专利名称：一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法
技术领域：
本发明属于细菌纤维素复合材料的制备领域，特别涉及一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法。
背景技术：
细菌纤维素(Bacterial Cellulose，简称BC)膜独特的三维纳米纤维网状结构赋予其良好的透气、透水性能，能吸收60 700倍于其干重的水份，这些水均以自由水的形式存在。与其它人工皮肤和伤科敷料相比，该膜的主要特点是与皮肤相容性好，无刺激性；纳米纤维素纤维不会和伤口粘连，不会造成二次伤害，剥离时也不会有残留；在潮湿情况下对液、气及电解物有良好的通透性、能够迅速吸收伤口血液和组织液，防止伤口感染化脓，又能为慢性伤口附近的组织再生提供湿润的环境，促进伤口愈合和有效减轻疼痛，有利于皮肤组织生长。此膜作为缓释药物的载体携带各种药物，利于皮肤表面给药，促使创面的愈合和康复。目前，具有高附加值的生物医用敷料的开发已成为细菌纤维素领域的研发热点。细菌纤维素本身不具有抗菌性能，以其为基底制备抗菌敷料，只能通过后期整理时复合进抗菌材料，譬如苯扎氯铵、纳米银或壳聚糖等抗菌剂来赋予BC敷料抗菌性能。这样的技术生产周期长，过程繁琐，效率低。由于在发酵培养基中添加抗菌材料会抑制细菌繁殖，因此一直无法解决在线培养合成细菌纤维素抗菌膜的技术难题。因此有必要开发一种新技术，在培养时将现有的抗菌材料与细菌纤维素复合制备成复合抗菌膜材料。另一方面，纱布是纺织基传统伤科敷料，目前该类敷料存在以下问题(1)其吸水性能较差，保湿能力不足；( 载药和缓释的能力差；C3)易与伤口粘连，换药时造成二次创伤；(4)不能及时吸收伤口组织分泌出来的体液和其他物质；(5)单层纱布的物理阻隔作用较差，无法阻挡空气中的灰尘和微生物，不能为伤口愈合提供一个相对湿润和无菌的环境， 无法促进伤口愈合。以上这些缺陷限制了纺织基敷料在高档产品上的应用。传统纱布敷料已越来越不能满足人们处理伤口的要求。如在这些传统敷料表面涂覆上一层纳米纤维结构的细菌纤维素，将可以赋予这些传统敷料保湿、缓释、不粘连、促愈合等新功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，该方法制备效率高，方法简便易行，成本低廉；该细菌纤维素复合材料表面具有纳米级的三维纤维网状结构，其抗拉强度较之纯细菌纤维素膜得到极大的提高，可广泛应用于面膜、创伤敷料、敷贴、人造皮肤等产品。本发明的一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，包括(1)将活化过的细菌纤维素生产菌接入液体培养基扩培，于20-30°C下以 100-250r/min动态培养或者静置培养12 48h ；将液体培养基转移至含有骨架材料模具的生物反应器中培养0. 5-20天，向液体培养基中添加抗菌材料，在生物反应器中继续培养 0. 5-20天后即得未纯化的纳米纤维素抗菌复合材料；
(2)将上述细菌纤维素膜从骨架上剥离后或者直接将该复合材料浸泡于0. 5 2衬％的NaOH溶液中，于70-100°C水浴处理30-120min，洗涤至中性，即得纯化的纳米抗菌细菌纤维素膜或其复合材料。所述步骤(1)在含有骨架材料模具的生物反应器中培养条件为于20_32°C下静置培养或者以3-200rpm动态培养。所述步骤(1)中的骨架材料为高分子聚合物、纤维素、纤维素衍生物、多糖类、琼月旨、海藻酸类、透明质酸、甲壳素、涤纶、丙纶、蛋白质、多肽、明胶、胶原、真丝、硅胶、橡胶、木材、淀粉、尼龙、奥纶、聚乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯乙醇、特氟纶、聚四氟乙烯、塑料、聚丙烯酰胺、纱布、棉布、纸张、羊毛、壳聚糖、壳聚糖衍生物、聚谷氨酸、二氧化硅、玻璃、陶瓷、紫砂、 金属盐、金属氧化物中的一种或几种。所述步骤(1)中的骨架材料为膜状或者带网眼的材料，网眼孔径为0. 05mm-10mm,
孔的形状是圆形、方形、三角形、椭圆形、心形、菱形或五角星形。所述步骤(1)中的细菌纤维素生产菌株为醋酸菌属(AcetcAacter sp.)、葡萄糖酸杆菌属(GluconcAacter sp.)、葡糖酸醋杆菌属(GluconacetcAacter sp.)、葡萄糖氧化杆菌(Gluconobacter oxydans)、根瘤菌属(Rhizobium sp·)、八叠球菌属(Sarcina sp.)、假单胞菌属(Pseudomounas sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)、 土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、洋葱假单胞菌(Seudomonas c印acia)、空肠弯曲菌 (Campylobacter jejuni)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)或红茶菌(kombucha)。