。各 PCR 产物的长度为 214bp，PCR 条件是 在95°C下进行10分钟的预变性后，以94°C下20秒、60°C下20秒、72°C下30秒作为一个 循环而进行40个循环，随后在72°C温度进行10分钟的延伸反应。对序列分析而言，使用 ABI3730(应用生物系统（Applied Biosystems)公司，福斯特城，加利福尼亚，美国（Foster City, CA))，采用终止物标记法（Big Dye Terminator)进行循环测序。将结果示于表5中。 表5的"血清"一栏中，基因型的词尾的"（术前）"和"（术后）"分别是指原发灶（仅16号 样品为转移灶）的外科切除手术之前或之后所采集的血清中的基因型。另外，表5的"转移 灶"一栏中，"一"是指没有对转移灶中的KRAS的基因型进行分析。
[0113] 表 5
[0114]
[0115] 原发灶的手术样品的KRAS基因变异（密码子12、13)与cfDNA中的KRAS基因变 异的一致率为81. 8%。另外，表6中示出了原发灶与cfDNA中的KRAS基因变异的相关表。 在表6中，"pDNA"是指从原发灶提取的DNA。对于科恩（Cohen)的Kappa系数k的计算而 言，根据P(-致率）、Pe (两个样品之间在结果偶然一致时的一致率）并套用k= (P-Pe)/ (1-Pe)时，k值为 〇? 58。
[0116] 表 6
[0117]
[0118] 值得特别提及的一点是，从原发灶和转移灶为野生型的ID编号8和ID编号14的 患者的cfDNA中检测到G13D(第13个甘氨酸替换为天冬氨酸的KRAS蛋白质）。进而，即 使对ID编号8的患者给药作为EGFR抑制剂的西妥昔单抗，也没有观察到肿瘤缩小的效果。 该结果显示出，肿瘤组织的KRAS的基因变异状况未必成为EGFR抑制剂的治疗效果的预测 因子。另一方面，
[0119] 根据CT成像结果，ID编号14的患者的肿瘤缩小了 20%以上。此外，肿瘤缩小率 (缩小效果）是根据CT图像的肿瘤的直径来求出。在肿瘤散布于各处的情况下，对它们的 直径进行合计来求出。
[0120] 另外，从ID编号9的患者的原发灶切除手术前的循环DNA中相应地观察到了与原 发灶相同的KRAS基因变异（G12A)，而在原发灶切除手术后的循环DNA中未检测到G12A。 此外，该患者的预后（prognosis)良好。由此可见，能够通过从血清或血衆中的cfDNA中检 测KRAS基因变异来应用于癌症患者的预后或复发诊断中。另外，在作为癌症标志物的CEA、 CA-19-9发生响应之前，通过观察外周血中的cDNA，也可用于早期诊断。
[0121] 此外，在实施例1中的复发大肠癌患者的临床分析中，在原发灶中观测到了突变 的KRAS基因的全部患者中，从复发诊断时所采集的血清中也观测到了突变的KRAS基因。根 据这一结果，在原发灶切除后的复发诊断中，针对循环中突变的KRAS基因进行鉴定是有用 的，而且对于接受过原发灶治疗的受试者而言，通过随时间推移地检查其血液中的KRAS的 状况，能够早期确认复发肿瘤的存在（在一些患者中会早于CEA、CA-19-9等现有的生物标 志物）。
[0122] 另外，对于KRAS的密码子61而言，针对KRAS密码子12、13在原发组织和血清中是 野生型的样品再次进行了检查，结果在6号、14号样本中检测到Q61H，在12号样本中检测 至lj Q61R。6号、14号样品属于相同的患者，并且在收集14号样品后，转变为F>D (Progression Disease，疾病进展）。由此可知，血清中的密码子61的KRAS基因变异也成为抗EGFR抗体 药的治疗效果的预测因子。
[0123] 工业实用性
[0124] 本发明的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法使用了外周血样品。因此，不需要切除 原发灶或者进行活组织检查等的活检取材，并且能够以微侵袭方式来预测对EGFR抑制剂 的敏感性，进而以高精度预测EGFR抑制剂的作用效果。从这种微侵袭性和良好精度的观点 出发，认为本发明的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法会作为替代大便潜血等检查方法在 癌筛查等方面广泛普及。
【主权项】
1. 一种EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，其包括： (a) 确定工序，该工序用以确定从受试者中采集的血液样品中是否存在KRAS基因来源 的核酸或其蛋白质，以及确定该血液样品中的所述KRAS基因来源的核酸或其蛋白质是野 生型还是变异型；以及， (b) 判断工序，在所述工序（a)中，若在所述血液样品中检测到野生型KRAS基因来源的 核酸或其蛋白质而没有检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质，则判断所述受试 者的肿瘤对EGFR抑制剂敏感的可能性高，若在所述血液样品中检测到变异型KRAS基因来 源的核酸或其蛋白质，则判断所述受试者的肿瘤对EGFR抑制剂不敏感的可能性高。2. 如权利要求1所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中， 即使在从采自所述受试者的肿瘤的组织标本或细胞标本中检测的KRAS基因来源的核 酸或其蛋白质，与从所述血液样品中检测到的所述KRAS基因来源的核酸或其蛋白质的基 因型不同的情况下， 在所述工序（b)中，若从所述受试者中采集的所述血液样品中检测到所述变异型KRAS 基因来源的核酸或其蛋白质，则判断所述受试者的所述肿瘤对EGFR抑制剂不敏感的可能 性大。3. 如权利要求1或2所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述受试者在过 去曾接受过肿瘤部分的外科切除治疗。4. 如权利要求1~3中任一项所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述受 试者在过去曾被给药过EGFR抑制剂。5. 如权利要求4所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述受试者在过去表 现出对所述EGFR抑制剂的耐药性。6. 