专利名称：丹酚酸a在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属中药领域，涉及丹酚酸A的用途，尤其涉及丹酚酸A在制药中的应用。
背景技术：
肾脏纤维化，以肾小球硬化和肾小管间质纤维化为特征，是多种慢性肾脏疾病最终结局。本质上，肾纤维化是以细胞外基质的过度积聚和沉积为特征的过程。产生基质的细胞活化是肾纤维化形成的关键。生理情况下，成纤维细胞产生适量的胶原基质充填肾单位、血管和肾被膜之间的空隙。随年龄增长肾脏体积逐渐增大，成纤维细胞主要起肾间质重塑作用。当损伤及炎症因素持续存在时，成纤维细胞增殖并产生过量的细胞外基质。新合成的成纤维胶原成分在肾组织沉积。此外，肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞是主要的产生细胞外基质的细胞。肾纤维化早期，系膜细胞和纤维母细胞发生活化，晚期出现肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化。很多细胞因子可以促进肾脏成纤维细胞和系膜细胞的活化，加速肾脏纤维化的进程，其中以转化生长因子-P I (TGF-0 I)作用最强。目前，国外对肾脏纤维化的机制研究较为深入，但是尚无安全有效的治疗肾脏纤维化的药物，而我国在该领域研究活血化瘀中药的疗效取得了一定的成绩。丹参是唇型科植物丹参的干燥根和根茎，性苦，微寒，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神等功效。丹酚酸A是从丹参中提取的一类既有咖啡酞缩酚酸结构又有新木脂素骨架的水溶性成分，分子式为C26H22Oltl，分子量是494. 45，溶于甲醇、乙醇、水。具有很强的清除自由基和抗氧化作用，其在心脏保护、抗肿瘤等方面有着显著活性。近年来研究发现丹酚酸A还有保护肝细胞、抑制成纤维细胞增殖及抗肝纤维化的作用。刘成海等观察了丹酚酸A对大鼠肝星状细胞的影响，结果发现丹酚酸A能抑制肝星状细胞的增殖及其胶原生成率，对胶原合成的抑制可能是其抗肝纤维化的主要作用机理之一。王晓玲等观察了丹酚酸A对成纤维细胞增殖及胶原合成的影响，结果显示丹酚酸A能抑制成纤维细胞增殖及细胞内胶原合成，体外最佳作用浓度为10_6mol/l。王润平等观察了丹酚酸A对过氧化损伤肝细胞的作用，结果显示丹酚酸A呈浓度依赖性地降低损伤肝细胞显著升高的ALT (丙氨酸氨基转移酶)、AST (天冬氨酸转氨酶)、LDH (乳酸脱氢酶)和SOD (超氧化物歧化酶)活性，改善异常的AST/ALT比值。胡义扬等研究丹酚酸A的抗肝损伤、抗肝纤维化作用及其对I型胶原基因表达的影响，结果显示丹酚酸A可降低血清ALT、AST水平及肝组织Hyp (羟脯氨酸)含量，减轻肝纤维化程度，抑制I型胶原在基质中沉积。目前，对丹酚酸A在抑制肾成纤维细胞和系膜细胞活化中的作用、降低UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白(24h尿蛋白定量、a I-MG, NAG、^ 2_MG、TRF)、肾功能(Scr、BUN)、减轻肾脏炎症及胶原沉积中的作用及改善肾纤维化相关基因和蛋白(TGF-0 UCTGF,ColIagenIII、LN、Collagen I、FN)的作用尚未见相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供丹酚酸A的新用途，即丹酚酸A在制药中的新应用。为解决上述技术问题，在本发明的一方面，提供丹酚酸A在制备抑制肾成纤维细胞和系膜细胞活化的药物中的应用。所述丹酚酸A抑制TGF-P I诱导的肾成纤维细胞和系膜细胞活化的有效浓度为4. 94X 10_5g/ml 4. 94X 10_6g/ml。在本发明的另一方面，提供丹酚酸A在制备降低肾纤维化的药物中的应用。所述丹酹酸A降低肾纤维化的有效剂量为10mg/kg/d或17. lmg/kg/d。在本发明的另一方面，提供丹酚酸A在制备改善尿蛋白的药物中的应用。所述改善尿蛋白包括改善24h尿蛋白定量、a I-MG, NAG, ^ 2_MG、TRF。在本发明的另一方面，提供丹酚酸A在制备改善肾功能的药物中的应用。所述改善肾功能包括改善肾功能Scr、BUN。
