专利名称：利用白蛋白-结合蛋白作为靶标的治疗方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗癌症以及其他疾病(包括组织和器官异常増殖、增生、重塑、炎性活性)的方法。本发明进一步涉及利用识别白蛋白-結合蛋白的合适配体用于靶向、显影和測定哺乳动物肿瘤对化疗剂的应答的方法。
背景技术：
已显示白蛋白纳米颗粒制剂减少不充分可溶的治疗剂的毒性。例如，美国专利6，537，579公开了没有毒性的乳化剂的白蛋白-纳米颗粒紫杉醇制剂。以商标Taxol 由Bristol Myers Squibb销售的抗癌剂紫杉醇目前批准用于数种癌症，包括卵巣、肺和乳腺癌的治疗。使用紫杉醇的主要局限性是其溶解度差。因此，丁￡叉01@制剂包含作为溶解赋形剂的む6111(^1101@￡し但该制剂中(；1'6111(^1101'@的存在与动物(Lorenz 等,Agents Actions 7,63-67,1987)和人中(Weiss 等,J. Clin. Oncol. 8,1263-1268,1990)严重的过敏反应有夫。因此，接受TaXOI 的患者需要以皮质类固醇(地塞米松)和抗组胺药预先给药以降低由于Cremophor 的存在而发生的过敏和过敏反应。相反，亦称为ABI-007 的 Abraxane 为由 AbraxiS Oncology 销售的，无Cremophor 的紫杉醇白蛋白-纳米颗粒制剂。当用盐水重制时白蛋白纳米颗粒作为赋形剂的使用产生胶体形式。基于临床研究，已表明Abraxane 的使用与TaxoI 相比以降低的过敏反应为特征。因此，接受Abraxane 的患者不需要预先给药。白蛋白-纳米颗粒制剂的另一个优点为通过排除有毒的乳化剤，可以比目前用Taxol 可能的更频繁的时间间隔给予更高剂量的紫杉醇。存在的潜力为可在实体瘤中看到的由于下列原因而产生的增强的效力(i)更高的耐受剂量(300mg/m2)、(ii)更长的半衰期、(iii)延长的局部肿瘤有效性和/或(iv)体内持续释放。Abraxane 降低过敏反应而维持或改善药物的化疗作用。已知< 200nm大小的胶体纳米颗粒或颗粒由于渗漏性脉管系统而易于在肿瘤部位集中。已对ー些脂质体制剂描述了该作用(Papahadjopoulos,等，Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 88，11460，1991) ； (Gabizon, A. , Cancer Res.，52，891，1992) ； (Dvorak,等，Am. J. Pathol. 133，95，1988) ； (Dunn,等，Pharm, Res.，11，1016-1022，1994);和(Gref,等，Science 263，1600-1603，1994)。可能的是当与该药物以其溶解(含有Cremophor )形式给药相比时，在肿瘤部位集中的紫杉醇纳米颗粒可引起药物在该肿瘤部位的缓释而产生更大的效力。
所述纳米颗粒 制剂包括至少约50%纳米颗粒形式的活性剤。此外，所述纳米颗粒制剂包含至少约60%、至少约70%、至少约80%或至少约90%纳米颗粒形式的活性剤。另夕卜，所述纳米颗粒制剂包含至少约95%或至少约98%纳米颗粒形式的活性剤。酸性的、富含半胱氨酸的分泌蛋白(SPARC)，亦称骨粘连蛋白(osteonectin)，为281个氨基酸的糖蛋白。SPARC对多种配体具有亲和力，包括阳离子(例如，Ca2+、Cu2+、Fe2+)、生长因子(例如，血小板来源的生长因子(TOGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF))、细胞外基质(ECM)蛋白(例如，胶原I-V和胶原IX、玻连蛋白(vitronectin)和血小板反应蛋白-I)、内皮细胞、血小板、白蛋白和羟基磷灰石。SPARC表达受发育调控，并且主要在正常发育或损伤应答期间在经重塑的组织中表达(參见，例如，Lane等，FASEB J.，8，163-173(1994))。发育的骨和牙中表达高水平的SPARC蛋白。SPARC为数种侵袭性癌症中上调的细胞基质蛋白，但在正常组织中缺乏(Porter等，J. Histochem. Cytochem.，43，791 (1995))。实际上，在各种肿瘤中(例如，膀胱、肝脏、卵巢、肾、消化道和乳腺)诱导SPARC表达。例如膀胱癌中，SPARC表达与晚期癌症相关。已显示T2级或更晚级的侵袭性膀胱肿瘤比Tl级膀胱肿瘤(或更次级浅表肿瘤)表达更高水平的 SPARC，并且预后较差(參见例如，Yamanaka 等，J. Urology, 166，2495-2499 (2001))。脑膜瘤中，SPARC表达仅与侵袭性肿瘤相关(參见例如，Rempel等 ，Clincal Cancer Res.,5, 237-241 (1999)) 0还在74. 