预测对egfr抑制剂的响应的制作方法
【专利说明】预测对EGFR抑制剂的响应 发明领域
[0001] -般而言，本发明涉及与对EGFR抑制剂的响应性有关的遗传变异。
[0002] 发明背景
[0003] 丝氨酸/苏氨酸激酶LKB1首次是作为家族性癌症综合征波伊茨-耶格综合征 (Peutz-Jegherssyndrome)中突变的基因鉴定的（Hemminkietal.，1998,Nature, 391:184-187)。 随后，在多种散发性癌症（包括多达30 %的非小细胞肺癌（NSCLC))中找到LKB1中的体细胞突 变（Sanchez-Cespedes, 2007,Oncogene, 26:7825-7832)。LKB1 作为肿瘤阻抑物的分子功能仍然是 未知的。
[0004] 类似地，长期以来已经将表皮生长因子受体（EGFR)中的突变与许多类型的癌症 (包括肺）联系起来（Pastorinoetal.，1993,J.Cell.Biochem.Suppl.，17F:237-248) 〇 已经开发出许多靶向EGFR的药物，并且在临床上成功用于治疗数种类型的癌症，包括 厄洛替尼（Tarceva?，在2004年得到批准）、吉非替尼（Iressa?，2003年）、帕尼单 抗（Vectibix?, 2006年）和西妥昔单抗（Erbitux?，2004年）。然而，经常产生对这 些治疗的继发性抗性（Weietal.，2011，AnticancerDrugs, 22:963-970;Bruggerand Thomas, 2012,LungCancer, 77:2-8)。虽然认为EGFR的活化性突变（EGFR-Mut+)预测对 EGFR靶向性疗法的响应性，但是它们是不充分的。此外，已经观察到在EGFR突变缺失下对 EGFR革巴向性疗法的响应性（PiperdiandPerez-Soler, 2012,Drugs, 72Suppl. 1:11-19)。这 些结果提示了需要能更好预测患者对EGFR靶向性疗法的响应的诊断学。
[0005] 数个小组已经报告了活化性EGFR突变和功能丧失性LKB1突变是互相 排他的（尽管这两者经常在肺癌和其它类型的癌症中观察到）；也就是说，若存 在一种突变，则另一种发生的可能性在统计学上比突变在患者群体内随机分配要 低(Reungwetwattanaetal.,2012,Clin.LungCancer, 13:252-266;Chitaleet al. , 2008,Oncogene, 28:2773-2783；Koivunenetal. , 2008,Br.J.Cancer, 455:245-252 ； Dingetal., 2008,Nature, 455:1069-1075)。这提示了它们可能牵涉相同的分子途径，并 且一种或另一种的突变足以使此途径脱调节（deregulate)，并且驱动肿瘤进展。
[0006] 发明概述
[0007] 在一些实施方案中，提供了用于预测癌症是否会响应EGFR抑制剂的方法。在一些 实施方案中，一种方法包括测定所述癌症是否包含LKB1突变，其中所述LKB1突变的存在指 示所述癌症会响应所述EGFR抑制剂。
[0008] 在一些实施方案中，提供了鉴定可能受益于EGFR抑制剂的癌症患者的方法。在一 些实施方案中，一种方法包括测定所述患者的癌症是否包含LKB1突变，其中所述LKB1突变 的存在指示所述癌症患者可能会受益于所述EGFR抑制剂。
[0009] 在一些实施方案中，提供了为癌症患者选择疗法的方法。在一些实施方案中，一种 方法包括（a)测定所述患者的癌症是否包含LKB1突变；并且（b)若所述患者的癌症包含 LKB1突变，则为所述疗法选择EGFR抑制剂。
[0010] 在一些实施方案中，提供了治疗哺乳动物中的癌症的方法。在一些实施方案中，一 种方法包括（a)测定所述癌症是否包含LKB1突变；并且（b)若所述癌症包含LKB1突变，则 对所述哺乳动物施用治疗有效量的EGFR抑制剂。
[0011] 在一些实施方案中，提供了治疗哺乳动物中包含LKB1突变的癌症的方法。在一些 实施方案中，一种方法包括对所述具有癌症的哺乳动物施用治疗有效量的EGFR抑制剂。在 一些实施方案中，在施用所述EGFR抑制剂前，所述癌症测定为包含LKB1突变。
[0012] 在本文中描述的任何实施方案中，所述癌症可以是实体瘤。在本文中描述的任何 实施方案中，所述癌症可以选自大细胞癌、类癌癌、神经内分泌起源的癌症、头和颈鳞状细 胞癌（HNSCC)、结肠直肠癌、宫颈癌、黑素瘤、皮肤癌、平滑肌瘤、胃癌、成胶质细胞瘤、卵巢 癌、小细胞肺癌（SCLC)、非小细胞肺癌（NSCLC)、胰腺癌、食道癌、胃癌和甲状腺癌。在本文 中描述的任何实施方案中，所述癌症可以选自肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、和头和颈癌。在本 文中描述的任何实施方案中，所述癌症可以是选自表2中组织的组织。