在本发明的另一方面，提供丹酚酸A在制备减轻肾脏炎症及胶原沉积的药物中的应用。在本发明的另一方面，提供丹酚酸A在制备改善肾脏纤维化相关基因和蛋白的药物中的应用。所述改善肾脏纤维化相关基因和蛋白包括改善纤维化相关基因和蛋白TGF-P I、CTGF、Collagen III、LN、Collagen I、FN。本发明以TGF-P I为刺激因子，在体外用MTT法观察不同浓度梯度的丹酚酸A对TGF-Pl刺激下大鼠肾成纤维细胞和系膜细胞活化的作用，并在体内观察其对UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白、肾功能以及肾脏纤维化相关基因和蛋白的影响。本发明设计了以TGF-P I诱导的大鼠肾成纤维细胞和系膜细胞活化的筛选平台，观察各浓度梯度的丹酚酸A对大鼠肾成纤维细胞和系膜细胞活化的抑制作用及有效工作浓度。结果显示浓度为4. 94 X 10 Vml 4. 94 X 10 Vml的丹酚酸A可抑制TGF-P I诱导的大鼠肾成纤维细胞和系膜细胞活化，两个浓度作用效果之间无统计学差异。此外，本发明设计了丹酚酸A对大鼠肾纤维化作用的体内实验，观察丹酹酸A中剂量(10mg/kg/d)及高剂量(17. lmg/kg/d)对UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白、肾功能以及肾脏纤维化相关基因和蛋白的影响，结果中剂量(10mg/kg/d)及高剂量(17. lmg/kg/d)的丹酚酸A均能降低UUO模型和Platt模型大鼠尿蛋白、肾功能以及肾脏纤维化相关基因和蛋白。从而本发明从体内体外实验验证了丹酚酸A能抑制肾成纤维细胞和系膜细胞活化，降低肾纤维化大鼠尿蛋白、肾功能以及肾脏纤维化相关基因和蛋白，即本发明验证了丹酚酸A可用于制备降低肾纤维化的药物。
图I-图6是试验例2中丹酚酸A在UUO模型大鼠肾脏炎症及胶原沉积研究中光镜下肾组织结构示意图；其中，图I-图3为HE染色(100 X )，图I代表A组，图2代表B组，图3代表C组；图4-图6为Masson染色(100X)，图4代表A组，图5代表B组，图6代表C组。图7-图14是试验例2中丹酚酸A在Platt模型大鼠肾脏炎症及胶原沉积研究中光镜下肾组织结构示意图；其中，图7-图10为HE染色(100X)，图7代表A组，图8代表B组，图9代表C组，图10代表D组；图11-图14为Masson染色(100X)，图11代表A组，图12代表B组，图13代表C组，图14代表D组。具体实施 方式以下通过试验例对本发明丹酚酸A的药理活性试验及结果作进一步的阐述试验例I体外实验一、材料与方法(一 )材料实验细胞正常大鼠肾脏成纤维细胞株(NRK-49F)和系膜细胞株(HBZY-I)，均购自上海复盟基因生物科技有限公司。丹酚酸A购自上海融禾医药科技发展有限公司，批号110420 ； TGF-^ I生长因子购自P印roTech公司，产品编号:100_21C。胎牛血清，产品编号S1840-500 ;DMEM高糖培养基，产品编号LOl 103-500 ；
0.25%胰蛋白酶-0. 02%乙二胺四乙酸，产品编号L0932-500 ;青霉素-链霉素产品编号03-050-1B ;以上均购自Biowest公司。MTT粉末，化学名为3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5- 二苯基溴化四唑,购自Amresco公司，产品编号0793。( 二 )方法I.实验步骤I. I MTT法先用 0. 25%胰蛋白酶-0. 02% 乙二胺四乙酸(TrypsinO. 25%-0. 02%EDTA)消化NRK-49F和HBZY-I细胞株，再用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔I X 104/ml个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100 yl。待细胞贴壁后，吸去培养板中的培养液，每孔加入无血清的DMEM培养液100 iil，置37°C、5%的CO2孵箱中孵育24h，使细胞生长同步化。之后加入TGF- ^ I生长因子和丹酚酸A，24h后每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 10 u 1，37°C继续孵育4h，终止培养，小心吸去孔内培养上清液(尽量洗净残留的培养液)。每孔加入IOOiU DMSO (二甲基亚砜)，振荡lOmin，使针状结晶充分溶解。选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值(0D值)。I. 2 ELISA法先用0. 25 %胰蛋白酶-0. 