专利名称：人pbx1基因的用途及其相关药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及人PBXl基因的用途及其相关药物。
背景技术：
核糖核酸干扰(RNA interference, RNAi)是由双链RNA介导的序列特异性的转录后基因沉默现象。RNAi技术具有较高的转录后沉默效率和特异性，有望成为肿瘤疾病基因治疗的工具(Izquierdo M. Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther. 2005 ； 12 (3) :217-27.)。质粒或病毒载体可操纵一段 45_50nt 的发夹结构RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达，shRNA在细胞内会自动被加工成为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，继而引发基因沉默或者表达抑制。慢病毒载体具有携带基因片段容量大、转染效率高、不易诱发宿主免疫反应、可稳定抑制靶基因的表达等优点，已被广泛应用于基因治疗、疫苗生产以及科学研究等领域 (SinnPL， Sauter SL, McCray PB.Gene therapy progress and prospects !development of improved lentiviral and retroviral vectors—design，biosafety，and production. Gene Ther 2005 ；12 :1089-98.)。前B 细胞白血病转录因子 I (pre-B-cell leukemia homeobox 1，PBX1)属于具有调节胚胎发育功能的TALE(three amino acid loop extension)家族蛋白，可以和 H)X、Meis等家族蛋白一起结合到DNA的保守区5' -ATCAATCAA-Sr，调节许多重要基因的转录(Krosl J，Baban S，Krosl G，Rozenfeld S，Largman C，Sauvageau G. Cellular proliferation and transformation induced by H0XB4 and HOXB3 proteins involves cooperation with PBXl. Oncogene. 1998 ; 16(26) :3403-12. Pan L，Xie Y，Black TA， Jones CA，Pruitt SC，Gross KW. An Abd-B class H0X. PBX recognition sequence is required for expression from the mouse Ren-lcgene. J Biol Chem. 2001 ；276 (35) 32489-94. Moens CB，Selleri L. Hox cofactors in vertebrate development. Dev Biol. 2006 ；291 (2) :193-206. Knoepfler PS, Calvo KR，Chen H，Antonarakis SE，Kamps MP. Meis land pKnoxI bind DNA cooperatively with Pbxl utilizing an interaction surface disrupted in oncoprotein E2a-Pbxl. Proc Natl Acad Sci USA. 1997 ；94(26) 14553-8. Okada Y，Nagai R，Sato T，Matsuura E，Minami T，Morita I，Doi T. Homeodomain proteins MEISl and PBXs regulate the lineage-specific transcription of the platelet factor 4 gene. Blood. 2003 ; 101 (12) :4748-56.)。PBXl 基因在调节血液细胞产生、维持造血干细胞和胚胎干细胞的自我更新过程中发挥重要功能(Chiba S. Homeobox genes in normal hematopoiesis and leukemogenesis. Int J Hematol. 1998 ；68 (4) 343-53. Chan KK，Zhang J，Chia NY,Chan YS,Sim HS，Tan KS,Oh SK,Ng HH，Choo AB. KLF4 and PBXl directly regulate NANOG expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 2009 ；27 (9) :2114-25.)。与其它TALE家族蛋白类似，PBXl基因还在组织发育中发挥重要作用，如调节成骨形成，脾脏、肾脏的胚胎发育和泌尿生殖器官的分化等(CheungCL，Chan BY，Chan V，Ikegawa S，Kou I，Ngai H，Smith D，Luk KD,Huang QY,Mori S，Sham PC, Kung AW. Pre-B-cell leukemia homeobox I (PBXl) shows functional and possible genetic association with bone mineral density variation. Hum Mol Genet. 2009 ； 18(4) :679-87. Brendolan A，Rosado MM，Carsetti R，Selleri L, Dear TN. Development and function of the mammalian spleen. Bioessays. 2007 ；29 (2) :166-77. Yu J,McMahon AP, Valerius MT. Recent genetic studies of mouse kidney development. Curr Opin Genet Dev. 2004 ; 14(5) :550-7. Schnabel CA，Selleri L, Cleary ML. Pbxlis essential for adrenal development and urogenital differentiation. Genesis. 2003 ；37 (3) 123-30.)。该基因的表达缺失会导致胚胎致死和多种组织器官异常。 PBXl位于染色体Iq21_q24，处于II型糖尿病易感基因位点，与糖尿病的发生密切相关(Duesing K，Charpentier G，Marre M，Tichet J，Hercberg S，Balkau B， Froguel P，Gibson F. Evaluating the association of common PBXlvariants with type 2diabetes. BMC Med Genet. 