[0013] 在一些实施方案中，所述LKB1突变包含LKB1多核苷酸中的变异。在一些实施方 案中，所述LKB1多核苷酸中的变异在LKB1多核苷酸的编码序列中。在一些实施方案中，所 述LKB1多核苷酸中的变异包含至少一种选自插入、删除、倒位、和替代的变异。在一些实施 方案中，所述LKB1多核苷酸中的变异导致LKB1编码序列中的移码。在一些实施方案中，所 述LKB1多核苷酸中的变异是选自表1的核苷酸位置处的核苷酸变异，其导致（a)水平显著 降低或缺乏的LKB1蛋白质和/或（b)活性显著降低的LKB1蛋白质的表达。在一些实施方 案中，所述LKB1多核苷酸中的变异是选自表1的核苷酸变化。
[0014] 在一些实施方案中，所述LKB1多核苷酸中的变异导致LKB1多肽中的变异。在一 些实施方案中，所述LKB1多肽中的变异选自插入、替代、删除、和截短。在一些实施方案中， 所述LKB1多肽中的至少一处变异是选自表1的氨基酸位置处的氨基酸变异，其导致（a)水 平显著降低或缺乏的LKB1蛋白质和/或（b)活性显著降低的LKB1蛋白质的表达。在一些 实施方案中，所述LKB1多肽中的至少一处变异是选自表1的氨基酸变化。
[0015] 在本文中描述的任何实施方案中，所述哺乳动物可以是人。
[0016] 在本文中描述的任何实施方案中，所述EGFR抑制剂可以是结合EGFR的抗体。在 一些实施方案中，所述EGFR抑制剂选自西妥昔单抗、帕尼单抗、DL1If、和GA201。
[0017] 在本文中描述的任何实施方案中，所述EGFR抑制剂可以是小分子。在一些实施方 案中，所述EGFR抑制剂选自厄洛替尼或吉非替尼。
[0018] 这些和其它实施方案在下面的书面描述中有描述。
[0019] 附图简述
[0020] 图 1 显示了与NMPP1、EGF、NMPP1+EGF、NMPP1+EGF+ 厄洛替尼（Tarceva?)、或 NMPP1+FGF7+厄洛替尼(Taffie鄉⑩)一起温育的Lkblwt/mLkbl 小鼠胚胎无间充质肺组 织外植体的生长和分支，如实施例2中描述的。
[0021] 图 2 显示了与NMPP1、EGF、NMPP1+EGF、或NMPP1+EGF+ 厄洛替尼(Tarceva?)-起 温育的Lkblwt/mLkblM(;/M(：小鼠胚胎整装（wholemount)肺组织外植体的生长和分支，如 实施例2中描述的。
[0022] 图3A-B显示了⑷在NMPP1存在或缺失下LKBlwt/lPLKB1 肺中的EGFR水平， 和⑶在NMPP1存在下在有或无与EGF-起温育10分钟的情况中LKBlwt/wlPLKB1 肺 中的EGFR酪氨酸磷酸化，如实施例2中描述的。
[0023] 图4显示了与NMPP1、EGF、和NMPP1+EGF-起温育的LKB1MG/MG胰腺外植体中囊肿 表型的形成，如实施例2中描述的。
[0024] 图5显示了与EGF或EGF和NMPPI-起温育的Lkblwt/wlPLkb1 MG/MG胰腺外植体中 囊肿表型的形成，如实施例2中描述的。
[0025] 图6显示了与EGF和NMPPI，或与EGF、NMPPI、和厄洛替尼(Tarceva?)-起温育的 Lkbrt/w4P LkblMW胰腺外植体中囊肿表型的形成，如实施例2中描述的。
[0026] 发明详述
[0027]I?定义
[0028] 出于解读本说明书的目的，会应用下述定义，并且只要时机合适，以单数使用的术 语还会包括复数，且反之亦然。在下文列出的任何定义与通过提及收入本文中的任何文件 矛盾的情况中，会以下文列出的定义为准。
[0029] 除非另有定义，本文中使用的所有技术术语、符号和其它科学术语意图具有本发 明所属领域的技术人员通常理解的意义。在一些情况中，为了清楚和/或为了方便提及，在 本文中定义了具有通常理解意义的术语，并且本文中纳入此类定义不应必然解释为代表与 本领域中的一般理解的实质性差异。本文中描述或提及的技术和规程是本领域技术人员一 般充分了解并且使用常规方法，通常采用的。在适当时，一般依照制造商限定的方案和/或 参数实施牵涉使用商品化试剂盒和试剂的规程，除非另有注释。
[0030] 在描述本组合物和方法前，要理解本发明不限于描述的特定方法、方案、细胞系、 动物种或属、构建体、和试剂，因为它们当然可以变化。还要理解本文中使用的术语仅为了 描述具体的实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会以所附权利要求书限制。
[0031] 必须注意，如本文中和所附权利要求书中使用的，单数形式"一个"、"一种"和"所 述/该"包括复数，除非上下文另有明确叙述。
[0032] 贯穿本说明书和权利要求书，词语"包含"或变型（诸如"包括"）会理解为暗示包 括叙述的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。
