专利名称：一种组织工程骨/软骨一体支架的制备方法
技术领域：
本发明属于组织工程技术和生物材料领域，涉及用于修复人体关节软骨缺损的组织工程支架制备技术领域，特别涉及具有梯度功能仿生的组织工程骨/软骨一体支架及其制备方法。
背景技术：
由创伤、退变或炎症等因素导致的关节软骨损伤是骨科临床常见疾病，由于软骨再生和修复能力极为有限，一旦损伤后难以自我修复，而传统的治疗方法如保守治疗、微骨折、关节镜灌洗术等均无法取得满意的疗效，损伤部位的持续发展可导致肢体功能障碍以及肢体伤残，严重影响患者的生活质量。目前临床治疗关节软骨损伤大多采用自体或异体软骨移植，但是自体软骨移植会破坏正常软骨组织，对病人损伤较大，而异体软骨来源有限并且会产生免疫排斥等问题。另外，关节软骨损伤往往伴随软骨下骨的病变，因而修复软骨层的同时还需修复软骨下骨。组织工程技术近年来在临床治疗和实验中取得了巨大成效，也为软骨损伤的修复提供了新的思路和解决方法。组织工程技术核心是构建由细胞和细胞支架结合而成的复合体，主要内容包括种子细胞、支架、细胞因子以及培养环境。其中，构建理想的组织工程化骨 /软骨支架是修复软骨缺损的关键。从软骨表面至软骨下骨，天然软骨的组成结构和功能随深度改变而不同透明软骨层主要成分为II型胶原、蛋白多糖和水分，其中胶原纤维呈拱门状排列，其间充满吸水性极强的蛋白多糖等，由此产生禁锢性膨胀压力，使软骨层富有弹性、持久的耐压耐磨性能，同时具有可供内外营养物质交换的渗透润滑作用；软骨钙化层主要由II型胶原和羟基磷灰石组成，结构致密并且具有一定的力学强度，该层将软骨层和软骨下骨分隔成两个理化因素不同的微环境，使二者能够各自进行新陈代谢；软骨下骨主要成分为I型胶原和羟基磷灰石，该组织为整个软骨层提供主要的力学支撑作用。上述诸多特性来源于软骨生化组成和空间结构的复杂整合，因此理想的组织工程骨/软骨支架应具备如下特点(1)在材料组成方面，主要为生物源性的天然成分，同时还须匹配软骨各层的主要成分以便获得最佳的生物相容性，利于细胞粘附、增殖和分化；(2) 在空间结构方面，支架沿厚度方向应具有梯度和取向结构，在满足力学强度的同时便于软骨细胞排列分布，使细胞分泌的基质和水分含量接近软骨各层的成分要求，另外孔隙率和孔径大小也应满足细胞和营养物质的进入。如何制备上述组成成分与空间结构均高度仿生的组织工程骨/软骨支架是近年来软骨组织工程领域的研究热点。目前国内外制备骨/软骨支架多采用分层构建、纤维粘结、溶媒熔接以及三维打印等方式进行。支架材料包括松质骨、胶原、壳聚糖、藻酸钙、纤维蛋白胶、透明质酸以及高分子聚合物、羟基磷灰石等。然而，上述方法及材料制备的支架存在以下问题(1)支架内部分层明显，层与层之间抗剪切作用差；(2)支架软骨层的孔隙结构仿生程度低，无梯度取向变化；C3)支架与修复部位的即时固定存在缺陷，无法满足临床修复的需要；(4)凝胶类材料力学支撑强度低，聚合物类材料降解产生酸性物质，破坏软骨
4修复的微环境；(5)部分工艺操作复杂，所需设备昂贵。
发明内容
为了克服上述制备技术存在的缺陷，本发明提供了一种新型的组织工程骨/软骨一体支架的制备方法，仿生天然关节软骨的组成成分和空间结构特征，选用骨基质明胶和软骨细胞外基质为主要原料，采用定向结晶、冷冻干燥和化学交联技术，获得力学强度高、 内部孔隙取向排列、孔径沿厚度方向梯度变化的一体化支架结构。