5%的原位侵袭性乳腺癌病变中(參见例如，Bellahcene，等，Am. J. Pathol.，146，95-100 (1995))，以及54. 2%的乳腺浸润管癌中(參见例如，Kim等，J. Korean Med. Sci.，13,652-657(1998))检测到 SPARC 表达。SPARC 表达还与乳腺癌中常见的微钙化有关(參见例如，Bellahcene等，上文)，提示SPARC表达可能负责乳腺转移性病灶对骨的亲和力。还已知SPARC结合白蛋白(參见例如，Schnitzer, J. Biol. Chem. , 269,6072(1994))。抗体疗法是用于控制疾病的有效方法，其中可鉴定特定的蛋白质标志物。实例包括 Avastin-抗-VEGF 抗体、Rituxan-抗-CD20 抗体和 Remicade-抗-TNF 抗体。因而，SPARC的抗体代表用于治疗人和其他哺乳动物肿瘤、以及表达SPARC蛋白的其他増殖的、增生的、重塑和炎性病症的重要治疗剂。此外，与显影或造影剤偶联的SPARC抗体将是检测和诊断所述病症的工具。仍然存在治疗人和其他哺乳动物肿瘤、以及其他増殖的、增生的、重塑和炎性病症的方法的需要。另外，仍然存在測定人或其他哺乳动物肿瘤应答的需要以评估化疗剂的有效性。此外，需要合适的方法以检测和诊断所述病症。根据在此提供的本发明的说明书，本发明的这些和其他的优点，以及另外的发明特征将是显而易见的。
发明内容
本发明提供了用于测定哺乳动物肿瘤对化疗剂的应答的方法，其中该方法包括步骤(a)从哺乳动物分离生物样品，(b)检测生物样品中SPARC蛋白的表达，和(C)定量生物样品中SPARC蛋白的量。本发明进一歩提供了利用白蛋白-結合蛋白作为疗法，利用SPARC和SPARC的抗体或SPARC结合-蛋白作为疗法，用于将化疗剂递送至哺乳动物疾病部位的方法，其中该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的药物组合物，其中该药物组合物包含与能结合白蛋白-結合蛋白的化合物偶联的化疗剂和药学可接受载体。此外，本发明提供了包含与能结合SPARC蛋白的化合物偶联的化疗剂和药学可接受载体的组合物。另外，本发明提供了包含SPARC识别基团和治疗剂的递送试剂，其中所述治疗剂与SPARC识别基团偶联。此外，本发明提供了用于将化疗剂递送至哺乳动物肿瘤的方法，其中该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的药物组合物，其中该药物组合物包含与能结合白蛋白的SPARC蛋白偶联的化疗剂和药学可接受载体。本发明的组合物可以是小分子、大分子或蛋白质。
图I图解说明了 MX-I肿瘤异种移植物中染色的白蛋白和SPARC。图2图解说明了紫杉醇通过单层内皮细胞的转胞吞作用。
发明详述目前已发现包含白蛋白-结合蛋白的组合物存在另外的定位机制。白蛋白-结合蛋白，如SPARC、cubi I in和TGF β，可用于将治疗剂靶向以白蛋白-结合蛋白的过表达为特征的疾病部位。本发明提供了与试剂偶联的基团的用途，其中所述基团能结合白蛋白-结合蛋白，如SPARC、cubilin或TGFii，并且所述试剂为疾病的治疗、显影或递送试剂，所述疾病中白蛋白-结合蛋白起着重要作用并且相对正常组织过表达。优选，白蛋白-结合蛋白选自SPARC、cubilin或TGFP。最优选，白蛋白-结合蛋白为SPARC并且结合白蛋白-结合蛋白的基团为SPARC识别基团。合适的SPARC识别基团包括但不限于，配体、小分子、抗体。本发明还提供了用于测定人或其他哺乳动物肿瘤对化疗剂的应答的方法。该方法包括(a)从人分离生物样品，(b)检测生物样品中SPARC蛋白的表达，和(C)定量生物样品中SPARC蛋白的量。一旦确定肿瘤表达的SPARC的量，可例如通过将SPARC的表达与所给治疗剂的剂量相关联而确定化疗剂的有效性。本发明还提供了 SPARC抗体作为疾病治疗剂或显影剂的用途，该疾病中SPARC起着重要作用并且相对正常组织过表达。在下文中，为简单起见所有结合白蛋白的蛋白质(包括SPARC)称为SPARC。SPARC蛋白负责某些人肿瘤中白蛋白的累积。由于白蛋白为化疗药物的主要载体，SPARC的表达水平为透过和保留在肿瘤中的化疗药物量的指示。因此，SPARC的表达水平为肿瘤对化疗应答的预示。在本发明方法的上下文中可从目的哺乳动物分离任何合适的生物样品。优选，如通过肿瘤活组织检查从肿瘤分离生物样品。或者，可从哺乳动物的体液，包括例如，脑脊液、血液、血浆、血清或尿液分离生物样品。用于分离生物样品的技术和方法为本领域技术人员所知。任何合适的药物活性剂可用于本发明方法(例如，与SPARC识别基团偶联的化疗剂)，只要该活性剂的转运或结合需要白蛋白。