专利名称：miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病的药物中的应用。
背景技术：
非编码小分子RNA (miRNAs)是小分子量和内源性的RNA，调节基因的表达。miRNA 可与靶mRNA分子的3’非编码区(3' -UTR)互补序列结合，通过抑制mRNA的翻译或直接使mRNA降解，在转录后水平达到基因沉默效果。研究发现miRNA不仅在发育调控、细胞增殖与凋亡、造血过程等方面发挥作用，并且对心脏的发生发育同样有重要影响，miRNA在心脏存在高表达。先天性心脏病(CHD)影响世界上I %的新生儿并且具有高发病率和死亡率特别是在I岁之内的婴幼儿。先天性心脏病是一类常见的先天缺陷，约占人类所有先天缺陷的 25%。室间隔缺损(VSD)作为最常见的先天性心脏病，其发病机制和致病因素仍未阐明。 Pax-8基因属于哺乳类Pax蛋白家族的转录因子，这一基因家族编码的蛋白质都含有成对的结构域，一个保守的八肽和同源配对形式。这是一种核蛋白，参与甲状腺滤泡细胞的发育和甲状腺特异性基因的表达。Pax-8基因敲除小鼠有多种形式的心脏缺陷，特别是类似室间隔缺损和左心室扩大呈球形，其左心室壁和室间隔的细胞凋亡增加，此外，Pax-8基因在体外下调后细胞凋亡增加。因此，研究miRNA是否参与Pax-8基因敲除小鼠心脏结构发育的异常，可为VSD治疗药物筛选提供基础。
发明内容
本发明目的是提供miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病的药物中的应用。本发明采用的技术方案是miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病的药物中的应用。所述miRNA-122抑制剂用于制备治疗室间隔缺损的药物。所述药物通过抑制或降低miRNA-122表达来达到降低心肌细胞凋亡的作用。所述miRNA-122 抑制剂的 RNA 序列如下5' -CAAACACCAUUGU CACACUCCA-3'。近年的研究发现，脊椎动物中存在很多miRNA，其在个体发育过程中，尤其是在细胞发育过程中起着重要的作用，同样的miRNA在心肌损伤和凋亡的过程中也发挥了重要作用。Pax是机体内重要基因家族，其蛋白是一种重要的转录调节因子，在胚胎组织和器官的分化发育过程中起着重要的作用。Pax-8是哺乳类Pax家族的一员，Pax-8基因的表达具有组织的特异性，其基因敲除小鼠具有甲状腺发育不良和甲状腺功能低下。发明人之前研究发现Pax-8敲除小鼠模型其心脏出现室间隔缺损，电镜均显示左室壁和室间隔部位存在大量凋亡心肌细胞，细胞内线粒体数量明显增多，体积明显减小，因此Pax-8敲除小鼠可作为 VSD药物筛选的模型用于新药的筛选研究。本申请人通过研究miRNA-122表达对Pax_8基因敲除小鼠心肌细胞凋亡的影响发现，miRNA-122可能是VSD治疗的一个新基因靶点，有选择的调节miRNA_122表达，可以影响整个基因网络，从而影响复杂的疾病表型。因此，miRNA-122抑制剂有望作为VSD治疗的新药物，广泛应用于先天性心脏病的防治。本发明的有益效果主要体现在本发明发现了 VSD治疗的一个新基因靶点，提供了 miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病尤其是室间隔缺损的药物中的新用途，为新药筛选提供了基础。
图I为pax-8基因敲除小鼠鉴别；A和B为Pax-8 KO+条带；C为Pax-8 K0+/_条带；D为野生型小鼠条带；图2为HE染色观察Pax-8基因敲除纯合子与杂合子小鼠心脏形态;A :箭头所指为 Pax-8+小鼠的心脏室间隔缺损处(X400) ;B :Pax-8+/_小鼠的心脏基本上正常(X400)；图3为电子显微镜观察Pax-8基因敲除纯合子与杂合子小鼠心脏；A Pax-SKO+小鼠左心室壁细胞凋亡(6200X) ；B =Pax-SKO+小鼠左心室壁细胞线粒体数量增加，但形态变小(17500X) ；C Pax-8 K0+/_小鼠左心室壁细胞线粒体未见明显异常 (17500Χ) ；D Pax-8 KO+小鼠左心室壁细胞线粒体全景图(3700X)；图 4 为 FCM 检测 24h 后不同剂量 FAM-NC miRNA/Lipofectamine TM2000 转染 H9C2 细胞的效率；A :空白对照组 O. 1% ；Β :2· 5μ L/2. 5μ L 组 81. 0% ；C :5 μ L/5 μ L 组 96. 6 % ； D:7.5yL/7.5yI^98.7% ；图5为实时定量PCR检测miR-122表达水平；A :空白对照；B 阴性对照组；C miR-122 组；图6流式细胞仪检测细胞的凋亡率(转染24h后);A :空白对照组；B :阴性对照组；C miR-122 组；图7为流式细胞仪检测细胞的凋亡率(转染48h后)；A :空白对照组；B :阴性对照组；C miR-122 组；图8为实时定量PCR检测Pax-8表达水平；A :空白对照组；B :为阴性对照组；C Pax-8 si RNA 组；D Pax-8siRNA+miR-122 抑制剂组；图9为实时定量PCR检测miR-122表达水平；A :空白对照组；B 阴性对照组；C Pax-8 si RNA 组；D Pax-8siRNA+miR-122 抑制剂组；图10为流式细胞仪检测细胞的凋亡率(转染Pax-8siRNA后48h) ；A :空白对照组； B :阴性对照组；C Pax-8siRNA 组；D Pax-8siRNA+miR-122 抑制剂组。