能够生产异源抗体的转基因非人动物的制作方法

专利名称：能够生产异源抗体的转基因非人动物的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够生产异源抗体的转基因非人动物、用于生产所述动物的转基因、能够以V-D-J重组功能性重排异源D基因的转基因、能够生产异源抗体的无限增殖化B细胞、用于生产多种同种型异源抗体的方法和转基因、用于生产异源抗体的方法和转基因(其中与种系重排的可变区序列相比，可变区序列含有体细胞突变)、生产具有人一级序列并与人抗原结合之抗体的转基因非人动物、从所述转基因动物B细胞制备的杂交瘤以及由所述杂交瘤表达的单克隆抗体。
背景技术：
发展单克隆抗体在人体中的体内治疗和诊断应用所面临的主要障碍是非人免疫球蛋白的内在免疫原性。例如，当给具有免疫能力的病人施用治疗剂量的啮齿类单克隆抗体时，病人产生抗啮齿类免疫球蛋白序列的抗体；这些人抗小鼠抗体(HAMA)中和了治疗抗体并会引起急性毒性。因此需要生产与特异性人抗原反应的人免疫球蛋白，所述抗原是预定的治疗和/或诊断靶。但是，生产与人抗原特异性结合的人免疫球蛋白还有很多问题。目前用于生产单克隆抗体的技术涉及用抗原预接触或引发动物(通常是大鼠或小鼠)、从所述动物中收集B细胞并产生杂交瘤克隆文库。通过筛选具有抗原结合特异性(个体型)的杂交瘤群并筛选免疫球蛋白类型(同种型)，可以筛选出分泌所需抗体的杂交瘤克隆。但是，当将现有生产单克隆抗体的技术用于生产具有人抗原结合特异性的人抗体时，获得生产人免疫球蛋白的B淋巴细胞则出现了严重的障碍，因为人通常对自身抗原不产生免疫反应。因此，现有生产能与人抗原特异性反应的人单克隆抗体的方法显然不适当。显然，当用非人品种作为制备杂交瘤的B细胞源时，对于生产抗真正自身抗原的单克隆抗体也有同样的限制。 构建含有功能性异源免疫球蛋白转基因的转基因动物是可以生产与自身抗原有反应性的抗体的一种方法。但为了表达有治疗用途的抗体或获得生产所述抗体的杂交瘤克隆，转基因动物必须产生能够通过B淋巴细胞发育途径成熟的转基因B细胞。所述成熟要求在转基因B细胞上存在表面IgM，但有治疗用途的只有不是IgM的同种型。因此，需要转基因和含所述转基因的动物，所述转基因通过功能性V-D-J重排可产生重组多样性和连接多样性。此外，所述转基因和转基因动物优选包含顺式作用序列，所述序列有利于从B细胞成熟所需的第一同种型转变成有良好治疗效用的同种型。已经报道了许多试验，这些试验利用转染的细胞系确定Ig基因重排所需的特异性DNA序列(见Lewis和Gellert (1989)，Cell，59，585-588中的综述)。所述报告鉴定了推测的序列并得出结论这些序列对重排所用重组酶的可接近性受转录调节(Yancopoulos Alt (1985), Cell，40，271-281)。报道认为 V(D) J 连接的序列是高度保守的接近回文的七聚体以及由12或23bp间隔序列分开的不太保守的富集AT的九聚体(nanomer)(Tonegawa(1983), Nature,,302,575-581 ;Hesse 等，(1989), Genes in Dev.,3,1053-1061)。报道说有效重组仅发生在含重组信号序列的位点之间，所述信号序列含有不同长度的间隔区。Ig基因重排，尽管在组织培养细胞中进行了研究，但在转基因小鼠中还未得到广泛地验证。只有很少的报告公开描述了导入到小鼠中的重排试验构建体[Buchini等，(l987)，Nature，326，409_411(未重排的鸡入转基因);Goodhart 等，(1987), Proc. Natl.Acad. Sci. USA，84，4229-4233(未重排的兔 k 基因)；和 fcuggemann 等，(1989), Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 86，6709-6713 (杂种小鼠-人重链)]。