2008 ；9 :14. Thameem F，Wolford JK, Bogardus C，Prochazka M. Analysis of PBXlas a candidate gene for type 2 diabetes mellitus in Pima Indians. Biochim Biophys Acta. 2001 ;1518 (1-2) :215-20.)。近年来，PBXl 基因在恶性肿瘤中的作用日益受到研究者的关注。在急性淋巴系白血病中经常发现TOXl基因和其它基因的融合突变，形成 E2A-PBX1、EWSR1-PBX1 等融合蛋白(Thorsteinsdottir U，Krosl J，Kroon E，Haman A，Hoang T，Sauvageau G. The oncoprotein E2A~Pbxla collaborates with Hoxa9 to acutely transform primary bone marrow cells. Mol Cell Biol.1999 ； 19(9) :6355-66. Monica K，LeBrun DP, Dedera DA, Brown R，Cleary ML. Transformation properties of the E2a~Pbxl chimeric oncoprotein fusion with E2a is essential， but the Pbxl homeodomain is dispensable. Mol Cell Biol. 1994 ; 14 (12) :8304-14. Aspland SE， Bendall HH， Murre C.The role of E2A-PBX1 in leukemogenesis. Oncogene. 2001 ;20 (40) :5708-17. Brandal P，Panagopoulos I, Bjerkehagen B, Gorunova L，Skjeldal S，Micci F，Heim S. Detection of a t (I ；22) (q23 ；ql2) translocation leading to an EWSR1-PBX1 fusion gene in a myoepithelioma. Genes Chromosomes Cancer. 2008 ；47 (7) :558-64.)。融合蛋白的产生主要是由于发生了染色体移位，这些融合蛋白可以调节许多下游癌基因的表达继而导致白血病细胞的增殖，如可以促进Bmi-I 基因表达继而降低下游INK4A-ARF基因表达(Smith KS, Chanda SK, Lingbeek M，Ross D T， Botstein D， van Lohuizen M， Cleary ML Bmi-I regulation of INK4A-ARF is a downstream requirement for transformation of hematopoietic progenitors by E2a-Pbxl.Mol Cell. 2003 ；12(2) :393-400.)。PBXl在人食管鳞状细胞癌组织中表达异常上调(Liu DB，Gu ZD, Cao TL, Liu H，Li JY. Immunocytochemical detection of HoxD9and Pbxlhomeodomain protein expression in Chinese esophageal squamous cell carcinomas. World J Gastroenterol. 2005 ；11 (10) :1562-6.) 在前列腺癌中， PBXl的高表达促进雄激素非依赖性的前列腺癌细胞的增殖(Kikugawa T Kinugasa Y， Shiraishi K,Nanba D,Nakashiro K,Tanji N，Yokoyama M,Higashiyama S. PLZF regulates Pbxltranscription and Pbxl-HoxC8 complex leads to androgen-independent prostate cancer proliferation. Prostate. 2006 ；66 (10) : 1092-9.)。在卵巢癌中，PBXl 作为 Notch3的下游基因介导肿瘤细胞的存活(Park JT, Shih IeM, Wang TL. Identification of Pbxl, a potential oncogene,as a Notch3target gene in ovarian cancer. Cancer Res. 2008 ； 68(21) :8852-60.)。基于以上PBXl基因在人食管鳞状细胞癌、前列腺癌和卵巢癌等肿瘤中的报道，推测PBXl有望成为肿瘤治疗的靶点。然而，目前PBXl基因在肺癌、肝癌和乳腺癌发生和发展中的角色尚未阐明。因此，有必要深入研究PBXl在上述肺癌、肝癌和乳腺癌细胞恶性增殖中的作用以及影响肿瘤细胞的增殖的分子机制。
发明内容
本发明的目的在于公开与人PBXl (pre-B-cell leukemia homeobox I)基因相关的治疗方法及药物。为了深入研究PBXl在肿瘤发生中的调节功能，本发明选取人肺癌 H1299细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MCF-7细胞、人胃癌细胞SGC7901和人胰腺癌 Panc-I细胞为模型，以RNAi为手段研究PBXl在上述肿瘤细胞的存活和凋亡命运中的作用。本发明第一方面，公开了将人PBXl基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物，或者将人 PBXl基因用于制备肿瘤诊断药物。人PBXl基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容其一，将人PBXl基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其；，将人 PBXl基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。所述将人PBXl基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标具体是指将人 PBXl基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞产生RNA干扰作用的靶标，从而能降低肿瘤细胞人 PBXl基因的表达水平。所述将人PBXl基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指JfAPBXI基因作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人PBXl基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如之后所述的人PBXl基因小分子干扰RNA即是以人PBXl基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。诸如抗体药物，小分子药物等也可将PBXl基因作为作用对象。