02 %乙二胺四乙酸(TrypsinO. 25% -0. 02% EDTA)消化NRK-49F和HBZY-I细胞株，再用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔I X 104/ml个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积IOOu I0待细胞贴壁后，吸去培养板中的培养液，每孔加入无血清的DMEM培养液100 yl，置37°C、5%的CO2孵箱中孵育24h，使细胞生长同步化。之后加入TGF-P I生长因子和丹酚酸A，收集24h细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作。2.实验分组2. I观察NRK-49F细胞株分7组，每组设5个复孔，分组如下A 组(空白对照组)、B 组(TGF- P I 2ng/ml 组)、C 组(TGF- P I 5ng/ml 组)、D 组(TGF- P 12ng/ml+ 丹酚酸 A 4. 94 X l(T5g/ml 组)、E 组(TGF- P I 2ng/ml+ 丹酚酸 A
4.94X 10 Vml 组)、F 组(TGF- ^ I 5ng/ml+ 丹酚酸 A 4. 94X l(T5g/ml 组)、G 组(TGF- ^ I5ng/ml+丹酚酸A4. 94 X 10 Vml组)。B组和C组为模型组。2. 2观察HBZY-I细胞株分4组，每组设6个复孔，分组如下A 组(空白对照组)、B 组(TGF- P I 2ng/ml 组)、C 组(TGF- P I 2ng/ml+ 丹酚酸A 4. 94X l(T5g/ml 组)、D 组(TGF- ^ I 2ng/ml+ 丹酚酸 A 4. 94 X 10 Vml 组)。B 组为模型组。
3.观察指标
3. I采用MTT法观察24h丹酚酸A对两种细胞株的作用。3. 2采用ELISA法观察细胞上清液中TGF- ^的分泌情况。二、结果I.丹酚酸A能抑制活化的大鼠成纤维细胞株(NRK-49F)的增殖空白对照组NRK-49F的OD值为0. 355±0. 034，加入TGF-P I生长因子(2ng/ml和5ng/ml)NRK-49F的OD值为0. 508±0. 026和0. 457±0. 042，明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P < 0. 05)。说明TGF-P I生长因子可以促进NRK-49F的活化。丹酚酸A高剂量(4. 94Xl(T5g/ml)及中剂量(4. 94Xl(T6g/ml)组OD值分别为 0. 450±0. 019,0. 394±0. 010和 0. 389±0. 007,0. 389±0. 011，低于模型组(P < 0. 05 0. 01)(见表 I)。表I丹酚酸A对活化的大鼠成纤维细胞株(NRK-49F)的抑制作用(x±s)
M3]OD 值(24h)
空白对照组(A)0.355±0.034
+TGF-pi 2ng/ml (B)0.508±0.026 *
+TGF-PI 5ng/ml (C)0.457±0.042 *+TGF-Pl 2ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-5g/ml(D) 0.450±0.019#
+TGF-pi 2ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-6g/ml(E) 0.389±0.007#
+TGF-pi 5ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-5g/ml(F) 0.39牡0.010A
+TGF-pi 5ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-6g/ml(G) 0.389±0.011A注与A组比较，*P < 0. 05 ;与B组比较，#P < 0. 01 ;与C组比较，aP < 0. 05。2.丹酚酸A能抑制活化的大鼠系膜细胞株(HBZY-I)的增殖空白对照组HBZY-I的00值为0.204±0.018，加入丁6卩-3 1生长因子(2ng/ml)HBZY-I的OD值为0. 229±0. 019，明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P < 0. 05)。说明TGF-P I生长因子可以促进HBZY-I的活化。丹酚酸A高剂量(4. 94X10_5g/ml)及中剂量(4. 94X l(T6g/ml)组 OD 值分别为 0. 218±0. 020 和 0. 205±0. 013，低于模型组(P < 0. 05)(见表2)。表2丹酚酸A对活化的大鼠HBZY-I的抑制作用(x±s)