[0033] 术语"多核苷酸"在以单数或复数使用时一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧 核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。如此，例如，本文中限定 的多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、包含单链和双链区的DNA、单链和双链RNA、和包 含单链和双链区的RNA、包含DNA和RNA的杂合分子，其可以是单链或更通常双链或者包含 单链和双链区。另外，如本文中使用的，术语"多核苷酸"指包含RNA或DNA或RNA和DNA两 者的三链区。此类区域中的链可以来自相同分子或来自不同分子。区域可以包含全部的一 个或多个分子，但是更通常仅牵涉一些分子的区域。三股螺旋区的分子之一常常是寡核苷 酸。术语"多核苷酸"明确包括cDNA。该术语包括含有一种或多种经修饰的碱基的DNA(包 括cDNA)和RNA。如此，具有出于稳定性或出于其它原因而修饰的主链的DNA或RNA是"多 核苷酸"，就像该术语在本文中的意图一样。此外，如本文中定义的，术语"多核苷酸"内包 括包含罕见碱基（诸如肌苷）或经修饰的碱基（诸如氚化碱基）的DNA或RNA。一般地，术 语"多核苷酸"涵盖未修饰的多核苷酸的所有化学、酶促和/或代谢修饰形式，及病毒和细 胞（包括简单和复杂细胞）特征性的DNA和RNA的化学形式。
[0034] 术语"寡核苷酸"指相对较短的多核苷酸，包括但不限于单链脱氧核糖核苷酸、单 链或双链核糖核苷酸、RNA:DNA杂合物和双链DNA。常常通过化学方法（例如使用商品化的 自动化寡核苷酸合成仪）合成寡核苷酸（诸如单链DNA探针寡核苷酸）。然而，可以通过多 种其它方法（包括体外重组DNA介导的技术和通过在细胞和生物体中表达DNA)生成寡核 苷酸。
[0035] 术语"引物"指能够与核酸杂交并且容许互补核酸聚合（一般通过提供游离的 3' -0H基团）的单链多核苷酸。
[0036] "HER受体"是一种受体蛋白质酪氨酸激酶，其属于HER受体家族，并且包括 EGFR(ErbBl，HER1)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)受体。HER受体一般会包 含胞外域（其可结合ffiR配体和/或与另一个ffiR受体分子二聚化）；亲脂性跨膜域；保守 的胞内酪氨酸激酶域；和含有数个能磷酸化的酪氨酸残基的羧基端信号传导域。ffiR受体 可以是天然存在的（"天然序列受体或其变体。优选地，ffiR受体是天然序列人ffiR 受体。
[0037] "HER途径"指由HER受体家族介导的信号传导网络。
[0038] 术语1洸81"、"册1?1"、"表皮生长因子受体"和16?1?"在本文中可互换使用， 并且指例如如Carpenteretal.，Ann.Rev.Biochem. 56:881-914(1987)中披露的EGFR， 包括其天然存在的突变体形式（例如如Ullrichetal.，Nature(1984) 309:418-425和 Humphreyetal.，PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中的删除突变体EGFR)，及其变体，诸 如EGFRvIII。EGFR变体还包括删除、替代和插入变体，例如那些记载于Lynchetal(New EnglandJournalofMedicine2004,350:2129),Paezetal(Science2004,304:1497), 及Paoetal(PNAS2004,101:13306)的。
[0039] 在本文中，"EGFR胞外域"或"EGFRE⑶"指EGFR中在细胞外部（锚定于细胞膜或在 循环中）的域，包括其片段。在一些实施方案中，EGFR的胞外域可以包含四种域："域I"（氨 基酸残基约1-158)、"域II"（氨基酸残基159-336)、"域III"（氨基酸残基337-470)、和 "域IV"（氨基酸残基471-645)，其中边界是大概的，并且可以相差约1-3个氨基酸。
[0040] "磷酸化"指对蛋白质（诸如EGFR受体）或其底物添加一个或多个磷酸基团。
[0041] 术语"丝氨酸/苏氨酸激酶11"、"STK11"、"肝激酶B1"、和"LKB1"可互换使用，并 且指来自任何脊椎动物来源（包括哺乳动物，诸如灵长类（例如人）和啮齿类（例如小鼠和 大鼠））的任何天然的LKB1蛋白质、编码序列、或基因，除非另有指示。该术语涵盖"全长" 未加工LKB1及源自天然加工的任何形式的LKB1。该术语还涵盖LKB1的天然存在变体，例如 剪接变体或等位变体。一种例示性人LKB1蛋白质的序列以Swiss-Prot登录号No.Q15831. 1 显示。一种例示性人LKB1编码序列的序列以GenBank登录号No.NM_000455. 4显示。例示 性遗传信息（包括基因位置、序列、和内含子/外显子边界）以NCBI基因ID6794显示。 SEQIDN0:1中显示了一种非限制性例示性LKB1编码序列。