如权利要求4或5所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述血液样品是 从给药所述EGFR抑制剂后经过60天的受试者中所采集的血液样品。7. 如权利要求1或2所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中， 所述受试者是，在接受过EGFR抑制剂的给药治疗后，接受了与该EGFR抑制剂给药治疗 不同的其他抗肿瘤疗法的肿瘤患者， 所述血液样品是所述肿瘤患者在要再次接受所述EGFR抑制剂给药治疗之前所采集的 样品。8. 如权利要求7所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述其他抗肿瘤疗法 是化疗药物的给药治疗。9. 如权利要求8所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述化疗药物是选自 于由氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂、伊立替康、阿糖胞苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨 蝶呤、博莱霉素、苯丁酸氮芥、顺钼、环磷酰胺、阿霉素、米托蒽醌、喜树碱、托泊替康、替尼泊 苷、秋水仙胺、秋水仙碱、紫杉醇、长春碱、长春新碱以及他莫昔芬所组成的组中的一种或两 种以上。10. 如权利要求7所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述其他抗肿瘤疗法 是放射线治疗。11. 如权利要求7所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述其他抗肿瘤疗法 是与已给药于所述受试者的EGFR抑制剂不同种类的分子靶向药物的给药治疗。12.如权利要求11所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述分子靶向药物 是选自于由西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、吉非替尼、厄洛替尼、瑞格非尼、克唑替尼、舒 尼替尼、索拉非尼、依维莫司、曲妥单抗、拉帕替尼以及利妥昔单抗所组成的组中的一种或 两种以上。13.如权利要求11或12所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述其他抗肿 瘤疗法是所述分子靶向药物的给药治疗和化疗药物的给药治疗的联合疗法。14.如权利要求1~13中任一项所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述 肿瘤是复发性肿瘤。15.如权利要求1~13中任一项所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述 肿瘤是转移灶。16.如权利要求1~12中任一项所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述 肿瘤是原发灶。17.如权利要求1~16中任一项所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述 肿瘤是选自于由大肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、食道 癌、头颈部癌、子宫癌以及子宫颈癌所组成的组中的一种或两种以上。18.如权利要求1~17中任一项所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述 肿瘤存在于所述受试者体内的多个位置。19.如权利要求1~18中任一项所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述 变异型是选自于由KRAS蛋白质的G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、G13D、G12S2、G13A、 G13S、G13V、G13R、G13C、Q61H、Q61L、Q61R、A146T以及A146V所组成的组中的一种或两种以 上。20.如权利要求1~19中任一项所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，通过 检查是否从所述血液样品中的循环DNA中检测到野生型KRAS基因来源的核酸以及是否检 测到变异型KRAS基因来源的核酸，从而确定所述血液样品中是否存在KRAS以及确定其是 野生型还是变异型。21.如权利要求1~20中任一项所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述 血液样品是外周血、血清、血浆。22.如权利要求1~21中任一项所述的EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其中，所述 血液样品中的CEA是5ng/mL以下，或者所述血液样品中的CA19-9的值是37. OU/mL以下。
【专利摘要】本发明涉及一种EGFR抑制剂的敏感性的预测方法，其包括：(a)确定工序，该工序用以确定从受试者中采集的血液样品中是否存在KRAS基因来源的核酸或其蛋白质，以及确定该血液样品中的上述KRAS基因来源的核酸或其蛋白质是野生型还是变异型；以及，(b)判断工序，在上述工序(a)中，若在上述血液样品中检测到野生型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质而没有检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质，则判断上述受试者的肿瘤对EGFR抑制剂敏感的可能性高，若在上述血液样品中检测到变异型KRAS基因来源的核酸或其蛋白质，则判断上述受试者的肿瘤对EGFR抑制剂不敏感的可能性高。
【IPC分类】C12N15/09, C12Q1/68, G01N33/574
【公开号】CN105074009
【申请号】CN201480017000
【发明人】北野史朗, 山田岳史
【申请人】凸版印刷株式会社
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2014年3月19日
【公告号】WO2014148557A1