合适的活性剂包括但不限于，酪氨酸激酶抑制剂(染料木黄酮)、生物活性剂(TNF或tTF)、放射性核素(例如，mI、9°Y、mIn、211At、32P和其他已知治疗放射性核素)、阿霉素、安沙霉素抗生素、门冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺氯氨钼、卡波氯氨钼、亚硝脲氮芥、卡西他滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、氮烯唑胺、放线菌素、柔红霉素、右雷佐生、多烯紫杉醇、阿霉素、鬼白亚乙苷、埃博霉素、5-氟脱氧尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、依立替康、环己亚硝脲、二氯甲二乙胺、巯嘌呤、m印lhalan、氨甲喋呤、雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))和衍生物、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲(nitrosurea)、紫杉醇、帕米膦酸盐(pamidronate)、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、美罗华(rituximab、Q)20人鼠嵌合性单克隆抗体)、链脲霉素、鬼白噻吩苷、硫鸟嘌呤、三胺硫膦、紫杉烷、长春花碱、长春新喊、长春瑞宾、泰索(taxol,紫杉酌 )、考布他汀(combretastatins)、discodermolides、反钼(transplatinum)、血管祀向试剂、杭-血管内皮细胞生长因子化合物(“抗-VEGF”)、杭-表皮生长因子受体化合物(“抗_EGFR”)、5-氟尿嘧啶和其衍生物。此外，该药物活性剂可以是毒素如蓖麻毒A、放射性核素、抗体自身的Fe片段、单链抗体、Fab片段、双抗体等等。所选的药物活性剂本身可识别和结合SPARC或适当地附着于识别SPARC的SPARC识别基团，包括例如，蛋白质或非-蛋白质、抗体、抗体自身的Fe片段、单链抗体、Fab片段、双抗体、肽或其他的非-蛋白质小分子。 可根据本发明的方法给予ー种或多种化疗剂的ー种或多种剂量。本发明方法中化疗剂的类型和数量取决于针对的特定肿瘤类型的标准化疗方案。換言之，特定的癌症可用単一化疗剂常规治疗，而另ー种可用化疗剂组合常规治疗。本领域中很好地描述了用于合适的疗法、化学疗法、放射性核素等等结合或联合抗体或其片段的方法。本发明对其有效的疾病包括任何身体组织，包括软组织、结缔组织、骨、实体器官、血管等等中増殖、组织重塑、增生、扩大的伤ロ愈合的异常情況。通过发明的组合物能治疗或诊断的疾病的实例包括癌症、糖尿病或其他视网膜病、炎症、关节炎、血管或人工血管移植物或血管内装置再狭窄等等。根据本发明检测和治疗的肿瘤类型通常为人和其他哺乳动物中发现的那些。肿瘤也可以为接种的结果，如实验动物中。人和其他动物情况中遇见肿瘤的许多类型和形式，并且并不试图限制本方法对任何特定肿瘤类型或种类的应用。如已知的，肿瘤包括由不受控制的和渐进性的细胞分裂产生的异常组织块，并且通常也称为“瘤”。本发明方法可用于例如人中的肿瘤细胞和相关的基质细胞、实体瘤和与软组织有关的肿瘤，如软组织肉瘤。肿瘤或癌症可位于口腔和咽、消化系统、呼吸系统、骨和关节(例如，骨转移性病灶)、软组织、皮肤(例如，黑色素瘤)乳腺、生殖系统、泌尿系统、眼和眼眶、脑和中枢神经系统(例如，胶质瘤)或内分泌系统(例如，甲状腺)并且不一定限于原发肿瘤或癌症。与口腔有关的组织包括但不限于，舌和口腔组织。癌症可产生于消化系统组织中，包括例如，食管、胃、小肠、结肠、直肠、肛门、肝脏、胆囊和胰腺。呼吸系统的癌症可影响喉、肺和支气管并且包括例如，非-小细胞肺癌。肿瘤可产生于子宫颈、子宮体、卵巢外阴、阴道、前列腺、睾丸和阴茎中，其组成雌雄生殖系统，以及膀胱、肾、肾盂和输尿管中，其包括泌尿系统。肿瘤或癌症可位于头和/或颈(例如，喉癌和甲状旁腺癌)。肿瘤或癌症也可位于造血系统或淋巴系统，并且包括例如，淋巴瘤(例如，恶性淋巴肉芽肿病和非-恶性淋巴肉芽肿淋巴瘤)、多发性骨髄瘤或白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性粒细胞性白血病等等)。优选，肿瘤位于膀胱、肝脏、卵巣、肾、消化道、脑或乳腺。SPARC蛋白具有对多种配体的亲和力。因此，本发明用于将治疗剂递送至疾病部位的方法以下列发现为基础对SPARC具有亲和カ的化合物或配体(包括白蛋白)可用于将治疗药物递送至疾病部位，而几乎没有或不递送至正常组织。本发明还提供了将治疗组合物从血管转运通过内皮屏障进入肿瘤间质组织的方法。