本发明的技术方案如下一种组织工程骨/软骨一体支架的制备方法，包括以下步骤1)取新鲜关节软骨制备成不同浓度的软骨细胞外基质(ECM)浆料，包括浓度分别为1 2%和3 4%的两种ECM浆料(注这里的百分含量单位是g/mL，例如1 %即0. Olg/ mL，指IOOmL溶液中含有0. Ig溶质，这是生化领域中将固体物质配制成溶液试剂时通用的浓度表示方法，下同，不再赘述)；2)将松质骨切片并进行去脂、脱钙、脱细胞处理，得到骨基质明胶(BMG)片；3)选用一深度可调节的模具，模具的顶端敞口，底部可活塞式移动；4)将裁剪为模具横截面形状的BMG片放置在模具底部，然后倒入浓度为3 4% 的ECM浆料，通过振动排出BMG片内部气泡，使ECM浆料浸透BMG片的空隙并淹没过BMG片；5)再往模具中加入浓度为1 2%的ECM浆料，垂直振动使上下两层ECM浆料之间自然融合；6)调节模具深度，使ECM浆料上表面与敞口端齐平，用金属片盖住敞口端并与浆料完全接触，用保温材料包裹模具四周及底面，然后将模具冷冻，进行定向结晶；7)去除敞口端的金属片及保温材料，将模具移入冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到成型支架；8)在支架底端(具有BMG片的一端)涂抹透明质酸溶液和纳米羟基磷灰石的混悬液，通过毛细作用使混悬液进入支架孔隙中；9)将支架进行紫外辐照和化学交联，清洗后再次冷冻干燥，得到组织工程骨/软骨一体支架。上述步骤1)制备不同浓度的ECM浆料的过程是将新鲜关节软骨洗净剪成小块， 在蛋白酶抑制剂存在的条件下进行超微湿法粉碎，梯度离心，收集上清，先用细胞裂解液处理去除残留细胞成分，再用脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶处理去除核物质，然后加乙醇沉淀，梯度离心，收集沉淀，用水配制成浓度范围在1 4%的不同浓度的浆料，4°C保存备用。步骤1)具体操作中，所述蛋白酶抑制剂可选用苯甲基磺酰氟，将关节软骨小块放入含0. 35mM苯甲基磺酰氟的TriS-HCL(pH7. 4)缓冲液中进行超微湿法粉碎，粉碎在4°C 下进行。粉碎后添加三蒸水充分稀释再离心，离心可采用4°C下差速离心(3000 6000r/ min) 15 30分钟，收集上清。取上清进行细胞裂解，细胞裂解液可用TritonX-100，在 4°C下持续振荡M 36小时去垢以及去除残余细胞成分。去除核物质可在脱氧核糖核酸酶40000 60000U/L及核糖核酸酶800 1200U/L的条件下37°C消化12小时。消化后， 添加75%的乙醇溶液进行沉淀，4°C下10000 12000r/min高速离心，收集沉淀，添加三蒸水配制成不同浓度的ECM浆料，4°C保存备用
上述步骤幻制备BMG片的过程是利用不脱钙切片机将松质骨块切成厚度为 0. 5 Imm松质骨片，清洗后用双氧水浸泡至骨片呈白色，再用水漂洗，-20°C低渗反复冻融使细胞膜破碎，然后进行去脂、脱钙、脱细胞处理，获得骨基质明胶(BMG)，冷冻干燥后4°C 保存备用。步骤2)具体操作可以是切片后将骨片先用生理盐水反复浸泡冲洗15 30分钟，再放入的双氧水中浸泡1 2小时至骨片呈白色。-20°C低渗反复冻融2 4次，每次12 M小时，然后添加去脂、脱细胞液2%十二烷基硫酸钠、6%脂肪酶、乙二胺四乙酸、0. 迭氮钠，室温振荡M 36小时；再将骨片浸泡于10%乙二胺四乙酸中，37°C保存 3 5天至骨片呈白色多孔海绵状；3% TritonX-IOO漂洗骨片12小时，三蒸水清洗15 30分钟，获得去脂、脱钙、脱细胞骨基质明胶(BMG)，冷冻干燥后4°C保存备用。上述步骤幻所述模具一端敞口，另一端为可活塞式运动的底部，因而能够调节模具深度，为后续的定向结晶提供条件，并可用于制作不同厚度的支架。上述步骤4)所使用的3 4% ECM浆料和步骤5)所使用的1 2 % ECM浆料的体积比一般为1 1 2 1，本领域技术人员可根据支架修复部位的结构特征进行适当调離