但这些试验的结果是不确定的，在一些情况下，发生了转基因的不完全或很少的重排。此外，抗体分子的各种生物学功能由分子的Fe部分产生，如通过Fe e与肥大细胞或嗜碱细胞相互作用、通过Fcy或Fe Y进行补体结合，还需要通过同种型的改变使具有给定特异性的抗体产生功能多样性。尽管已经有了带有编码异源抗体的一条或多条链的转基因的转基因动物，但尚未有成功地进行同种型转换的异源转基因的报道。不能转换同种型的转基因动物只能生产单一同种型异源抗体，更具体地说，只限于生产B细胞成熟所必需的同种型，如IgM和可能的IgD，因此只有有限的治疗应用。因此需要异源免疫球蛋白转基因和转基因动物，它们可将B细胞发育所需的同种型转换成具有治疗所需特征的同种型。基于上述原因，显然需要能够有效生产异源抗体，例如在第二个品种中生产由第一品种的遗传序列编码的抗体的方法。更具体地说，本领域需要异源免疫球蛋白转基因和转基因动物，它们能够进行掺入全部或部分D基因片段的功能性V-D-J基因重排，所述D基因片段是产生重组多样性的原因。此外，本领域还需要可支持V-D-J重组和同种型转换的转基因和转基因动物，以便(I)功能性B细胞可发育和(2)可生产治疗上有用的异源抗体。还需要可用于制备杂交瘤的B细胞源，所述杂交瘤生产在所针对的特定靶种中有治疗或诊断用途的单克隆抗体。能够进行功能性V-D-J重组和/或能够进行同种型转换的异源免疫球蛋白转基因可满足这些需要。根据前述目的，提供了能够生产异源抗体如人抗体的转基因非人动物。
此外，另一个目的是提供来自所述转基因动物的能够表达异源抗体的B细胞，其中所述B细胞是可无限增殖的，是产生特异于特定抗原的单克隆抗体的源。根据前述目的，本发明的另一目的是提供能够生产所述异源单克隆抗体的杂交瘤细胞。另外，本文的又一个目的是提供异源未重排和重排的免疫球蛋白重链和轻链转基因，这些转基因可用于生产前述非人转基因动物。此外，本文的再一个目的是提供破坏转基因动物中内源免疫球蛋白座位的方法。另外，本文的另一个目的是提供在前述转基因非人动物中诱导异源抗体生产的方法。本发明的另一目的是提供生产免疫球蛋白可变区基因片段库的方法，该库可用于构建本发明的一种或多种转基因。本文所讨论的参考文献仅仅是本申请申请日之前其公开的内容。本文没有任何内容表明发明人不可以通过在先发明而将所述文献内容的
公开日期提前。发明综述提供了能够生产异源抗体，如人抗体的转基因非人动物。所述异源抗体可以是各种同种型，包括 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec' IgD、IgE0 为了使所述转基因非人动物产生免疫反应，需要使转基因B细胞和前B细胞产生表面结合的免疫球蛋白，特别是IgM(或可能是IgD)同种型，以便实现B细胞发育以及抗原刺激的成熟。IgM(或IgD)表面结合免疫球蛋白只需在B细胞发育的抗原-刺激成熟期表达，然后成熟B细胞可以生产其它同种型，尽管一次只能生产单一转换的同种型。通常，B细胞系的细胞一次只能生产单一的同种型，尽管可进行顺式或反式RNA剪接，例如天然产生的us(分泌的y)和yM(膜结合的y)型,但y和S免疫球蛋白链会导致一个细胞同时表达多种同种型。因此，为了产生多同种型的异源抗体，具体地说是治疗上有用的IgG、IgA和IgE同种型，就需要有同种型转换发生。所述同种型转换可以是经典的型-转换，或者可源于一种或多种非经典的同种型转换机制。本发明提供了异源免疫球蛋白转基因和含所述转基因的转基因非人动物，其中所述转基因动物能够通过同种型转换生产多种同种型的异源抗体。