所述步骤(1)中的液体培养基为液体种子培养基或液体发酵培养基。该培养基可以包含抗菌材料。所述细菌纤维素生产菌株中除红茶菌以外的菌种按2 3接种环的接种量接入液体种子培养基；红茶菌按接入1-10片直径0. 5cm圆片菌膜的接种量接入液体种子培养基；或者除红茶菌以外的菌种按2 3接种环的接种量接入液体种子培养基制备种子液，然后按体积百分比3% 20%的接种量转接到液体发酵培养基；红茶菌按接入1-10 片直径0. 5cm圆片菌膜的接种量接入液体种子培养基制备种子液，然后按1 10片直径 0. 5-lcm圆片菌膜的接种量转接到液体发酵培养基。所述除红茶菌以外的菌种液体种子培养基和液体发酵培养基的组分均为每IL水中，甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖或果糖20_200g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、 酵母浸膏 5g，pH3. 0-7. 5 ；或每IL水中，甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20_200g，酵母浸膏5g，蛋白胨或胰蛋白胨 5g，柠檬酸 1. 15g，Na2HP042. 7g，ρΗ3· 0-7. 5。所述红茶菌液体种子培养基和液体发酵培养基，其组成均为每IL水中，绿茶或者红茶l-10g，葡萄糖、蔗糖或者果糖10 200g，蛋白胨或者胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3. 0-7. 5 ；或将葡萄糖、蔗糖或果糖、绿茶或红茶、以及水配成培养基，其中糖、茶、水的质量比为 5 0. 1-0. 4 100-200，ρΗ3· 0-7. 5 ；或每IL水中，甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20_200g，蛋白胨或胰蛋白胨3g，酵母浸膏 5g，ρΗ3· 0-7. 5。
所述步骤(1)中的生物反应器含有1-100%氧气或者空气。所述步骤(1)中的抗菌材料为多糖类、海藻酸类、甲壳素、蛋白质、多肽、壳聚糖、 壳聚糖衍生物、金属、金属盐、金属氧化物中的一种或几种。所述步骤(1)中的向液体培养基中添加抗菌材料的方式为间歇式、分批补料式或连续式。所述的生物反应器包括温度计口⑴、酸液碱液添加口(2)、把手(3)、通气口⑷、 PH计口(5)、营养补料口(6)、转轴(7)、发酵罐(8)、马达(9)、转鼓(10)、发酵罐夹套(11)、 循环水进口(12)和出口(13)、营养液进口(14)和出口(15)，以及冷凝水出口(16)；其中， 温度计口(1)、酸液碱液添加口⑵、把手(3)、通气口 (4)、pH计口 (5)和营养补料口 (6)均位于发酵罐⑶的外表面上；夹套(11)上有用来恒温的循环水进口(12)和出口(13)，以及营养液进口(14)和出口(15)；转轴(7)的一端连接马达(9)的输出轴，转轴(7)另一端从发酵罐(8)的一端面中心位置伸入发酵罐(8)内；在发酵罐(8)内的转轴(7)上固定有转鼓(10)；发酵罐(8)为任意形状；发酵罐(8)内安装有料液高度探头。所述的转鼓(10)上包覆有骨架材料，或者是转轴上垂直分布的两片转盘撑起可缠挂细菌纤维素的骨架材料以形成转鼓(10)。有益效果(1)本发明通过“亚动态”或“亚静态”培养方式，利用细菌纤维素在液体中易缠绕的特性，原位合成BC/纱布复合材料。并通过在细菌发酵过程中少量多次添加壳聚糖等抗菌材料的方式，成功原位合成了抗菌材料/BC/纱布复合膜，解决了原来一次加入抗菌剂会抑制纤维素生产菌自身增殖的难题，赋予了 BC复合材料抗菌功能。本发明实现了细菌纤维素抗菌膜的发酵生产和膜片收获的连续化和机械化作业，节省了发酵时间，生产效率高，处理量大，适合大规模工业化生产。(2)由于纯的湿细菌纤维素敷料的机械强度不够，在使用过程中容易破裂造成使用不便，如要达到与纱布同样力学性能则要求纤维素膜达到一定厚度，这会增加膜的硬度， 贴肤性明显下降。本发明利用目前现有其它材料(如传统的纱布等纺织基材料)的强度特性，以该材料为骨架支撑，将其与细菌纤维素复合制备成支架复合材料，缩短产品生产周期，并通过复合进不同类型材料以赋予该细菌纤维素复合膜的不同功能。该复合材料兼具 BC膜和纱布的两种材料的优点一方面在纱布上均勻涂覆了一层具有超细网状结构细菌纤维素，可以改善纱布的吸水、保湿，载药性能，以及物理阻隔性能；另一方面将纱布作为支架引入BC膜中能够有效增强BC膜的力学性能。(3)本发明可以实现对现有材料的纳米纤维素涂覆改性，赋予这些传统敷料高吸液性、不粘连伤口、药物缓释、抗菌以及促进伤口愈合等新功能。(4)本发明的使用将可以减少达到常规细菌纤维素膜强度的细菌纤维素用量，节约了 BC用量。制备的细菌纤维素膜复合材料在保持传统材料强度的基础上赋予其BC独特的纳米三维网状结构，具有高吸水和持水能力、高结晶度、高聚合度、高强度以及良好的生物相容性等优点。产品可广泛应用于面膜、创伤敷料、敷贴、人造皮肤等产品。