iF. ο上述步骤6)所述金属片通常使用不锈钢片，在低温环境中，与金属片接触的浆料产生定向结晶，所述低温环境一般是指-40°C的环境，冷冻3 4小时或更长时间。上述步骤7)冷冻干燥的温度为_50°C。上述步骤8)透明质酸溶液与纳米羟基磷灰石的混悬液通过毛细作用进入BMG和 ECM孔隙，三者共同组成一体支架的底层，其中透明质酸溶液的浓度为1 2%，混悬液中纳米羟基磷灰石与透明质酸的质量比为1 4 1 6。上述步骤9)化学交联采用的交联剂是碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)，将支架置于碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的无水乙醇溶液交联12小时，其中碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的浓度分别为50mM和20mM。所制备的一体支架真空包装， Co60灭菌，4°C保存备用。本发明方法制备的组织工程骨/软骨一体支架，结合自体软骨细胞或间充质干细胞，用于修复关节软骨缺损。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果1)从制备原料分析该支架原料均为生物源性的天然成分，其来源可以是异体人或异种猪、牛、羊、犬等动物。其中ECM为软骨细胞外基质，它保留了天然关节软骨细胞外基质的大部分成分，如II型胶原和GAG，使得软骨细胞无需体外诱导培养便可粘附和增殖，具有绝佳的生物相容性。关于提取软骨细胞外基质的方法，本发明人已申请和获得授权多项相关专利(参见中国专利申请号/专利号200510073008. 1,200810057373. 7、 200810106133. 1)，制备技术已成熟。而BMG经过去脂、脱钙、脱细胞处理，主要成分为I型胶原，与软骨下骨成分相同，并且具有疏松的三维多孔结构，力学强度较高，能够为支架在缺损部位的即时固定提供充足的力学支撑。2)从支架内部结构分析该支架内部孔隙呈取向排列，细胞进入后也呈柱状排列分布(如图1、2所示)，与天然软骨层结构相似。由于沿厚度方向ECM浓度不同，导致孔隙大小沿厚度方向还会出现梯度变化，因此植入细胞分泌新的基质含量及功能也会呈梯度变化。另外，该支架为一体结构成型，能够承受剪切力的作用，满足植入部位的力学要求。支架平均厚度为3mm，接近人关节软骨厚度，临床治疗软骨缺损时可减少支架尺寸的修改。总之，本发明制备的一体化取向骨/软骨支架克服了传统工艺中骨/软骨支架内部结构仿生程度低、力学强度不足等问题，结合软骨细胞或间充质干细胞修复关节软骨缺损可获得满意的治疗效果。此外，本发明制备支架的工艺过程简单，操作方便，重复性好，支架稳定性高，是一种应用前景广泛的组织工程骨/软骨支架材料。
图1是本发明实施例制备的组织工程骨/软骨一体支架结构示意图；图2是本发明制备的组织工程骨/软骨一体支架的局部光学显微镜照片。
具体实施例方式以下通过实施例来进一步描述本发明，应当理解的是，这些实施例仅用于例证目的，绝不限制本发明的范围。实施例1 制备不同浓度的关节软骨细胞外基质(ECM)购买新鲜的猪关节软骨组织块，用生理盐水反复冲洗干净后，剪裁成小块，放入含蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(0.35mM)的Tris-HCL(pH7. 4)缓冲液中，在4°C下进行超微湿法粉碎。添加三蒸水充分稀释后在4°C下差速离心(3000 6000r/min)30分钟，收集上清， 用TritonX-IOO在4°C下持续振荡M小时去垢以及去除残余细胞成分，添加脱氧核糖核酸酶50000U/L及核糖核酸酶1000U/L，在37°C下消化12小时，去除核物质。添加75%的乙醇溶液10 20ml进行沉淀，4°C下12000r/min高速离心，收集沉淀，添加三蒸水配制成浓度为和4%的两种浆料，4°C保存备用。。