经典的同种型转换是通过重组而进行的，该重组过程至少与转基因的一个转换序列区有关。非经典的同种型转换可通过例如人O u和人E u序列之间的同源重组(S-相关的缺失)而进行的。其它非经典转换机制如包括转基因间和/或染色体间重组以及其它方式也可以发生并可实现同种型转换。所述转基因和转基因非人动物生产受抗原-刺激的B细胞成熟所必需的第一免疫球蛋白同种型，然后可转换成编码并产生具有治疗和/或诊断用途的一种或多种异源同种型。因此，本发明的转基因非人动物在一个实施方案中能够生产，由人免疫球蛋白遗传序列编码并以高亲和力与特异性人抗原结合的IgG、IgA和/或IgE抗体。本发明还包括来自能够表达各种同种型异源抗体的转基因动物的B细胞，其中所述B细胞被无限增殖化以便提供特异于特定抗原的单克隆抗体源。衍生于所述B细胞的杂交瘤可作为所述异源单克隆抗体的一种来源。本发明提供异源未重排和重排的免疫球蛋白重链和轻链转基因，所述转基因能够在前述非人转基因动物体内或来自所述转基因动物B细胞谱系的人工培养的淋巴细胞内进行同种型转换。所述同种型转换可以自发发生或者通过促进同种型转换的试剂如T-细胞衍生的淋巴因子(如IL-4和IFNy)处理转基因动物或人工培养的B谱系淋巴细胞而诱
导产生。此外，本发明包括在前述转基因非人动物中诱导异源抗体生产的方法，其中所述抗体可以是各种同种型。这些方法包括在转基因非人动物中产生抗原-刺激的免疫反应以产生异源抗体，特别是转换的同种型的异源抗体(即，IgG、IgA和IgE)。本发明也提供了使转基因含有可实现同种型转换的序列的方法，以便在转基因动物中产生的异源免疫球蛋白和衍生于所述动物B细胞的单克隆抗体克隆是各种同种型的。本发明还提供了有利于转基因同种型转换的方法，以便特定同种型之间的转换可以以比通常发生于种系免疫球蛋白座位高或低得的多频率或以不同的时间顺序发生。转换区可取自各种Ch基因，然后在转基因构建体中与其它Ch基因相连；这样移植出的转换序列通常对于相连的Ch基因来说是功能上独立的，以便在转基因构建体中的转换通常是相连转换区的一种功能。另一种方法是，或与转换序列组合，可将S-相关缺失序列与不同Ch基因相连，通过缺失两个S-相关缺失序列之间的序列来实现非经典转换。因此，可以构建转基因以便将特定的Ch基因与不同转换序列相连，由此，使转换以高于使用天然相关转换区时的频率发生。本发明还提供了确定在含免疫球蛋白转基因的转基因动物中是否发生了转基因序列的同种型转换的方法。本发明提供了免疫球蛋白转基因构建体以及生产免疫球蛋白转基因构建体的方法，其中的一些构建体含有种系免疫球蛋白座位序列的子序列(可包含缺失)。本发明包括便于进行克隆并构建免疫球蛋白转基因的具体方法，所述方法涉及使用XhoI和SalI单限制位点的载体，所述限制位点两侧翼各有一个NotI位点。该方法研究了 XhoI和SalI限制位点的互补末端，并可用于将限制片段依次连接到载体中产生大构建体。本发明的转基因包括重链转基因，包含编码至少一个可变基因片段、一个多样性基因片段、一个连接基因片段和一个恒定区基因片段的DNA。免疫球蛋白轻链转基因包含编码至少一个可变基因片段、一个连接基因片段和一个恒定区基因片段的DNA。编码轻和重链基因片段的基因片段对于转基因非人动物来说是异源的，即它们衍生于或相应于编码与转基因非人动物不同的品种的重和轻链基因片段的DNA。在本发明的一个方面，构建转基因以便个各基因片段是未重排的，即没有被重排以便编码有功能的免疫球蛋白轻或重链。所述未重排的转基因可以进行基因片段的重组(功能性重排)并当将所述动物与抗原接触后，在所述转基因非人动物中可以表达重排的免疫球蛋白重和/或轻链。在本发明的一个方面，异源重和轻链免疫球蛋白转基因含有未重排异源DNA的相对大的片段。