所述将人PBXl基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将人PBXl基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与人PBXl基因的表达相关的任一种肿瘤， 更进一步的，为一种恶性肿瘤，例如选自肺癌、肝癌和乳腺癌。所述肿瘤治疗药物可以为小分子化学药，抗体药，也可以为核酸类药物。进一步的，所述肿瘤治疗药物能降低人PBXl基因的表达水平从而抑制肿瘤细胞的增殖。采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人PBXl基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗目的的。具体的，治疗时，将能有效降低人PBXl基因表达水平的物质给药于患者。进一步的，所述的能有效降低人PBXl基因表达水平的物质，包括能够特异性沉默人PBXl基因表达的小分子干扰RNA(siRNA)。该小分子干扰RNA(siRNA)可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源PBXl基因的表达的作用。
进一步的，所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO :1_29之任一的序列作为特异性沉默人PBXl基因表达的靶点序列。所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO : 1_29之任一的序列作为特异性沉默人 PBXl基因表达的靶点序列是指该小分子干扰RNA能与SEQ ID NO :1_29中的任一种序列所编码的mRNA片段特异性结合，并特异性沉默人PBXl基因的表达。进一步的，所述能够特异性沉默人PBXl基因表达的小分子干扰RNA(SiRNA)经由慢病毒载体表达。具体而言，这个过程包括将编码所述人PBXl基因小分子干扰RNA的DNA 片段克隆入慢病毒载体获得人PBXl基因干扰慢病毒载体，进而利用该人PBXl基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞并最终表达所述siRNA。人PBXl基因干扰慢病毒载体为将编码所述人PBXl基因小分子干扰RNA的DNA片段克隆入慢病毒载体后获得，能产生人PBXl基因小分子干扰RNA。进一步的，所述的慢病毒载体可选自pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP, pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV-TagYFP、pLKO. l-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一种慢病毒载体，本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体。慢病毒载体可在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒。本发明第；方面，公开了一种分离的人PBXl基因小分子干扰RNA(SiRNA)靶标片段，其序列为SEQ ID NO 1-29中任意一条序列。所述分离的人PBXl基因小分子干扰RNA(SiRNA)靶标片段可应用于人PBXl基因小分子干扰RNA的筛选与制备。本发明第三方面，公开了一种人PBXl基因小分子干扰RNA(SiRNA)，能够特异性沉默人PBXl基因的表达。所述人PBXl基因小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO : 1_29之任一的序列作为特异性沉默人PBXl基因表达的靶点序列。进一步的，所述人PBXl基因小分子干扰RNA包含正义RNA片段和反义RNA片段， 所述正义RNA片段和所述反义RNA片段互补，所述正义RNA片段含有SEQ ID NO :1_29中之任一序列编码的RNA。所述正义RNA片段和反义RNA片段存在于两条不同的RNA链上或者存在于同一条 RNA链上。所述正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为15_27个核苷酸；较佳的，长度均为 19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。进一步的，所述人PBXl基因小分子干扰RNA为发夹型单链RNA，包括正义RNA片段、茎环片段和反义RNA片段，正义RNA片段和反义RNA片段中间由茎环片段分隔；其中，正义RNA片段和反义RNA片段互补，正义RNA片段的序列选自SEQ ID NO :1_29之任一。
所述茎环片段结构包括6个或9个碱基。进一步的所述茎环片段的序列选自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC。本发明具体列举了以 UUCAAGAGA 为茎环。如实施例列举的，所述人PBXl基因小分子干扰RNA的序列为SEQ ID NO 30 =GCAU CA⑶GCUAAUGGAG⑶UUUCAAGAGAAACCUCCAUUAGCACUGAUGC。本发明第四方面，公开了一种人PBXl基因干扰核酸构建体，包含编码前述人PBXl 基因小分子干扰RNA的基因片段，能表达前述人PBXl基因小分子干扰RNA。所述的人PBXl基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人PBXl基因小分子干扰 RNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述人PBXl基因干扰核酸构建体为人PBXl基因干扰慢病毒载体，为将编码所述人PBXl基因小分子干扰RNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，能产生人PBXl 基因小分子干扰RNA。所述慢病毒载体可以选自pLK0.1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP, pLKO.1-puro-CMV-tGFP, pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV-TagYFP、pLKO. l-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635、pLKO. l-puro-UbC-TurboGFP、pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人PBXl基因干扰核酸构建体,命名为 pGCSIL-GFP-PBXI-shRNA。进一步的，编码所述人PBXl基因小分子干扰RNA的基因片段的序列含有SEQ IDNO 1-29中之任一序列及其互补序列。本发明的人PBXl基因小分子干扰RNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗或诊断肿瘤的药物或制剂。人PBXl基因干扰核酸构建体则可用于制备所述人 PBXl基因小分子干扰RNA。