实施例2 制备骨基质明胶(BMG)选取牛膝关节松质骨，用不脱钙骨切片机将松质骨块切成厚度为Imm的骨片，用生理盐水反复浸泡冲洗15 30分钟后放入双氧水中浸泡1小时至骨块呈乳白色。三蒸水漂洗骨块2次后，一起放入_20°C冷冻M小时再解冻，低渗反复冻融2次破细胞膜。添加去脂、脱细胞液2%十二烷基硫酸钠、6%脂肪酶、乙二胺四乙酸、0. 迭氮钠，室温振荡M小时。然后将骨片放入10%乙二胺四乙酸溶液中，37°C保存4天，直至骨片呈多孔白色海绵状。再用3% TritonX-IOO漂洗骨片12小时，三蒸水漂洗15分钟后，冰冻切片染色，镜下观察脂肪、骨髓已去除。将去脂、脱钙、脱细胞骨基质明胶(BMG)片冷冻干燥后，4°C 保存备用。实施例3 制备骨基质明胶和细胞外基质一体支架选用一端敞口，另一端为可活塞式运动底部的模具。先将实施例2中制备的BMG片放入模具底部，取实施例1中制备的4% ECM浆料20ml倒入模具，振动2分钟，使ECM浆料完全浸透BMG孔隙，多余浆料覆盖在BMG上表面，厚度为2mm ；取实施例1中浓度为1 % ECM 浆料IOml继续加入模具内，覆盖4% ECM浆料，垂直振动使两层ECM浆料之间自然融合，呈一体结构，整体厚度为3mm;调节模具深度，使浆料与敞口端齐平，用不锈钢片盖住敞口端并且与浆料完全接触，模具外周及底部用保温泡沫包裹，确保与不锈钢片接触的浆料产生定向结晶；将整个模具置于-40°C环境中冷冻4小时，然后移入-50°C冷冻干燥机中进行冷冻干燥48小时；支架成型后，在支架具有BMG的一端均勻涂抹含有纳米羟基磷灰石的透明质酸混悬液，其中透明质酸浓度为1.5%，羟基磷灰石与透明质酸质量比为1 5，由于毛细作用，混悬液进入BMG和ECM孔隙，支架经过紫外辐照8小时，碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的无水乙醇溶液交联12小时(碳化二亚胺浓度为50mM ；NHS浓度为2OmM)，三蒸水漂洗15分钟，再次冷冻干燥48小时，获得成型的骨/软骨一体支架。
所制备的组织工程骨/软骨一体支架的局部光学显微镜照片见图2，其结构如图1 所示，BMG基底2提供给支架充足的力学支撑；ECM胶原纤维1呈取向排列，孔隙呈梯度变化；纳米羟基磷灰石3从底部进入到BMG和ECM孔隙中。
权利要求
1.一种组织工程骨/软骨一体支架的制备方法，包括以下步骤1)取新鲜关节软骨制备成浓度为1 2%和3 4%的两种不同浓度的软骨细胞外基质浆料；2)将松质骨切片并进行去脂、脱钙、脱细胞处理，得到骨基质明胶片；3)选用一深度可调节的模具，模具的顶端敞口，底部可活塞式移动；4)将裁剪为模具横截面形状的骨基质明胶片放置在模具底部，然后倒入浓度为3 4%的软骨细胞外基质浆料，使浆料浸透骨基质明胶片的空隙并淹没过骨基质明胶片；5)再往模具中加入浓度为1 2%的软骨细胞外基质浆料，垂直振动使上下两层浆料之间自然融合；6)调节模具深度，使浆料上表面与敞口端齐平，用金属片盖住敞口端并与浆料完全接触，用保温材料包裹模具四周及底面，然后将模具冷冻，进行定向结晶；7)去除金属片及保温材料，将模具移入冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到成型支架；8)在支架具有骨基质明胶片的一端涂抹透明质酸溶液与纳米羟基磷灰石的混悬液，通过毛细作用使混悬液进入支架孔隙中；9)将支架进行紫外辐照和化学交联，清洗后冷冻干燥，得到组织工程骨/软骨一体支