所述大片段通常含有来自异源免疫球蛋白座位C、J(在重链的情况下，和D)片段的必需部分。此外，所述片段还含有可变基因片段的必需部分。在一个实施方案中，所述转基因构建体含有与衍生于异源DNA的序列对应的调节序列(如启动子、增强子)、型转换区、重组信号等。另外，也可将所述调节序列掺入到转基因中，所述转基因来自与本发明所用非人动物相同或相关的种。例如，可将人免疫球蛋白基因片段与啮齿类免疫球蛋白增强子序列组合以用于转基因小鼠。在本发明的方法中，将含有种系未重排轻和重免疫球蛋白转基因(在D细胞分化过程中进行了 VDJ连接)的转基因非人动物与抗原接触，以便在二级B细胞库中诱导异源 抗体的生产。本发明还包括在本发明中所用的载体和破坏本发明所用非人动物中的内源免疫球蛋白座位的方法。所述载体和方法利用转基因，优选阳性-阴性选择载体，使所构建的载体靶向功能性破坏的一组编码本发明所用非人动物的内源重和/或轻免疫球蛋白链的基因片段。所述内源基因片段包括多样性、连接和恒定区基因片段。在本发明的该方面，将阳性-阴性选择载体与非人动物的至少一种胚胎干细胞接触，此后，选择其中将阳性-阴性选择载体通过同源重组整合到非人动物基因组中的细胞。移植后，由于所述载体同源整合到染色体DNA中，所得的转基因非人动物基本上不能发生免疫球蛋白介导的免疫反应。因此可将所述免疫缺陷型非人动物用于研究免疫缺陷或用作免疫球蛋白重和轻链转基因的受体。本发明海提供了用于抑制一种或多种免疫球蛋白链表达，而不破坏内源免疫球蛋白座位的载体、方法和组合物。所述方法可用于抑制一种或多种内源免疫球蛋白链的表达，但却可以表达一种或多种转基因-编码的免疫球蛋白链。与从遗传上破坏内源免疫球蛋白链座位不同，免疫球蛋白链表达的抑制不需要耗时的、建立被破坏了内源Ig座位纯合的转基因动物的育种过程。与内源Ig基因破坏相比，抑制作用的另一优点是在特定实施方案中，在个体动物中链抑制是可逆的。例如，Ig链抑制可利用下列序列完成(I)编码并表达反义RNA的转基因，所述反义RNA与内源Ig链基因序列可特异性杂交，(2)与内源Ig链基因序列可特异性杂交的反义寡核苷酸，和(3)与内源Ig链多肽特异性结合的免疫球蛋白。本发明提供了转基因非人动物，所述动物含有纯合的功能被破坏了的内源重链等位基因，纯合的功能被破坏了的内源轻链等位基因，至少一个拷贝的异源免疫球蛋白重链转基因，和至少一个拷贝的异源免疫球蛋白重链转基因，其中在用抗原如人抗体(如CD4)免疫接种后，所述动物产生抗体反应。本发明还提供了所述的转基因非人动物，其中所述功能破坏了的内源重链等位基因是同源重组失效的Jh区，所述功能破坏了的内源轻链等位基因是同源重组失效的Jk区，所述异源免疫球蛋白重链转基因是HCl或HC2人小基因(minigene)转基因，所述异源轻链转基因是KC2或KCle人k转基因，而且其中所述的抗原是人抗原。
本发明还提供了抑制、除去和/或功能破坏内源非人免疫球蛋白座位的各种实施方案。本发明还提供了表达人重链序列和嵌合重链的转基因小鼠，所述嵌合重链含有人重链可变区序列和鼠重链恒定区序列。所述嵌合重链通常通过在功能重排的人转基因和内源鼠重链恒定区(如Y I、Y 2a> y 2b> y 3)之间的反转换(trans-switching)而产生。含所述嵌合重链的抗体(通常与转基因编码的人轻链序列或内源鼠轻链组合)是应答用预定抗原进行的免疫接种而形成的。这些实施方案的转基因小鼠可含有B细胞，所述B细胞在第一时间点产生(表达)人重链序列，并在第二(随后)的时间点反转换产生(表达)由人可变区和鼠恒定区(如Y I、Y 2a, y 2b, y 3)组成的嵌合重链；将所述人序列和嵌合重链掺入到带轻链的有功能抗体中；所述抗体存在于所述转基因小鼠的血清中。