抗体疗法和化疗的主要障碍为转移通过内皮屏障进入肿瘤间质组织。白蛋白利用白蛋白受体转运机制而通过内皮屏障。该转运机制与文献报道的相同(gp60和albondin)或为其他未发现的机制。之前已报道背载于白蛋白上的治疗剂表现出增强的肿瘤摄取(Desai, N.等 Increased endothelial transcytosis of nanoparticle albumin-boundpaclitaxel(ABI-007)by endothelial gp60receptors a pathway inhibitedby TaXO I ，27th Annual San Antonio Breast Cancer Symposium(SABCS) (2004),摘要
#1071)。此外，通过内皮屏障的增强的转移可利用生理的白蛋白转运机制实现(Schnitzer，J. E. ；0h, P. J. Biol. Chem. 269，6072-6082 (1994))。
对于小分子，可进行改进以提高对白蛋白的药物亲和力。对于小分子制剂，可除去防止药物结合白蛋白的溶剂。或者如以下所述，小分子可连接至白蛋白、白蛋白抗体、其片段或白蛋白-受体的配体。对于生物分子如蛋白质、抗体和其片段，可以用白蛋白结合肽设计改造该生物制剂而使得其呈现对白蛋白的亲和力。肽可以为白蛋白结合序列、白蛋白的抗体或抗体片段、白蛋白载体的抗体或抗体片段(如gp60/albondin/净化剂受体/或TGF-β受体)，或胞膜窑中发现的任何蛋白质、白蛋白转运蛋白的抗体。本发明还涉及制备为具有一个SPARC化合价和另一个经内皮转运的效应器(如gp60/albondin/净化剂受体/或TGF-β受体)化合价的嵌合体，或内皮细胞胞膜窑中发现的任何蛋白质的抗体或其合适的片段。本发明还提供经SPARC抗体的补体固定和/或细胞招募介导的免疫应答而破坏SPARC表达组织(如肿瘤和心瓣再狭窄组织)的方法。在这种情况下，如同Rituxan(—种抗-CD20抗体)，效应器部分为Fe片段，其可介导伴有SPARC表达细胞的直接破坏的补体激活或免疫细胞经细胞介导的免疫应答产生的组织破坏而招募至SPARC表达组织。本发明还提供利用SPARC的中和抗体抑制SPARC活性的方法。中和抗体具有阻断SPARC与其效应器在体内相互作用的能力。例如，中和抗体可阻断SPARC与细胞表面组分的相互作用或SPARC结合其天然配体(如白蛋白、生长因子和Ca2+)。本发明还提供了用于测定人或其他哺乳动物肿瘤对抗-SPARC疗法的应答的方法。该方法包括(a)从人分离生物样品，(b)检测生物样品中SPARC蛋白的表达，和(c)定量生物样品中SPARC蛋白的量。由于抗-SPARC疗法依赖于疾病组织中SPARC抗体与SPARC的结合，疾病组织中SPARC的存在对于活性是必要的。本发明进一步提供了使用结合至SPARC识别基团的一种或多种诊断试剂(如以上所述的抗体或其片段)的方法。诊断试剂包括放射性同位素或放射性核素、MRI造影剂、X射线造影剂、超声造影剂和PET造影剂。用于结合(conjugation)的方法为本领域所知。可通过本领域已知的任何合适的方法检测和定量样品中SPARC蛋白的表达。蛋白质检测和定量的合适的方法包括蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、银染、BCA测定法(Smith 等,Anal. Biochem.，150, 76-85 (1985)), Lowry 蛋白质测定法(例如在 Lowry 等,J. Biol. Chem.，193，265-275 (1951)中描述)，其为基于蛋白质-铜复合物的比色测定法，和Bradford 蛋白质测定法(例如在 Bradford 等,Anal. Biochem. ,72, 248 (1976)中描述)，其基于根据蛋白质结合的考马斯蓝G-250吸光度的变化。可通过之前任何方法分析肿瘤活组织检查或其可通过利用抗-SPARC抗体(单克隆或多克隆的)与合适的显象系统(即，HRP底物和HRP-偶联的二抗)一起的免疫组织化学分析。任何合适的SPARC抗体均可用于本发明的方法，只要该抗体呈现特异性结合SPARC。抗体可以是单克隆或多克隆的；并且可通过动物的免疫产生或通过重组DNA技术(如噬菌体展示和体外诱变或抗体重链和轻链基因可变区的合成)而产生。多克隆抗体包括但不限于，人抗体和源自例如下列动物的人源化抗体，如鸟类(例如，鸡)、啮齿类(例如，大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠)、母牛、山羊、绵羊、兔等等。单克隆抗体包括源自抗体产生细胞(包括但不限于人细胞)的单个克隆的抗体，和源自其他动物类型(例如鸡、兔、大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠、母牛、山羊、绵羊等等)的细胞的抗体。