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)采用如下方法制备软骨细胞外基质浆料将新鲜关节软骨洗净剪成小块，在蛋白酶抑制剂存在的条件下进行超微湿法粉碎，梯度离心，收集上清，先用细胞裂解液处理去除残留细胞成分，再用脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶处理去除核物质，然后加乙醇沉淀，梯度离心，收集沉淀，用水配制成不同浓度的浆料。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)将关节软骨小块放入含0.35mM 苯甲基磺酰氟的PH7. 4的Tris-HCL缓冲液中，4°C下进行超微湿法粉碎；然后添加三蒸水充分稀释，4 °C下3000 6000r/min差速离心15 30分钟，收集上清；上清用1 % TritonX-IOO在4°C下持续振荡M 36小时去垢和去除残余细胞成分；然后在40000 60000U/L脱氧核糖核酸酶和800 1200U/L核糖核酸酶的条件下37°C消化12小时；消化后添加75%乙醇溶液进行沉淀，4°C下10000 12000r/min高速离心，收集沉淀，再用三蒸水配制成不同浓度的浆料。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)采用如下方法制备骨基质明胶片利用不脱钙切片机将松质骨块切成厚度为0.5 Imm松质骨片，清洗后用双氧水浸泡至骨片呈白色，再用水漂洗，-20°C低渗反复冻融使细胞膜破碎，然后进行去脂、脱钙、脱细胞处理，获得骨基质明胶片。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)将双氧水处理后的骨片于-20°C低渗反复冻融2 4次，每次12 M小时，然后置于含2%十二烷基硫酸钠、 6%脂肪酶、乙二胺四乙酸和0. 迭氮钠的溶液中，室温振荡M 36小时；再将骨片浸泡于10%乙二胺四乙酸中，37°C保存3 5天至骨片呈白色多孔海绵状；然后用3% TritonX-IOO漂洗骨片12小时，三蒸水清洗15 30分钟，获得骨基质明胶片。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所使用的3 4%ECM浆料和步骤5)所使用的1 2% ECM浆料的体积比为1 1 2 1。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤6)所述金属片为不锈钢片，冷冻温度为-40°C，冷冻时间3 4小时或更长。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤8)中所述透明质酸溶液的浓度为 1 2%，混悬液中纳米羟基磷灰石与透明质酸的质量比为1 4 1 6。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤9)化学交联采用的交联剂是碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。
全文摘要
本发明公开了一种组织工程骨/软骨一体支架的制备方法，仿生天然关节软骨的组成成分和空间结构特征，选用软骨细胞外基质和骨基质明胶为主要原料，采用不同浓度叠加、定向结晶、冷冻干燥、交联反应等方法获得内部孔隙取向排列、孔径沿厚度方向梯度变化、力学性能良好的一体化支架结构。该支架良好的生物相容性利于细胞粘附和增殖，其特殊的孔隙结构使细胞分泌的基质含量也呈梯度变化，同时骨基质明胶基底为支架与受损部位的即时固定提供了良好的力学支撑。
文档编号A61L27/36GK102552981SQ20121001459
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者梁增义 申请人:北京申佑生物科技有限公司