因此重申这些实施方案的转基因小鼠可含有表达人重链序列并随后进行转换(经反式转换或顺式转换)表达嵌合或同种型转换的重链(由人可变区和其它恒定区(如鼠Y I、Y 2a, y 2b, y3；AY> a, e )组成)的B细胞；所述人序列和嵌合或同种型转换的重链被掺入到带轻链(人或小鼠)的有功能抗体中；所述抗体存在于所述转基因小鼠的血清中。 本发明还提供了产生大的转基因的方法，所述方法包括将至少三种多核苷酸导入到哺乳动物细胞中；第一种多核苷酸含有与第二种多核苷酸享有序列一致性的重组(recombinogenic)区，第二种多核苷酸含有与第一种多核苷酸享有序列一致性的重组区和与第三种多核苷酸享有序列一致性的重组区，而第三种多核苷酸含有与所述第二种多核苷酸享有序列一致性的重组区。重组区是具有足以在哺乳动物细胞(如ES细胞)，优选还在非哺乳动物真核细胞(如糖酵母属和其它酵母或真菌细胞)中产生体内同源重组的必需的序列一致性区。通常，重组区通常为至少50-100000个核苷酸或更长，优选500-10000个核苷酸长，而常常有80-100%—致性，优选95-100%—致性，最好是同基因的。本文讨论的参考文献仅提供了在本申请申请日之前的其公开的内容。本文没有任何内容表明发明人不可以通过在先发明而将所述文献内容的
公开日期提前。附图的简要说明图I描述了在未重排基因组DNA和重排免疫球蛋白重链基因表达的mRNA中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3和框架区FR1、FR2、FR3和FR4。图2描述了人\链座位；图3描述了人K链座位；图4描述了人重链座位，图5描述了含有重排的IgM基因的转基因构建体，所述IgM基因依次与含有人Y 3和Y I恒定区的25kb片段、含大鼠链3’增强子序列的700bp片段相连，图6是人K链座位的限制图谱，描述了通过体内同源重组，用于形成轻链转基因的片段。图I描述了 pGPl的构建。图8描述了 pGPl中所含多接头的构建。图9描述了用于构建本发明人重链转基因的片段。

图10描述了 pHIGl和pCONl的构建。
图11描述了插入到pRE3 (大鼠3’增强子)以形成pREG2的人C Y I片段。图12描述了 pHIG’和pCON的构建。图13描述了含人D区片段的片段，所述D区片段用于构建本发明的转基因。图14描述了 pHIG2 (含D片段的质粒)的构建。图15描述了用于构建本发明的转基因的跨人Jk和人Ck基因的片段。图16描述了 pEii的构建。图17描述了 pKapH的构建。图18A-18D描述了阳性_阴性选择载体的构建，该载体用于功能性破坏小鼠内源重链免疫球蛋白座位。 图19A-19C描述了阳性-阴性选择载体的构建，该载体用于功能性破坏小鼠内源轻链免疫球蛋白座位。图20A-20E描述了以小鼠k轻链为靶的载体的结构。图21A-21F描述了以小鼠重链为靶的载体的结构。图22描述了载体pGPe的图谱。图23描述了载体PJM2的结构。图24描述了载体pCORl的结构。图25描述了用于pIGMl、pHICl和pHIC2的转基因构建体。图26描述了 p Y e2的结构。图27描述了 pVGEl的结构。图28描述了在pHICl转基因小鼠中人Ig表达的检测结果。图29描述了 pJCKl的结构。图30描述了人工合成的重链可变区的构建。图31是重链小座位构建体pIGMp pHCl和pHC2的示意图。图32是重链小座位构建体pIGGl和K轻链小座位构建体pKCl、pKVel和pKC2的示意图。图33描述了重建功能重排的轻链基因的示意图。图34描述了血清ELISA结果。图35描述了 8只转基因小鼠血清的ELISA检测结果。图36是质粒pBCEl的示意图。图37A-37C描述了本发明转基因小鼠对KLH-DNP的免疫反应，这是通过测量KLH-DNP (37A)、KLH(37B)和 BSA-DNP (37C)特异性的 IgG 和 IgM 水平得到的。