合成的抗体包括利用重组DNA技术经重链和轻链基因可变区的遗传工程而产生的抗体。合成的抗体还包括具有SPARC结合活性的化学合成的抗体片段或源自噬菌体展示或类似技术的抗体。用于人的用途，为了避免免疫原性和免疫应答，优选利用人源化的抗-SPARC抗体或合适的片段如Fab'、Fab或Fab2。人源化抗体或其片段例如可利用下列已建立方法的一种产生1)可利用人IgG主链代替SPARC抗体的可变CDR域而构建人源化抗体，其中重链和轻链在分开的启动子下分别表达或在具有IRES序列的一个启动子下共表达；2)可利用设计改造具有人免疫系统的小鼠产生人源化单克隆抗体；3)可利用噬粒(M13，A大肠杆菌噬菌体，或能表面展示的任何噬菌体系统)产生SPARC的人源化抗体。为了构建全长抗体，可变区可转移至重链和轻链的CDR上。哺乳动物细胞如CH0、293或人骨髓细胞中重链 和轻链的共表达产生全长抗体。类似地，可利用沿用已久的方法制备Fab’、Fab或Fab2片段和单链抗体。SPARC的抗体也不限于完整的抗体或保留SPARC结合位点的抗体的片段(例如，Fab和Fab2)。抗体也不限于任何一类型的抗体，例如IgM、IgA、IgG、IgE、IgD和IgY。抗体还不限于ニ价抗体、单价或具有SPARC的ー价和效应器(如tTF或蓖麻毒A)的另ー价的嵌合体。人源化抗体不限于IgG。同样的技术可用于产生所有其他种类的抗体如IgE、IgA、IgD、IgM，每种具有适于特定疾病靶向的不同的抗体-依赖的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(⑶C)活性。抗体的功能片段可通过限制性蛋白质水解产生。这些片段可以是单价的(如Fab’ )或ニ价的(如Fab2)。片段还可在大肠杆菌中作为单链scfv或双抗体合成。本发明进一歩提供了包含直接能发挥其药理学作用的药物活性剂或与能结合SPARC或其他白蛋白结合部分的化合物偶联的药物活性剤，和药学可接受载体的组合物。递送试剂，其可以是包含与SPARC识别基团偶联的药物活性剂的药物组合物，以使得治疗有效量的药物活性剂递送给哺乳动物的量给予哺乳动物，如人。本发明还提供了用于将化疗剂递送给哺乳动物中肿瘤的方法。该方法包括给予人或其他哺乳动物治疗有效量的药物组合物，其中该药物组合物包含与能结合SPARC蛋白的化合物或配体偶联的化疗剂和药学可接受载体。在此阐述的与本发明的其他实施方案有关的化疗剂、肿瘤、哺乳动物和其组分的描述也适用于递送化疗剂至肿瘤的上述方法的那些相同方面。优选，药物组合物不包含超过50%的纳米颗粒形式的治疗剂。更优选，药物组合物不包含超过10%的纳米颗粒形式的治疗剂。甚至更优选，药物组合物不包含超过5%，或超过4%或超过3%的纳米颗粒形式的治疗剂。在更优选的实施方案中，药物组合物不包含超过2%或超过1%的纳米颗粒形式的治疗剂。最优选，药物组合物不包含任何纳米颗粒形式的治疗剂。
本发明还提供了用于将化疗剂递送至人或其他哺乳动物中肿瘤的方法。该方法包括给予人或其他哺乳动物治疗有效量的递送试剂，如药物组合物，其中该递送试剂(例如，药物组合物)包含与SPARC识别基团偶联的化疗剂。例如，化疗剂可偶联至SPARC识别基团(如识别SPARC蛋白的抗体)或仅偶联至SPARC抗体。药物组合物优选包含偶联至SPARC识别基团的化疗剂和药学可接受载体。在此阐述的与本发明的其他实施方案有关的化疗剂、肿瘤、哺乳动物和其组分的描述也适用于递送化疗剂至肿瘤的上述方法的那些相同方面。 在其他实施方案中，本发明提供了通过SPARC识别基团的方式递送药物活性剂至疾病部位的方法，该疾病以人或表达所述蛋白质或标志物的其他动物中SPARC或另一种白蛋白-结合蛋白或标志物的过表达为特征。所述疾病疾病包括身体组织(例如软组织、结缔组织、骨、实体器官、血管等等)中增殖、组织重塑、增生、扩大的伤口愈合的异常情况。通过给予包含偶联至能结合SPARC蛋白或另一种白蛋白-结合蛋白的化合物或配体的治疗剂的药物组合物能治疗或诊断的疾病的实例包括癌症、糖尿病或其他视网膜病、炎症、关节炎、血管或人工血管移植物或血管内装置再狭窄等等。在此阐述的与本发明的其他实施方案有关的药物活性剂、肿瘤、哺乳动物和其组分的描述也适用于递送药物活性剂的上述方法的那些相同方面。仍然在其他实施方案中，本发明提供了用于递送药物活性剂(例如，仅SPARC抗体或结合至SPARC识别基团如SPARC抗体，放射性标记的SPARC抗体等等的化疗剂)至疾病部位的方法，该疾病以人或表达所述蛋白质或标志物的其他动物中SPARC的过表达为特征。所述疾病包括身体组织(例如软组织、结缔组织、骨、实体器官、血管等等)中增殖、组织重塑、增生、扩大的伤口愈合的异常情况。