M3]OD 值(24h)
空白对照组(A)0.20牡0.018+TGF-pi 2ng/ml (B)0.229±0.019 *
+TGF-pi 2ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-5g/ml (C)0.218±0.020A
+TGF-pi 2ng/ml+丹酚酸 A4.94xl0-6g/ml (D)0.205±0.013A注与A组比较，*P < 0. 05 ;与B组比较，aP < 0. 05。3.丹酚酸A能抑制活化的大鼠成纤维细胞株(NRK-49F) TGF- ^的分泌
空白对照组NRK-49F 的 TGF- ^ 浓度为(15. 682 ± 2. 396) pg/ml，加入 TGF- ^ I生长因子(2ng/ml 和 5ng/ml)NRK-49F 的 TGF-^ 浓度为(122. 664 ±10. 397) pg/ml 和(401.252±31.856)pg/ml，明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P < 0. 01)。说明TGF-P I生长因子可以促进NRK-49F TGF-^的分泌。丹酚酸A高剂量(4. 94X 10_5g/ml)及中剂量(4.94X10_6g/ml)组 TGF-P 浓度分别为(84. 070±5. 726)pg/ml、(262. 198±24. 077)pg/ml 和(67. 894±10. 529)pg/ml, (200. 574±18. 181)pg/ml,低于模型组(P < 0. 05 0. 01)(见表 3)。表3丹酚酸A对活化的大鼠NRK-49F TGF- ^的分泌(x±s)
权利要求
1.丹酚酸A在制备抑制肾成纤维细胞和系膜细胞活化的药物中的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于，所述丹酚酸A抑制TGF-PI诱导的肾成纤维细胞和系膜细胞活化的有效浓度为4. 94X 10_5g/ml 4. 94X 10_6g/ml。
3.丹酚酸A在制备降低肾纤维化的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述丹酚酸A降低肾纤维化的有效剂量为10mg/kg/d 或 17. lmg/kg/cL
5.丹酚酸A在制备改善尿蛋白的药物中的应用，其特征在于，所述改善尿蛋白包括改善 24h 尿蛋白定量、a I-MG, NAG, P 2_MG、TRF。
6.丹酚酸A在制备改善肾功能的药物中的应用，其特征在于，所述改善肾功能包括改善肾功能Scr、BUN。
7.丹酚酸A在制备减轻肾脏炎症及胶原沉积的药物中的应用。
8.丹酚酸A在制备改善肾脏纤维化相关基因和蛋白的药物中的应用，其特征在于，所述改善肾脏纤维化相关基因和蛋白包括改善纤维化相关基因和蛋白TGF-P I、CTGF,Collagen III、LN、Collagen I、FN0
全文摘要
本发明公开了丹酚酸A在制药中的应用。涉及丹酚酸A在制备抑制肾成纤维细胞和系膜细胞活化的药物中的应用、在制备降低肾纤维化的药物中的应用、在制备改善尿蛋白的药物中的应用、制备改善肾功能的药物中的应用、在制备减轻肾脏炎症及胶原沉积的药物中的应用以及在制备减轻肾脏纤维化指标相关基因和蛋白的药物中的应用。本发明设计了以TGF-β1诱导的大鼠肾成纤维细胞和系膜细胞活化的筛选平台，发现4.94×10-5g/ml～4.94×10-6g/ml的丹酚酸A可抑制TGF-β1诱导的大鼠肾成纤维细胞和系膜细胞的活化。本发明还设计了丹酚酸A对UUO模型和Platt模型大鼠作用的体内实验，发现丹酚酸A中剂量(10mg/kg/d)及高剂量(17.1mg/kg/d)均能降低UUO模型和Platt模型大鼠的尿蛋白、肾功能以及肾脏纤维化相关基因和蛋白。
文档编号A61P13/12GK102614164SQ201210083120
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者何立群, 杨雪军, 林日阳, 王东, 王琛 申请人:上海中医药大学附属曙光医院