图38是ELISA数据，说明存在结合人癌胚抗原(CEA)并含有人U链的抗体；每个图均表示出免疫接种后表明的天数时，小鼠血清样品的系列稀释倍数。图39是ELISA数据，说明存在结合人癌胚抗原(CEA)并含有人Y链的抗体；每个图均表示在免疫接种后表明的天数时，小鼠血清样品的系列稀释倍数。图40表示与种系转基因序列(上线)相比，从mRNA产生的23个随机选择cDNA的排列的可变区序列，所述mRNA是从用人癌胚抗原(CEA)免疫接种的HCl转基因小鼠的淋巴样组织中获得的；在每一行上表明了相对于种系序列的核苷酸变化。表明了对应于重链⑶R1、⑶R2和⑶R3的区。用大写字母表示非种系编码的核苷酸。
图41表示称为vk65. 3的人DNA片段的核苷酸序列，该片段含有Vk基因片段；还表示了 Vk编码区推测的氨基酸序列；用方框表示剪接和重组信号序列(七聚体/九聚体)。图42表示称为vk65. 5人DNA片段的核苷酸序列，该片段含有Vk基因片段；还表示了由Vk编码区推测的氨基酸序列；用方框表示剪接和重组信号序列(七聚体/九聚体)。图43表示称为vk65. 8人DNA片段的核苷酸序列，该片段含有Vk基因片段；还表示了由Vk编码区推测的氨基酸序列；用方框表示剪接和重组信号序列(七聚体/九聚体)。图44表示称为vk65. 15人DNA片段的核苷酸序列，该片段含有Vk基因片段；还表示了由Vk编码区推测的氨基酸序列；用方框表示剪接和重组信号序列(七聚体/九聚体)。图45表示通过共注射的两个重叠片段之间的同源重组形成轻链小座位。图46表示与CEA和非CEA抗原有反应性的单克隆抗体的ELISA结果，说明抗原结 合的特异性。图47表示通过PCR扩增的10个cDNA的DNA序列以扩增含有人VDJ和鼠恒定区序列的转录物。图48表示小鼠不同稀释度血清的ELISA结果，所述小鼠携带了人重链小座位转基因和人K小座位转基因；用人CD4免疫接种小鼠，所列的数据说明与人CD4有反应性并分别含有人K、人il或人Y表位的抗体。图49表示由FACS确定人U或小鼠U的淋巴细胞染色的相对分布情况，以说明三种小鼠的基因型。图50表示由FACS确定人k或小鼠k的淋巴细胞染色的相对分布情况，以说明三种小鼠的基因型。图51表示由FACS确定小鼠入的淋巴细胞染色的相对分布情况，以说明三种小鼠的基因型。图52表示由FACS确定小鼠\或人K的淋巴细胞染色的相对分布情况，以说明四种小鼠的基因型。图53表示在未免疫接种的0011小鼠血清中，人U、人Y、人K、小鼠ii、小鼠Y、小鼠K和小鼠入链的量。图54表示不同基因型的非免疫0011小鼠血清中，说明人y、人Y、人K、小鼠y、小鼠Y、小鼠K和小鼠入链的量的散点图。图55表示在用人⑶4免疫接种0011小鼠后3星期或7星期所取的血清中，在抗⑶4抗体中，含人U、人Y或人K链之抗体的滴度。图56是人重链小座位转基因pHCl和pHC2，以及轻链小座位转基因pKClpKCle，和在所示出的位点通过PKC2和Co4之间的同源重组而得到的轻链小座位转基因的示意图。图57表示摘自Storb等(1989)的书中的鼠\轻链座位谱系图；条框表示假基因。图58是以同源基因为革E，使鼠X座位失活的不意图。图59图示说明用于缺失基因，如重链恒定区基因的同源重组靶转基因的结构。图 60 是从 Immunoglobulin Genes,Honjo, T, Alt,FW和 Rabbits TH(编)AcademicPress, NY(1989)p. 129得到的BALB/c鼠重链座位图谱。在顶线中用封闭的框表示结构基因；第二和第三条线表示用符号表明的限制位点。
