br>[0080] 对上述探针而言，使用例如放射性同位素（3H、32P、 33P等）、荧光剂（罗丹明、荧光素 等）或发色剂以可检测到的方式进行标记。另外，该探针可以是反义低聚物，例如PNA、吗啉 代磷酰胺（morpholino phosphoroamidate)类或LNA。此外，该探针的碱基长度可以是约8 至约100个核苷酸或者约10至75个核苷酸、或者约15至约50个核苷酸、或者约20至约 30个核苷酸。
[0081 ] 对于血液样品中的KRAS的存在及其状况，能够使用侵入法（Michael Olivier, Mutation Research 573:103-110,2005)进行分析。所谓侵入法，是指针对通过 PCR等制备的双链DNA或mRNA以使其部分形成三碱基（triple base)的方式进行等位基因 探针和侵入寡核苷酸（invader oligo)的杂交。此时，等位基因探针的5'末端的一部分被 设计成具有不与上述双链DNA、mRNA互补的序列（翼部（flap part))。另一方面，侵入寡 核苷酸则具有完全与它们互补的序列。两种等位基因探针，被设计成分别对野生型、变异型 互补的探针，且在对上述双链DNA、mRNA进行竞争性杂交、以完全互补的方式进行杂交时， 侧翼核酸内切酶对一部分成为三碱基的部位进行识别，且等位基因探针的翼部与存在于同 一反应体系中的自身互补型FRET基座（FRET cassette、检测用DNA基质）进行杂交。
[0082] 此时，形成了上述一部分成为三碱基的部位，侧翼核酸内切酶对目标突变进行切 断，且FRET基座内被荧光修饰过的DNA片段发生游离并由于其与FRET内的光猝灭物质分 离而发出荧光。理论上，这是一种能够高灵敏度检测突变的方法，其中，被切断了一次的等 位基因探针的翼部，还能够再次与其他的FRET基座进行杂交，使信号增幅。
[0083] 为了扩增含有针对KRAS基因中变异部位进行编码的区域的片段，能够使用该领 域中所周知的连接酶链反应（例如，参见Wu，et. al.，Genomics，1989, vol. 4,pp. 560-569)。 另外，也能够使用称为等位基因特异性PCR技术（例如，参见Ruano and Kidd，Nucleic Acids Research，1989，vol.l7，pp. 8392)。基于该技术，使用与特定的KRAS突变在其3'末 端进行杂交的引物。在不存在特定的KRAS突变的情况下，观察不到扩增产物。另外，也能够 使用扩增阻滞突变系统（Amplification Refractory Mutation System(ARMS))(例如，参 见欧洲专利申请公开第 0332435 号以及"Newton et.al.，Nucleic Acids Research，1989， vol. 17, pp. 7"）。
[0084] 为了检测血液样品中的KRAS基因来源的核酸、确定所检测的KRAS基因来源的核 酸的基因型，也能够使用在检测基因变异、检测基因的插入以及缺失的情况下所使用的其 他方法。作为该方法，具体而言，例如，可举出：使用基于桑格法的序列分析方法，直接确定 血液样品中的KRAS基因的基因组DNA或mRNA、或者它们的扩增产物等的碱基序列的方法。 另外，也能够通过PCR来确定碱基序列。此外，能够将相对于基因或周围的标记基因的限制 性片段长度多态性（RFLP)探针用于针对多态性片段中的等位基因的改变或插入进行比分 评价。另外，还能够将单链DNA构象多态性（SSCP)分析用于检测等位基因的碱基变化突变 体（"Orita et. al.，Proceedings of the National Academy of Sciences，USA，1989， vol. 86, pp. 2766-2770" 以及 "Genomics，1989, vol. 5, pp. 874-879"）〇
[0085] 此外，通过将检测血液样品中的KRAS基因来源的核酸、确定所检测的KRAS基因来 源的核酸的基因型时所使用的试剂等制成试剂盒，能够更简便地实施本发明的敏感性预测 方法。作为该试剂，例如，可举出：用来从血液样品中提取核酸的试剂、聚合酶或连接酶等 酶，可特异性地与KRAS的特定基因型进行杂交的探针、引物（与KRAS基因突变的部位或 其相邻部位进行特异性杂交的寡核苷酸）。另外，在该试剂盒中，也可包括：有关从血液样 品中检测KRAS基因来源的核酸、确定其基因型的方法的实验方案，记载有关根据所得到的 KRAS基因型（状况）的结果来判断EGFR抑制剂敏感性的标准的说明文件。
[0086] 本发明的敏感性预测方法可在判断是否适用EGFR抑制剂的给药治疗时提供重要 信息。即，本发明的敏感性的预测方法能够为临床医生提供有用的信息；而且，基于由该方 法得到的信息，临床医生能够确定合适的治疗方法。
[0087] 实施例
[0088] 下面，通过举出实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不局限于下述实施例。
[0089] [实施例1]
[0090] 对于外科切除了原发灶的23名复发性大肠癌患者而言，针对从原发灶、转移灶以 及转移灶被确认后所采集血液中制备的血清中含有的KRAS，检查了伴随非同义氨基酸置换 的突变。
[0091] (临床样品）