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :材料和方法材料与试剂大鼠H9C2胚胎心肌细胞株购自中国科学院上海细胞库。达尔伯克改良伊格尔培养基(high glucose) (DMEM)、胎牛血清(FBS)、0· 05%胰酶 / 乙二胺四乙酸(EDTA)、Hanks balanced salt solution 均购自美国 Gibco 公司。Trizol> IipofectaInineTM 2000 转染试剂、焦碳酸二乙酯(DEPC)水(RNase-free and DNase-free)均购自美国 Invitrogen 公司。miScript Reverse Transcription Kit 购自荷兰 Qiagen 公司。PCR 试剂盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix)购自日本 TaKaRa 公司。BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自美国Pierce公司。半胱天冬酶(caspase)_3分光光度法检测试剂盒购自南京凯基公司。AnnexinV/PI apoptosis kit 购自联科公司。细胞计数试剂盒名(CCK-8)购自日本同仁化学研究所。其他试剂均为进口或国产分析纯。Backman Du800计算机分光光度分析仪(美国)。酶标仪ECX800购自美国Bio-TEX公司。流式细胞仪(flow cytometry, FCM)购自美国BD公司。I. I鉴别和确定Pax-8敲除小鼠。纯合子(Pax-8-/-)和杂合子(Pax_8 KO+/-)小鼠的获得以前已经报道过，它们的基因型通过PCR鉴别，鉴别引物如下Pax-8 forward primer5/ -GGATGTGGAATGTGTGCGAGG -3’，5' -GCTAAGAGAAGGTGGAT GAGAG-3’，reverse primer 5' -GATGCTGCCAGTCTCGTAG3’ ；反应条件94°C5min ；94°C 15s、60°C 15s、72°C 30s, 25 个循环；72°C再延伸 5min。I. 2 MicroRNA芯片杂交分析首先收集试验组和对照组的小鼠的心脏，然后用总RNA试剂盒(Invitrogen)提取和纯化总RNA。经紫外吸收测定和变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量，miRNA分离，纯化和用Cy3标记,然后与miRNA芯片杂交,芯片结果由Agilent公司的扫描仪扫描,通过特定软件分析荧光信号的强度和比值(扫描分辨率5 μ m，PMT100%和5% )，两组之间的平均数值 > 2为表达上调，< O. 5为表达下调。I. 3实时定量PCR分析使用miScription Reverse Transcription Kit (QIAGEN)进行 miRNAs 的逆转录， 具体操作根据公司的说明书进行。使用ABI7300进行PCR反应，每个miRNA的相对上样量通过U6RNA进行标准化，使用公式2_Δετ，ACT = (CTmiRNA-CTU6RNA) (CT是提示荧光信号强度达到阈值，在PCR扩增过程中所需的周期。)。miRNA实时定量PCR特定引物(见表1，由上海Invitrogen合成)和试剂盒中包括的通用引物一起参与PCR反应,实验重复3次。表I :miRNA特异性引物
权利要求
1.miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病的药物中的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述miRNA-122抑制剂用于制备治疗室间隔缺损的药物。
3.如权利要求I或2所述的应用，其特征在于所述药物通过抑制或降低miRNA-122表达来达到降低心肌细胞凋亡的作用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述miRNA-122抑制剂序列如下 5' -CAAACACCAUUGUCACACUCCA-3'。
全文摘要
本发明提供了miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病的药物中的应用。所述miRNA-122抑制剂序列如下5′-CAAACACCAUUGUCACACUCCA-3′。申请人研究发现，miRNA-122表达上调导致心肌细胞凋亡，而心肌细胞凋亡增加是室间隔缺损的机制之一，所以本发明提示miRNA-122是治疗室间隔缺损药物的新靶点，通过下调miRNA-122的表达减少心肌细胞凋亡，这是一条药物治疗的新途径。本发明的有益效果主要体现在本发明发现了VSD治疗的一个新基因靶点，提供了miRNA-122抑制剂在制备治疗先天性心脏病尤其是室间隔缺损的药物中的新用途，为新药筛选提供了基础。
文档编号A61K48/00GK102580117SQ201210014228
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月17日
发明者周希, 施翔翔, 杨德业, 黄晓燕, 黄芳 申请人:杨德业, 黄晓燕, 黄芳