图61表不小鼠重链a座位恒定区基因的核昔酸序列。图62表示移码载体(质粒B)的构建，该载体用于将2个bp的移码导入到鼠重链座位J4基因中。图63表示在超免疫过程中，转基因动物的同种型特异性反应。用比色ELISA测定值表示反应性人U和Yl的相对水平(Y轴)。在纯合JHD背景下，通过腹膜内注射弗氏佐剂中的CEA，我们免疫接种了 7-10周龄的雄性HC157品系的转基因动物(#1991，#2356，#2357)。该图描述了稀释250倍的采集血清(在各次注射前收集的)与CEA包被的微滴定孔的结合情况。图64A和64B说明通过型转换重组介导的转基因编码的Y I的同种型的表达。在表达两种不同人Yl的杂交瘤中，整合的转基因的结构与U和Y I转换区之间的重组一致。图64A表示从三个表达转基因的杂交瘤中分离的Pac I/Sfi I消化之DNA的Southern印迹。从左到右克隆92-09A-5H1-5，人Y I+/;克隆92-90A-4G2-2，人Y I+/U、克隆92-09A-4F7-A5-2,人Y r，y +。所有3个杂交瘤均衍生于对于HC1-57整合是半合子的、对 于JHD破坏是纯合的7月龄雄性小鼠(小鼠#1991)。将印迹与衍生自含有人Y I的转换区3’那一半的2. 3kb Bglll/Sfil DNA片段的探针杂交。在表达y的杂交瘤中未发现转换产物，而在表达Y I的两个杂交瘤92-09A-5H1-5和92-9A-4G2-2中，含有分别得自5. I和5. 3kb的Pac I/Sfi I片段的转换产物。图64B是两种可能的缺失机制示意图，通过该机制可发生从U到Yl的型转换。在人U基因的两侧翼为可进行重组以缺失U的400bp同向重复片段(0 y和E U)。由该机制进行的型转换总是产生6. 4kb Pac I/Sfi I片段，而通过U和Y I转换区之间的重组而发生的型转换则产生4-7kb的Pac I/Sfi I片段，在每次转换中，片段大小会发生变化。在图64A中检测的表达Yl的两个杂交瘤似乎已经在U和Y I转换区之间进行了重组。图65表示通过反式转换产生的嵌合人/小鼠免疫球蛋白重链。反式转换产物的cDNA克隆通过反转录和PCR扩增脾和淋巴结RNA的混合物产生，所述RNA混合物从超免疫的HCl转基因-JHD小鼠(#2357，参见图63关于动物和免疫方案的说明中的图标)分离得至IJ。给出了 10种随机捡出的克隆的部分核苷酸序列。小写字母表示种系编码的，大写字母表示不能定为已知种系序列的核苷酸；这些可能是体细胞突变、N核苷酸或截短的D片段。两种都表不是小鼠Y序列。图66A和66B表示超免疫小鼠中的重排VH251转基因发生体细胞突变。IgG重链可变区cDNA的部分核苷酸序列克隆自对抗原展示出一级反应(图64A和对抗原展示出二级反应(图64B)的CHl系26小鼠。在该图的顶部列出了种系序列；给出了各克隆种系的核苷酸变化。A区表示与种系序列的一致性，大写字母表示未鉴定的种系源。将序列按照J片段的用法分组。列出了各J片段的种系序列。CDR3序列内的小写字母表示与HCl转基因中所含已知D片段的一致性。在各序列的末端列出了指定的D片段。未指定的序列可能衍生于N区添加或体细胞突变；或在某些情况下，它们很短以致不能从已知的D片段中区分出随机N核苷酸。图66A —级反应13个随机捡出的VH251-ylcDNA克隆。给4周龄的雌性HCl系26-JHD小鼠(#2599)注射一次KLH和完全弗氏佐剂；5天后分离脾细胞RNA。在V片段内体细胞突变的总频率为0.06% (2/3198bp)。图66B 二级反应13个随机捡出的VH251- y IcDNA克隆。给2月龄的雌性HCl系26-JHD小鼠(#3204)在一个月内注射3次KLH和弗氏佐剂(第一次注射完全弗氏佐剂，在I周和3周后，用不完全弗氏佐剂加强注射)；4个月后分离脾细胞和淋巴结。