图1为制备细菌纤维素复合材料的发酵装置示意图2为培养Mh的未覆(左)与覆有细菌纤维素(右)的纱布骨架微观结构图；图3为不同培养时间涂覆了细菌纤维素的纱布吸水性能得到改善的结果图，未覆 BC纱布作为对照(左1)；图4为添加了不同壳聚糖的细菌纤维素复合材料产量；图5为细菌纤维素复合材料的扫描电镜照片；图6为单位面积骨架材料上的BC产量随培养时间的变化结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1(1)菌种培养将木醋杆菌(Acetobacter xylinum)接入300mL液体培养基(每IL水中，甘露醇 20g、蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3. 0，121°C灭菌20min ；或葡萄糖200g，酵母浸膏5g，胰蛋白胨 5g，柠檬酸 1. 15g, Na2HP042. 7g，水 1L，pH7. 5，121°C灭菌 20min)扩培，于 20°C、lOOr/min 条件下摇床培养或者静置培养1 后备用；(2)细菌纤维素复合抗菌膜的发酵制备将步骤(1)制备的含生产菌株的液体培养基转移到配备有固定了纱布或者真丝骨架材料转鼓的生物反应器中，然后转鼓以7、15、30和60rpm的转速旋转进行扰动培养，于 30°C动态培养1天后，定期往培养基中添加不同浓度的壳聚糖溶液，再培养2-7天后即可得细菌纤维素/纱布/壳聚糖或者细菌纤维素/真丝/壳聚糖复合膜，成膜情况见表1 ；由表 1可知，在转鼓培养中，细菌纤维素已固定在骨架材料上。或者取步骤(1)活化好的菌种以10%的接种量接入到300mL发酵培养基中，置于 500mL锥形瓶中，在30°C和160rpm的条件下培养4小时，然后再将发酵液转移到生物反应器中，然后转鼓以7、15、30和60rpm的转速旋转进行扰动培养，于30°C条件下分别培养1天后，定期往培养基中添加不同浓度的壳聚糖溶液，再培养2-7天后即可得到不同覆盖度的细菌纤维素复合膜。该生物反应器包括温度计口 1、酸液碱液添加口 2、把手3、通气口 4、pH计口 5、营养补料口 6、转轴7、发酵罐8、马达9、转鼓10、水浴夹套11、循环水进口 12和出口 13、营养液进口 14和出口 15，以及冷凝水出口 16，示意图见图1。表1转速对脱脂纱布上成膜的影响
权利要求
1.一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，包括(1)将活化过的细菌纤维素生产菌接入液体培养基扩培，于20-30°C下以100-2501·/ min动态培养或者静置培养12 48h ；将液体培养基转移至含有骨架材料模具的生物反应器中培养0. 5-20天，向液体培养基中添加抗菌材料，在生物反应器中继续培养0. 5-20天后即得未纯化的纳米纤维素抗菌复合材料；(2)将上述细菌纤维素膜从骨架上剥离后或者直接将该复合材料浸泡于0.5 2wt% 的NaOH溶液中，于70-100°C水浴处理30-120min，洗涤至中性，即得纯化的纳米抗菌细菌纤维素膜或其复合材料。
2.根据权利要求1所述的一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，其特征在于所述步骤(1)在含有骨架材料模具的生物反应器中培养条件为于20-32°C下静置培养或者以3-200rpm动态培养。
3.根据权利要求1所述的一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，其特征在于所述步骤(1)中的骨架材料为高分子聚合物、纤维素、纤维素衍生物、多糖类、琼脂、 海藻酸类、透明质酸、甲壳素、涤纶、丙纶、蛋白质、多肽、明胶、胶原、真丝、硅胶、橡胶、木材、 淀粉、尼龙、奥纶、聚乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯乙醇、特氟纶、聚四氟乙烯、塑料、聚丙烯酰胺、 纱布、棉布、纸张、羊毛、壳聚糖、壳聚糖衍生物、聚谷氨酸、二氧化硅、玻璃、陶瓷、紫砂、金属盐、金属氧化物中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，其特征在于所述步骤(1)中的骨架材料为膜状或者带网眼的材料，网眼孔径为0. 05mm-10mm，孔的形状是圆形、方形、三角形、椭圆形、心形、菱形或五角星形。