通过给予包含抗-SPARC治疗的药物组合物能治疗或诊断的疾病的实例包括癌症、糖尿病或其他视网膜病、炎症、关节炎、血管或人工血管移植物或血管内装置再狭窄等等。这里阐述的与本发明的其他实施方案有关的药物活性齐U、肿瘤、哺乳动物和其组分的描述也适用于递送药物活性剂的上述方法的那些相同方面。在其他实施方案中，本发明方法包括给予哺乳动物治疗有效量的药物组合物，所述组合物包含偶联至能结合SPARC蛋白的化合物或配体的化疗剂。该化疗剂可利用任何合适的方法偶联至能结合SPARC蛋白的化合物或配体。优选，该化疗剂经共价键(包括例如二硫键)化学偶联至化合物。本发明还提供了包括给予哺乳动物治疗有效量的药物组合物的方法，所述组合物包含偶联至SPARC识别基团的化疗剂或放射性元素。该化学治疗的或放射性的试剂可利用任何合适的方法偶联至识别SPARC的抗体。优选，该化疗剂可经共价键(包括例如二硫键)化学偶联至化合物。优选，可用于本发明方法中的化合物或配体能结合SPARC蛋白。在本发明一优选的实施方案中，化合物为结合SPARC蛋白的配体。合适的配体实例包括钙阳离子(Ca2+)、铜阳离子(Cu2+)、铁阳离子(Fe2+)、血小板来源的生长因子(TOGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、胶原(例如，胶原I、胶原II、胶原III、胶原IV、胶原V和胶原IX)、玻连蛋白(vitronectin)、血小板反应蛋白-I、内皮细胞、血小板、白蛋白和轻基磷灰石阳离子。在本发明另一个优选的实施方案中，化合物为小分子。术语“小分子”指具有小于约600分子量的任何分子。合适的小分子的实例包括蛋白质、核酸、糖类、脂类、辅酶(例如维生素)、抗原、激素和神经递质。优选，小分子为化学的(例如，有机或无机化学的)肽或拟肽、蛋白质或糖类。在本发明又一个优选的实施方案中，化合物为直接针对SPARC蛋白的抗体。结合SPARC蛋白的合适的抗体或其片段可用于本发明方法中。已在几乎所有的癌症类型中证实肿瘤组织中SPARC的表达。已证实SPARC在肿瘤组织上的加工可源自SPARC的肿瘤表达或是基质细胞来源的。通过外源SPARC的给予，肿瘤的SPARC表型可从SPARC阴性转换至SPARC阳性。因此，SPARC阳性肿瘤将变为对化疗剂敏感的。或者，SPARC可以为放射性同位素标记的或与不同的毒素偶联而赋予其直接或间接杀死肿瘤的能力。
可利用已知技术合成和纯化SPARC。可通过将SPARC结构基因/cDNA置于强启动子/翻译起始位点调控下而产生表达外源SPARC的细胞并且载体转染入哺乳动物细胞以驱动SPARC在这些细胞中的表达。或者，SPARC可利用杆状病毒或其他病毒(如腺病毒)表达。通过这些细胞表达的SPARC可通过传统的纯化方法如离子交換、体积排阻或C18色谱法纯化。纯化的SPARC可与防腐剂配制于盐水中并且通过静脉内、通过气雾剂、通过皮下注射或其他方法给予。本发明还提供了用于将化疗剂递送给哺乳动物肿瘤的方法。该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的药物组合物，其中该药物组合物包含与能结合白蛋白的SPARC蛋白偶联的化疗剂和药学可接受载体。在此阐述的与本发明的其他实施方案有关的化疗剂、肿瘤、哺乳动物和其组分的描述也适用于递送化疗剂至肿瘤的上述方法的那些相同方面。用于体内使用，偶联至能结合SPARC蛋白的化合物或配体的化疗剂如所希望地配制入包含生理学可接受载体的药物组合物中。任何合适的生理学可接受载体可用于本发明的上下文中，并且所述载体为本领域所熟知。用于体内使用，杭-SPARC治疗剂如所希望地配制入包含生理学可接受载体的药物组合物中。任何合适的生理学可接受载体可用于本发明的上下文中，并且所述载体为本领域所熟知。载体通常为液体，但也可以是固体，或液体和固体组分的组合。如所希望的，载体为生理学可接受的(例如，药物或药理学可接受的)载体(例如，赋形剂或稀释剂)。生理学可接受的载体为大家所熟知并且很容易得到。至少部分地通过靶组织和/或细胞的定位以及用于给予该组合物的具体方法确定载体的选择。通常，所述组合物可制成可注射的(无论是液体溶液或悬浮液)；还可制备适于在注射之前添加液体而制备溶液或悬浮液的固体形式；并且还可乳化该制剂。适于注射用途的药物制剂包括无菌水溶液或分散体；包含已知的蛋白质稳定剂和冷冻保护剂的制剂，包含芝麻油、花生油或丙ニ醇水溶液的制剂以及用于无菌注射溶液或分散体临时制备的无菌粉剂。所有情况中，制剂必须为无菌的并且必须为至易于注射程度的液体。其在制备和贮藏条件下必须稳定并且必须保存时防微生物(如细菌和真菌)的污染作用。作为游离碱或药理学可接受盐的活性物质的溶液可适当地与表面活性剂(如羟基纤维素)混合制备于水中。