Egfr抑制剂的敏感性的预测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种通过检查从受试者中以微侵袭（微创）方式采集的生物样品中的 KRAS蛋白质的基因型来预测该受试者对EGFR抑制剂的敏感性的方法。
[0002] 本申请基于2013年3月19日在日本提出的特愿2013-057033号申请主张优先权， 并在此援引其内容。
【背景技术】
[0003] 表皮生长因子受体（EGFR)是包含 EGFR (ErbB-1)、Her2/neu(ErbB-2)、 Her3(ErbB-3)以及Her4(ErbB-4)在内的且非常密切相关的受体ErbB家族的成员。ErbB 家族是在细胞的生长、分化以及生存中发挥重要作用的成长因子受体的1型酪氨酸激酶家 族。对这些受体的激活而言，典型的是通过特异性配体结合来引起，且在受体家族成员之间 形成异源或同源二聚体。随后，使其发生酪氨酸激酶结构域的自身磷酸化。
[0004] EGFR的激活，除了会诱导癌细胞的持续增殖和抑制作为生存中重要过程的细胞凋 亡，还会诱导受体酪氨酸激酶的激活以及介导细胞的增殖、运动性、粘附性、浸润性和对化 疗的耐受性的一系列下游信号传导现象。
[0005] 另外，含有EGFR和HER2的该家族成员与细胞转化直接相关。因此，作为抗癌剂， 目前正在开发以EGFR作为靶点的分子靶向药物。迄今为止，已进行了抗EGFR抗体和小分 子EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI)这两种主要类型的EGFR抑制剂的临床试验。西妥昔单抗 (Cetuximab)等抗EGFR抗体被设计成与EGFR的细胞外域结合以阻碍EGFR下游的信号的 激活。西妥昔单抗（其作为抗体225也是公知的，参见专利文献1)是针对表达出高水平的 野生型EGFR的A431细胞进行制作而成。与此相对比，吉非替尼（化合物ZD1839,易瑞沙） 和厄洛替尼（化合物0SI-774,特罗凯）等小分子TKI会竞争用于结合在EGFR酪氨酸激酶 的细胞内催化结构域的ATP。其结果是，阻碍了 EGFR自身磷酸化和下游信号。
[0006] 近年来，在临床上逐渐明确了作为大肠癌的分子靶向药物的西妥昔单抗、帕尼单 抗的治疗有效性与突变的KRAS基因或其蛋白质之间的关系、作为肺癌的分子靶向药物的 吉非替尼、厄洛替尼的治疗有效性与突变的EGFR基因或其蛋白质之间的关系、以及作为 ALK抑制剂的克唑替尼的治疗有效性与伴随易位的融合基因或其蛋白质之间的关系。在这 些药物的使用中，包含检查KRAS突变在内的伴随诊断（companion diagnostic)受到关注。 具体而言，在CRYSTAL(FOLFIRI)试验的III期（Phase III)大肠癌患者中，KRAS野生型患 者在西妥昔单抗并用时的有效率为59. 3%，与此相比，KRAS变异型患者在西妥昔单抗并用 时的有效率为36. 2%，针对KRAS变异型患者的西妥昔单抗的有效率戏剧性地达到了较低 的结果（例如，参见非专利文献1)。随后，在OPUS(F0LF0X)试验的II期（Phase II)大肠 癌患者中，也证明了西妥昔单抗对KRAS变异型患者的有效率极低而对野生型患者是有效 的。根据这些试验效果，确定了在大肠癌患者中的突变KRAS基因成为EGFR抑制剂的治疗 效果预测因子（例如，参见非专利文献2)。另外，还报告了，KRAS野生型组的治疗效果也差 的情况下，BRAF、PIK3CA中存在变异的临床试验结果。然而，目前的情况是作为超过KRAS 的超级无应答者（super non-responder)证据还很少。
[0007] 在通过KRAS的基因诊断来进行的EGFR抑制剂治疗方面，存在如下3个与来自受 试者的样品和耐药性有关的问题。
[0008] 第一个问题是，在不进行外科切除的病例中，虽然在KRAS基因诊断中使用活检标 本，但其可靠性没有得到确认。另外，活检取材对于患者而言是侵袭性的，在切除原发灶后， 多数情况下无法再切除复发肿瘤。因此，人们期待一种可替代直接检查肿瘤组织中的KRAS 状况（KRAS的基因型）的方法的可靠性高的诊断标志物。
[0009] 第二个问题是不局限于转移灶与原发灶中的变异状况一致的情况。
[0010] 渡边等人报告了 43例大肠癌患者中有15例为变异型患者，而原发灶与转移灶的 一致率为88. 4% (参见非专利文献3)。即，原发灶与转移灶的KRAS变异状况不一致的情 况约占一成。另一方面，S. Gattenlohner等报告了 EGFR抑制剂治疗中原发灶和转移灶的变 化。对21例转移性大肠癌患者在治疗前后的状况进行了研究，其结果是有20例（95.2%) 没有发生改变。发生变化的一例是异质性且为多发性病例（参见非专利文献4)。