5.根据权利要求1所述的一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，其特征在于所述步骤(1)中的细菌纤维素生产菌株为醋酸菌属、葡萄糖酸杆菌属、葡糖酸醋杆菌属、葡萄糖氧化杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属、土壤杆菌属、洋葱假单胞菌、空肠弯曲菌、木醋杆菌或红茶菌。
6.根据权利要求1所述的一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，其特征在于所述步骤(1)中的液体培养基为液体种子培养基或液体发酵培养基。
7.根据权利要求5所述的一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，其特征在于所述细菌纤维素生产菌株中除红茶菌以外的菌种按2 3接种环的接种量接入液体种子培养基；红茶菌按接入1-10片直径0. 5cm圆片菌膜的接种量接入液体种子培养基；或者除红茶菌以外的菌种按2 3接种环的接种量接入液体种子培养基制备种子液， 然后按体积百分比3 % 20 %的接种量转接到液体发酵培养基；红茶菌按接入1-10片直径 0. 5cm圆片菌膜的接种量接入液体种子培养基制备种子液，然后按1 10片直径0. 5-lcm 圆片菌膜的接种量转接到液体发酵培养基。
8.根据权利要求7所述的一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，其特征在于所述除红茶菌以外的菌种液体种子培养基和液体发酵培养基的组分均为每IL水中，甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖或果糖20-200g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏 5g，pH3. 0-7. 5 ；或每IL水中，甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20-200g，酵母浸膏5g，蛋白胨或胰蛋白胨 5g，柠檬酸 1. 15g，Na2HP042. 7g，ρΗ3· 0-7. 5。
9.根据权利要求7所述的一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，其特征在于所述红茶菌液体种子培养基和液体发酵培养基，其组成均为每IL水中，绿茶或者红茶l-10g，葡萄糖、蔗糖或者果糖10 200g，蛋白胨或者胰蛋白胨 3g、酵母浸膏 5g，pH3. 0-7. 5 ；或将葡萄糖、蔗糖或果糖、绿茶或红茶、以及水配成培养基，其中糖、茶、水的质量比为 5 0. 1-0. 4 100-200，ρΗ3· 0-7. 5 ；或每IL水中，甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20-200g，蛋白胨或胰蛋白胨3g，酵母浸膏 5g，pH3. 0-7. 5。
10.根据权利要求1所述的一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，其特征在于所述步骤(1)中的生物反应器含有1-100%氧气或者空气。
11.根据权利要求1所述的一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，其特征在于所述步骤(1)中的抗菌材料为多糖类、海藻酸类、甲壳素、蛋白质、多肽、壳聚糖、壳聚糖衍生物、金属、金属盐、金属氧化物中的一种或几种。
12.根据权利要求1所述的一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，其特征在于所述步骤(1)中的向液体培养基中添加抗菌材料的方式为间歇式、分批补料式或连续式。
全文摘要
本发明涉及一种在线培养制备纳米纤维素抗菌复合材料的方法，包括(1)将活化过的细菌纤维素生产菌接入液体培养基扩培；将液体培养基转移至生物反应器中培养，向液体培养基中添加抗菌材料，继续培养后即得未纯化的抗菌细菌纤维素复合材料；(2)将上述细菌纤维素膜从骨架上剥离后或者直接将复合材料浸泡于NaOH溶液中，水浴处理，洗涤至中性，即得。本发明制备效率高，方法简便易行，成本低廉；该细菌纤维素复合材料表面具有纳米级的三维纤维网状结构，其抗拉强度较之纯细菌纤维素膜得到极大的提高，可广泛应用于面膜、创伤敷料、敷贴、人造皮肤等产品。
文档编号A61K8/73GK102552965SQ20121001452
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者洪枫 申请人:东华大学