选自脂肪干細胞、骨髄间充质干細胞、羊膜干細胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在干，步骤2中所述共培养方法包括干細胞的分离和培养；消化收集培养后的干細胞接种于脱細胞心包膜上，然后进行共iロ养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在干，所述心包膜选自牛心包膜、羊心包膜、猪心包膜。
5.ー种上述任意一项权利要求所述方法制备的负载干細胞的心包膜。
6.ー种包括权利要求5所述的负载干細胞的心包膜应用，其特征在干，所述负载干细胞的心包膜用于制备盆底重建材料及腹壁疝气修补材料。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在干，所述盆底重建及腹壁疝气修材料为负载干細胞的心包膜补片。
全文摘要
本发明提供了一种负载干细胞的心包膜的制备方法、将干细胞接种于脱细胞的心包膜上，制备出一种负载干细胞的心包膜、以及负载干细胞的心包膜补片。干细胞与脱细胞心包膜之间具有良好的生物相容性，制作过程简单易行，不涉及任何有毒有害试剂，所制备的负载干细胞的心包膜及其补片可用于临床盆底重建及腹壁疝修补外科。
文档编号A61L27/38GK102552997SQ20121000570
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者冯洁, 吴氢凯, 崔磊, 杨军, 滕银成, 程慧 申请人:上海市第六人民医院