[0092] 在原发灶的外科切除手术之前或之后，采集复发性大肠癌患者的外周血6mL，随后 进行离心处理（3000rpm，10分钟）得到血清。另外，对于ID编号9的患者，在转移灶的外 科切除手术之后，也采集其外周血6mL，以相同方式得到血清成分（16号样品（样品编号 16))。另外，也将一部分患者的原发灶、转移灶的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE)切片作为 实验样品。此外，本试验的实施得到日本医科大学附属医院内的伦理审查委员会的批准，并 获得了全部患者的包含本研究在内的知情同意书。将有关本实验的患者信息示于表2中。 在表2中，"转移灶"一栏的"一"是指确认有转移灶之前的患者。另外，表2中"西妥昔单 抗" 一栏的"有"是指在转移灶的外科切除手术之后（其中，对8号样品和11号样品而言， 是指原发灶的外科切除手术之前）进行了西妥昔单抗的给药治疗，而同一栏中的"无"是指 没有进行同样的给药治疗。表2中，"化疗"一栏示出了在转移灶的外科切除手术后进行西 妥昔单抗给药治疗的时间点（其中，在20号和21号样品中是原发灶的外科切除手术后进 行西妥昔单抗给药治疗的时间点，而在16号样品中是采集血液样品的时间点）实施化疗的 情况。进一步详细而言，"无"是指未决定给药但以后有可能给药的患者，"实施前"是指预 定实施，"实施中"是指化疗奏效且继续给药的状态，"实施后"是指化疗奏效但在该时间点 停止给药，"结束后"是指化疗不再奏效的状态（即，进入姑息护理的状态）。
[0093] 表 2
[0094]
[0095] 对原发灶为KRAS野生型的ID编号8和ID编号15的患者进行抗EGFR抗体药物 治疗。同时，在切除原发灶之前进行抗EGFR抗体药物治疗之后，切除了原发灶。对ID编 号8的患者进行西妥昔单抗给药治疗和F0LF0X化疗（氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂）。对 于西妥昔单抗而言，采用间隔两周给药法进行给药，以780mg/body (个体）经1小时进行 静脉滴注给药。对于F0LF0X化疗而言，经2小时进行静脉滴注给药300mg/body的亚叶酸 (Leucovorin :甲酰四氢叶酸）和125mg/body的奥沙利钼，而对于氟尿啼啶（5-FU)而言，在 快速静脉滴注给药625或500mg/body后，再以3800mg/body进行了 22小时的持续静脉滴 注给药。将给药记录示于表3中。
[0096] 表 3
[0097] 患者ID. 8的EGFR抑制剂治疗 单位：mg/body (个体）
[0098]
[0099] 对ID编号15的患者进行帕尼单抗或西妥昔单抗的给药治疗和F0LF0X化疗（氟尿 嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂）。帕尼单抗或西妥昔单抗是通过间隔两周给药法进行给药，经1小 时进行静脉滴注给药360mg/body的帕尼单抗或800mg/body的西妥昔单抗。对于F0LF0X化 疗而言，经2小时静脉滴注给药350mg/body的亚叶酸（Leucovorin)和145或140mg/body 的奥沙利铂，而对于氟尿嘧啶（5-FU)而言，在快速静脉滴注给药675或650mg/body后，再 以22小时进行了 4110mg/body的持续静脉滴注给药。将给药记录示于表4中。
[0100] 表 4
[0101] 患者ID. 15的EGFR抑制剂治疗 单位：mg/body
[0102]
[0103] (血清中的CEA和CA-19-9的测定）
[0104] 通过CLEIA法（化学发光酶联免疫分析法）对血清中的CEA以及CA-19-9进行测 定。将测定结果示于表5中。
[0105] (从血清中分离和纯化无细胞（cf)DNA)
[0106] 使用QIAamp循环核酸试剂盒（凯杰（Qiagen)公司）从血清中分离和纯化cfDNA。 提供给本试剂盒的血清样品量为2mL~4mL，因患者而异。DNA的分离和纯化工序依照试剂 盒中附带的说明书进行。使用50 y L的TE缓冲液从旋转柱中进行最终洗脱。
[0107] (从FFPE切片中分离和纯化DNA)
[0108] 使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒（凯杰公司）从FFPE切片中分离和纯化DNA。 每一个样品使用3片被切成10 y m薄片的FFPE切片。DNA的分离和纯化工序依照试剂盒中 附带的说明书进行。使用100 y L的TE缓冲液从旋转柱中进行最终洗脱。
[0109] (DNA 的定量）
[0110] 使用Quant-iT (注册商标）PicoGreen (注册商标）dsDNA定量试剂和试剂盒（英 杰（Invitorogen)公司）对从cfDNA和从FFPE切片中分离纯化的DNA进行了定量。测定 用的样品全部用TE缓冲液将所分离的DNA稀释至20倍而成的样品。荧光测定装置使用了 SAFIRA(TECAN 社）。
[0111] (直接测序）
[0112] 使用直接测序法进行原发灶、转移灶的手术样品以及血清中 的KRAS碱基序列分析。作为KRAS直接测序用的引物序列，使用KRAS (正 向）：5，-GAATGGTCCTGCACCAGTAA-3，（序列号 5)、KRAS(反向）： 5' -GTGTGACATGITCTAATATAGTCA-3'（序列号 6)