当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的人PBXl基因小分子干扰RNA 施用于哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明第五方面，公开了一种人PBXl基因干扰慢病毒，由前述人PBXl基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生人PBXl基因小分子干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。本发明第六方面，还公开了一种药物组合物，含有治疗有效量的人PBXl基因小分子干扰RNA或人PBXl基因干扰慢病毒。进一步的，所述药物组合物含有I 99wt%如前所述的人PBXl基因小分子干扰 RNA或人PBXl基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、葡萄糖、鹿糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括湿润剂、乳化剂、防腐剂 (如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。综上所述，本发明设计了针对人PBXl基因的29个RNAi靶点序列，构建相应的 PBXlRNAi 载体，其中编码序列 SEQ ID NO 27 的 RNAi 载体 pGCS IL-GFP-PBXI-shRNA 能够显著下调PBXl基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv) 作为基因操作工具携带RNAi载体pGCS IL-GFP-PBXI-shRNA能够靶向地将针对PBXl基因的RNAi序列高效导入人肺癌H1299细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MCF-7细胞、胃癌 SGC7901细胞和胰腺癌Panc-I细胞，降低PBXl基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的PBXl基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人PBXl基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中PBXl 基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
图I表示pGCSIL-GFP质粒DNA图谱。图2表示PBXl-shRNA慢病毒侵染人肺癌H1299细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MCF-7细胞、胃癌SGC7901细胞和胰腺癌Panc-I细胞5天后，PBXlmRNA的表达水平显著降低。图3表示PBXl-shRNA慢病毒侵染人肺癌H1299细胞5天后，显著抑制细胞增殖。图4表示PBXl-shRNA慢病毒侵染人肝癌SMMC-7721细胞5天后，显著抑制细胞增殖。图5表示PBXl-shRNA慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7细胞5天后，显著抑制细胞增殖。图6表示PBXl-shRNA慢病毒侵染人胃癌SGC7901细胞5天后，显著抑制细胞增殖图7表示PBXl-shRNA慢病毒侵染人胰腺癌Panc-I细胞5天后，显著抑制细胞增殖。图8使用PBX-I抗体在肿瘤组织样本上的免疫组化检测结果a、b人乳腺癌，c胰腺癌，d、e肺癌，f、g、h、i胃癌
具体实施例方式本发明基于PBXl在人食管鳞状细胞癌、前列腺癌和卵巢癌肿瘤组织中显著高表达，认为PBXl还可能参与了人肺癌、肝癌和乳腺癌的发生和发展。本发明涉及了一组针对人PBXl基因的小分子干扰RNA(SiRNA)序列、RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒。选取人PBXlmRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30(优选15-27，更优选19-23)个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆， 构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明，上述 siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源PBXl基因的表达。发明人发现，采用RNAi方法下调人PBXl基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖，这一研究成果表明PBXl基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对PBXl基因的siRNA，筛选出了可有效抑制PBXl的表达进而抑制人肺癌H1299细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MCF-7细胞胃癌SGC7901和胰腺癌Panc-I细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。本发明提供了一系列特异性针对人PBXl基因的小干扰RNA(SiRNA)序列，构建了可特异性沉默PBXl基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人PBXl基因设计的小干扰 RNA及RNAi慢病毒，稳定并特异地下调PBXl基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。 本发明表明PBXl基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且， 通过RNAi方式沉默PBXl基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。本发明的设计思路为本发明通过如下方法来筛选获得一种人PBXl基因RNAi慢病毒从Genbank中调取人PBXl基因序列；预测siRNA位点；合成针对PBXl基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo ;慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达PBXl 基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体(Packing Mix, Sigma-aldrich公司)共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉默 PBXl基因的慢病毒。基于上述方法，本发明提供了 29个干扰PBXl基因的有效靶点(具体如SEQ IDNO 1-29所示)，构建了特异干扰人PBXl基因的慢病毒。同时本发明还公开一种人PBXl基因RNAi慢病毒(PBXl-RNAi)及其制备与应用。