分散体还可以制备于甘油、液体聚こニ醇和其混合物和油类中。在常规的贮藏和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。偶联至结合SPARC蛋白的化合物或配体的化疗剂(例如，抗-SPARC治疗)可以中性或盐形式配制入组合物中。药物可接受盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的)并且其与无机酸类(例如，盐酸或磷酸)或有机酸类(如醋酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等等)形成。与游离羧基形成的盐也可源自无机碱(例如，钠、钾、铵、钙或氢氧化铁)，以及有机碱(如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等等)。组合物可进一步包括任何其他合适的组分，尤其用于提高组合物和/或其终端使用的稳定性。因此，存在本发明组合物的多种合适的制剂。下列制剂和方法仅为论证性的而决不为限制。适于经吸入给予的制剂包括气雾剂制剂。气雾剂制剂可置于加压的可接受推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等等。其也可配制为常压制剂，用于通过喷雾器或雾化器递送。适于肠胃外给药的制剂包括水性的和非水性的等渗无菌注射溶液，其可包含抗-氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得该制剂与指定受体的血液等渗的溶质，以及水性的和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、稠化剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以单元剂量或多剂量密封容器存在，如安瓿和小瓶，并且可以冷冻干燥(冻干)的状态保存，立即使用之前仅需添加无菌的液体赋形剂，例如注射用水。可从之前所述的无菌粉剂、粒剂和片剂类型制备临时的注射溶液和悬浮液。本发明的一优选的实施方案中，偶联至结合SPARC蛋白的化合物(例如，抗-SPARC治疗)的化疗剂被配制成用于注射(例如，肠胃外给药)。在这方面，如所希望的，制剂适于瘤内给药，但也可配制成用于静脉注射、腹膜内注射、皮下注射
坐坐寸寸ο适于肛门给药的制剂可通过将活性组分与各种基质(如乳化基质或水溶性基质)混合而制备栓剂。适于阴道给药的制剂除了包含活性组分之外还含有本领域已知的合适的载体，所述制剂可以下列是方式存在子宫托、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾剂而存在。此外，组合物可包含另外的治疗或生物学-活性剂。例如，可存在对特定的适应症治疗有效的治疗因子。控制炎症的因子，如布洛芬或留体，可为减少与药物组合物的体内给药有关的肿胀和炎症以及生理痛苦的部分。
具体实施例方式下列实施例进一步举例说明本发明但不应该认为以任何方式限制其范围。实施例I该实施例举例说明SPARC与白蛋白在MX-I肿瘤异种移植物中的共-定位。已显示3期转移性的乳腺癌试验中紫杉醇白蛋白纳米颗粒(Abraxane, ABX或ABI-007)具有超过Taxol (TAX)的改善的响应率(33%对比19%，p < O. 0001)(参见例如，O’ Shaughnessy, SABCS)。近来证实了白蛋白_介导的紫杉醇(P)经内皮转运和ABX对比 TAX的紫杉醇增加的瘤内累积(参见例如，Desai, SABCS 2003)。白蛋白结合SPARC(参见例如，Schnitzer, J. Biol. Chem.，269，6072-82 (1994))。MX-I肿瘤细胞系源于人乳腺癌。免疫染色人MX-I肿瘤异种移植物、人原发乳腺肿瘤组织(η = 141)和正常人乳腺组织(η = 115)的连续低温切片并且对白蛋白、SPARC(利用抗-SPARC抗体)和小窝蛋白(caveolin)-l染色分级(0_4)。培养的MX-I细胞也对SPARC免疫染色。用放射性紫杉醇(P) (20mg/kg IV)制备紫杉醇白蛋白纳米颗粒(Abraxane,ABX或ABI-007)和Taxol (TAX)，并且用于确定紫杉醇在无胸腺小鼠正常组织中的生物学分布。