[0011] 第三个问题是在EGFR抑制剂治疗中变异型克隆增加的可能性、即对EGFR抑制剂 的耐受性的获得。Diaz Jr等人在24例原发灶为野生型的大肠癌病例中，在开始进行EGFR 抑制剂治疗后，检测到血浆中DNA的突变KRAS基因。其结果是，报告了从9例病例（37. 5% ) 中检测到突变的KRAS基因，而且在全部病例中在投药后至少第26周以前都观察到变异，在 检测到细胞外DNA变异的同时或者在观察以后，获得了耐受性。进而，他们提出，通过以高 灵敏度检测到血清中突变的KRAS基因，能够推测获得了 EGFR抑制剂的耐受性，且可改换成 例如MEK抑制剂等其他药剂（参见非专利文献5)。另外，Misale等人还提出，通过以高灵 敏度检测血浆中的KRAS基因变异，可预测对EGFR抑制剂的敏感性，以及在检测到血浆中的 KRAS基因变异的情况下，可改换成除EGFR抑制剂以外的其他药剂（参见非专利文献6)。 艮P，在非专利文献5和6中记载了，通过利用在循环DNA中也会检测到受试者的转移灶中存 在的KRAS这一点，检查血液中的KRAS的状况。另外，还记载了由此可检查该转移灶对EGFR 抑制剂的敏感性且可预测在将EGFR抑制剂供给该受试者的情况下的有效性的内容。
[0012] 另一方面，作为癌症的耐药性问题的突破口，进行了与EGFR抑制剂的再给药相关 的临床试验。其确认了，在再给药EGFR抑制剂的情况下与不进行再给药相比，显著延长了 PFS (无进展生存期）。其想法是，在进行EGFR抑制剂治疗中，变异型克隆增殖，获得肿瘤对 上述EGFR抑制剂的耐受性，但通过改换成其他治疗方法以使其变异型克隆相对减少，并在 此时再给药EGFR抑制剂，由此再次奏效。实际上，进行了如下再给药的前瞻性研究，即在西 妥昔单抗对人的肿瘤患者的有效性降低时，使用其他疗法进行一定时期的治疗，随后再使 用西妥昔单抗进行治疗，对此D Santini等人报告了中间过程（参见非专利文献7)。在该 报告中，在KRAS野生型患者的首选治疗（first line therapy)中给药西妥昔单抗，并在有 效性降低时改换为其他抗癌治疗方法（例如，XEL0X、F0LF0X等化疗方法等），经过一定时间 后，再给药西妥昔单抗。在该前瞻性试验中，只有KRAS野生型患者的PFS得到延长，并确认 有显著的延长寿命的效果。
[0013] 现有技术文献
[0014] 专利文献：
[0015] 专利文献1 :美国专利第4943533号说明书。
[0016] 非专利文献 1 :Cutsem，et. al.，The New England Journal of Medicine，2009， vol. 360, pp.1408 - 1417 ;
[0017] 非专利文献 2 :Bokemeyer，et. al.，Annals of Oncology，2011，vol. 22 (7)， pp. 1535 - 1546 ；
[0018] 非专利文献 3 :Watanabe，et. al.，Diseases of the Colon and Rect，2011， vol. 54,pp.1170 - 1178；
[0019] 非专利文献4 :Gattenlohner，et. al.，New England Journal of Medicine，2009， vol. 360 (8), pp. 835；
[0020] 非专利文献 5 :Diaz Jr，et. al.，Nature，2012, vol. 486, pp. 537 - 540；
[0021] 非专利文献 6 :Misale，et.al.，Nature，2012, vol.486(7404)，pp.532 - 536 ;
[0022] 非专利文献 7 :Santini，et. al.，Annals of Oncology，2012, vol. 23, pp. 2313 - 2318〇
【发明内容】
[0023] 发明要解决的课题
[0024] 本发明涉及一种预测方法，其中，不论该患者的肿瘤组织中的KRAS的状况如何， 以该患者的外周血（末梢血液）中的KRAS的状况作为指标，预测EGFR介导性肿瘤（癌） 的患者对EGFR抑制剂的敏感性。
[0025] 解决课题的方法
[0026] 为了解决上述课题，本发明人等进行了精心研究。其结果发现，在EGFR介导性肿 瘤（癌）的患者中，存在肿瘤组织中的KRAS的状况和外周血中的KRAS的状况不一致的情 况，而且，对于在肿瘤组织中没有检测到KRAS的变异型而在外周血中检测到变异型KRAS的 患者而言，EGFR抑制剂的有效性低，从而完成了本发明。
[0027] 本发明的第一方面的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，包括：(a)确定工序，该工 序用以确定从受试者中采集的血液样品中是否存在KRAS基因来源的核酸或其蛋白质，以 及确定该血液样品中的上述KRAS基因来源的核酸或其蛋白质是野生型还是变异型；以及， (b)判断工序，在上述工序（a)中，若在上述血液样品中检测到野生型KRAS基因来源的核酸 或其蛋白质而没有检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质，则判断上述受试者的 肿瘤对EGFR抑制剂敏感的可能性高，若在上述血液样品中检测到变异型KRAS基因来源的 核酸或其蛋白质，则判断上述受试者的肿瘤对EGFR抑制剂不敏感的可能性高。
[0028] 在上述第一方面中，即使在从上述受试者的肿瘤采集的组织标本或细胞标本中检 测到KRAS基因来源的核酸或其蛋白质与从上述血液样品中检测到的上述KRAS基因来源的 核酸或其蛋白质的基因型不同的情况下，在上述工序（b)中，若从上述受试者中采集的上 述血液样品中检测到上述变异型的KRAS基因来源的核酸或其蛋白质，则也可判断上述受 试者的上述肿瘤对EGF