本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低PBXl基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，PBXl基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，PBXl基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的PBXl基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook. J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京科学出版社 2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。实施例I :针对人PBXl基因RNAi慢病毒的制备I.筛选针对人PBXl基因的有效的siRNA靶点从Genbank调取PBXl (NM_002585)基因信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对PBXl基因的有效的siRNA靶点。在PBXl基因的编码序列(CDS)区域内，每隔一个碱基起始获得21个碱基的序列，表I列出了其中29条针对PBXl 基因的有效siRNA靶点序列。表I靶向于人PBXl基因的siRNA靶点序列
权利要求
1.人PBXl基因在制备或筛选肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌的肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌的药物中的用途。
2.一种分离的人PBXl基因小分子干扰RNA靶标片段，其序列为SEQ ID N0:l_29中任意一条序列。
3.一种人PBXl基因小分子干扰RNA，能够特异性沉默人PBXl基因的表达，所述人PBXl 基因小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO :1-29之任一的序列作为特异性沉默人PBXl基因表达的靶点序列。
4.如权利要求3所述人PBXl基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人PBXl基因小分子干扰RNA包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段互补，所述正义RNA片段含有SEQ ID NO :1_29中之任一序列编码的RNA。
5.如权利要求4所述人PBXl基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为15-27个核苷酸。
6.如权利要求5所述人PBXl基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人PBXl基因小分子干扰RNA为发夹型单链RNA，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段中间由茎环片段分隔。
7.如权利要求6所述人PBXl基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述茎环片段的序列选自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。
8.如权利要求3所述人PBXl基因小分子干扰RNA，其特征在于，所述人PBXl基因小分子干扰RNA的序列为SEQ ID NO :30。
9.一种人PBXl基因干扰核酸构建体，包含编码权利要求3-8任一权利要求所述人 PBXl基因小分子干扰RNA的基因片段，能表达人PBXl基因小分子干扰RNA。
10.如权利要求9所述人PBXl基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述人PBXl基因干扰核酸构建体为人PBXl基因干扰慢病毒载体。
11.如权利要求10所述人PBXl基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述慢病毒载体选自pLK0. 1-pur。、pLKO. 1-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-tGFP、pLKO. I-CMV-Neo, pLKO. l-Neo、pLK0. l-Neo-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV-TagYFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP, pLKO. l-puro-CMV_TagFP635、pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC-TagFP635> pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG-3xLac0> pLPl、 pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-iT_DEST、pLenti6-GW/U6_laminshrna、 pcDNAl. 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/N-Lumio/V5_DEST、pGCSIL-GFP 或pLenti6. 2/N-Lumio/ V5-Gff/lacZ 中的任一。
12.—种人PBXl基因干扰慢病毒，由权利要求9-11任一权利要求所述人PBXl基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
13.—种药物组合物，含有治疗有效量的权利要求3-8任一权利要求所述人PBXl基因小分子干扰RNA或权利要求12所述人PBXl基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
14.如权利要求13所述药物组合物，其特征在于，所述肿瘤为恶性肿瘤，选自肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌之任一。
全文摘要
本发明公开了人PBX1基因的用途及其相关药物。本发明公开了人PBX1基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了人PBX1基因小分子干扰RNA、人PBX1基因干扰核酸构建体、人PBX1基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人PBX1基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中PBX1基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
文档编号A61K48/00GK102534003SQ201210005699
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月10日 优先权日2011年12月19日
发明者孙琴, 曹跃琼, 沈浩, 瞿红花, 金杨晟, 韩海雄, 顾雪峰 申请人:上海吉凯基因化学技术有限公司