MX-I肿瘤中白蛋白染色为聚集的并且与SPARC共-定位(图I)。小窝蛋白-1染色证实含有白蛋白的区域中血管密度与无白蛋白的区域无差异。SPARC由MX-I培养细胞的表达通过用抗-SPARC抗体阳性染色证实。对于7/10组织，正常组织中(SPARC阴性)的紫杉醇累积对于ABX相比TAX明显更低(p彡0. 004)。与正常组织的1%相比，46%的人原发乳腺肿瘤呈现强的SPARC染色(等级〉2) (p < 0. 0001)。在50个肿瘤组织的亚组中，SPARC表达与分级、ER状态或PgR状态无关；然而p53-阴性肿瘤中有高SPARC表达的趋势。白蛋白和SPARC的共-定位提示SPARC通过其白蛋白结合活性可起乳腺肿瘤中白蛋白结合的瘤内靶标的作用。由于ABX中紫杉醇的转运取决于白蛋白(參见例如，DesaiSABCS, 2003)，此可解释ABX相比TAX改善的肿瘤累积。正常组织中ABX累积比TAX更低，与正常组织中缺乏SPARC表达相一致。对SPARC筛查患者使得能鉴定对ABX更多响应的患者。这些肿瘤中SPARC的存在允许利用抗-SPARC抗体的靶向和治疗。实施例2该实施例举例说明了 MX-I肿瘤细胞中SPARC的表达。MX-I细胞培养于盖玻片上并且利用本领域已知的方法用针对人SPARC的抗体染色。观察到抗体染色，其证实MX-I表达SPARC。这些结果提示MX-I肿瘤细胞中检测到的SPARC表达为SPARC通过MX-I肿瘤细胞分泌的結果。对于MX-I肿瘤细胞，染色比正常的初级细胞如HUVEC (人脐静脉内皮细胞)、HLMVEC (人肺微血管内皮细胞)和HMEC (人乳腺上皮细胞)更强。虽然大部分SPARC染色为内部SPARC，如通过共聚焦显微镜检查和未渗透细胞的染色证实的，检测到显著性水平的表面SPARC。实施例3该实施例举例说明了人乳腺癌细胞中SPARC蛋白的过表达。利用Cybrdi Inc. (Gaithersburg, MD)的肿瘤阵列测定人乳腺癌细胞中的SPARC表达。分析结果在表I中显示。染色強度分级为“阴性”至4+，数字越高对应的过表达強度就越大。与正常组织的1%相比，49%的乳腺癌SPARC染色阳性(2+和以上)(p < 0. 0001)。
权利要求
1.偶联至能结合281个氨基酸的SPARC糖蛋白的化合物的治疗剂在制备用于治疗哺乳动物的肿瘤的药物中的用途，包括 (1)从哺乳动物分离生物样品， (2)检测生物样品中SPARC蛋白的表达， (3)定量生物样品中SPARC蛋白的量，和 (4)如果生物样品中SPARC蛋白的量，向该哺乳动物给予治疗有效量的偶联至能结合281个氨基酸SPARC糖蛋白的化合物的治疗剂。
2.权利要求I的用途，其中所述生物样品分离自肿瘤。
3.权利要求I的用途，其中所述生物样品分离自体液。
4.权利要求3的用途，其中所述体液选自脑脊液、血液、血浆、血清和尿液。
5.权利要求I的用途，其中所述肿瘤位于头、颈、膀胱、肝脏、卵巢、肾、消化道、脑或乳腺。
6.权利要求I的用途，其中所述哺乳动物为人。
7.权利要求I的用途，其中所述用SPARC结合化合物检测SPARC。
8.权利要求7的用途，SPARC结合化合物是结合至281个氨基酸SPARC糖蛋白的抗体。
9.权利要求I的用途，其中所述治疗剂选自酪氨酸激酶抑制剂、激酶抑制剂、生物活性齐U、生物分子、放射性核素、阿霉素、安沙霉素抗生素、门冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺氯氨钼、卡波氯氨钼、亚硝脲氮芥、卡西他滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、氮烯唑胺、放线菌素、柔红霉素、右雷佐生、多烯紫杉醇、阿霉素、鬼白亚乙苷、埃博霉素、5-氟脱氧尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、依立替康、环己亚硝脲、二氯甲二乙胺、巯嘌呤、meplhalan、氨甲喋呤、雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉醇、帕米膦酸盐、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、美罗华、链脲霉素、鬼白噻吩苷、硫鸟嘌呤、三胺硫膦、紫杉烷、长春花碱、长春新碱、长春瑞宾、泰索、考布他汀、discodermolides、反钼、抗-血管内皮细胞生长因子化合物(“抗-VEGF”)、抗-表皮生长因子受体化合物(“抗-EGFR”)、5_氟尿嘧啶及其衍生物和组合。
全文摘要
本发明提供了偶联至能结合281个氨基酸的SPARC糖蛋白的化合物的治疗剂在制备用于治疗哺乳动物的肿瘤的药物中的用途。本发明还提供了用于将化疗剂递送至表达SPARC的人肿瘤的方法，包括给予包含偶联至结合SPARC蛋白的化合物的化疗剂的药物组合物。本发明进一步提供了包含偶联至能结合SPARC蛋白的化合物的化疗剂和药学可接受载体的组合物。
文档编号A61K38/40GK102614521SQ20121000825
公开日2012年8月1日 申请日期2005年5月16日 优先权日2004年5月14日
发明者N·P·德赛, P·苏恩-施昂, V·特利乌 申请人:阿布拉西斯生物科学公司