在V片段内体细胞突变的总频率为1.6% (52/3198bp)。图67A和67B表示限于、I序列的广泛的体细胞突变体细胞突变和类型转换发生在B细胞的相同种群中。从超免疫的抗CEA(参见图63的免疫过程)的HCl系57转基因-JHD小鼠(#2357)的脾和淋巴结细胞中分离VH251cDNA克隆的部分核苷酸序列。图67A:IgM:23个随机捡出的VH251-iicDNA克隆。156bp的核苷酸序列包含CDRl和2的周围残基。体细胞突变的总水平为0. 1% (5/3744bp)。图67B :IgG :23个随机捡出的VH251-y1cDNA克隆。核苷酸序列包含⑶R1-3和周围残基。V片段内体细胞突变的总频率为I. 1% (65/5658bp)。与图67A中的ii序列进行比较前156个核苷酸的突变频率为I. 1% (41/3588bp)。参见图66A和66B的解释符号的标注。图68表示VH51P1和VH56P I在未免疫小鼠中显示有广泛的体细胞突变。IgG重链可变区cDNA的部分核苷酸序列克隆自9周龄、未免疫雌性HC2系2550转基因-JHD小鼠(#5250)。在19个VH56P1片段内体细胞突变的总频率为2. 2% (101/4674bp)。在单个VH51P I片段内体细胞突变的总频率为2. 0% (5/246bp)。图示参见图66A和66B的解释符 号的标注。图69表示带有内源Ig座位被破坏了的双转基因小鼠含有人IgMK阳性B细胞。从4个不同基因型的小鼠脾中分离细胞的FACS。左边对照小鼠(#9944，6周龄雌性JH+/-, JCk+/-;杂合野生型小鼠重和K轻链座位，非转基因的)。第二列人重链转基因(#9877,6周龄雌性JH-/-，JC K -/-，HC2系2550+ ;被破坏的小鼠重和k轻链座位纯合，半合子的HC2转基因)。第三列人K轻链转基因(#9878，6周龄雌性贝-/-，兀1^-/-，1(&)4系4437+ ;被破坏的小鼠重和K轻链座位纯合，半合子的KCo4转基因)。右列双转基因(#9879,6周龄雌性JC k -/-，HC2系2550+，被破坏的小鼠重链和k轻链座位纯合；KCo4系4437+ ;半合子的HC2和KCo4转基因)。顶行表达小鼠入轻链(x_轴)和人k轻链(y_轴)的染色的脾细胞。第二行表达人U重链(X-轴)和人K轻链(y-轴)的染色的脾细胞。第三行表达小鼠U重链(X-轴)和人K轻链(y-轴)的染色的脾细胞。底行表达小鼠B220抗原的染色的脾细胞的直方图(对数荧光x-轴；细胞数y_轴)。对于两个颜色组的各图，所示四个象限中的相对细胞数量基于碘化丙锭(propidium)染色和光散色给出的相对于e参数通经的百分数。在底行所示的各样品中的B220+细胞馏分以淋巴细胞光散色栅的百分数给出。图70表示在双转基因小鼠血清中分泌的免疫球蛋白水平。来自18个HC2/KCo4双转基因小鼠的人il、Y和K以及小鼠Y和V ,所述小鼠是内源重链和K -轻链座位破坏纯合的。小鼠(+) HC2系2550 (每次整合 5个HC2拷贝)，KCo4系4436 (每次整合1_2个KCo4拷贝);(〇)HC2系2550，KCo4系4437 (每次整合 10个KCo4拷贝);(X)HC2系2550，KCo4系4583 (每次整合 5个KCo4拷贝)；(□ ) HC2系2572 (每次整合30-50个HC2 拷贝)，KCo4 系 4437 ; ( A )HC2 系 5467 (每次整合 20-30 个 HC2 拷贝)，KCo4 系 4437。图71A和71B表示对人抗原的人抗体反应。图71A :对重组可溶⑶4的一级反应。报道了 4只双转基因小鼠在取血前(〇)和免疫后( )血清中人IgM和人K轻链的水平。图71B :体内转换成IgG。为了抑制非特异性交叉反应，在存在1.5 ii/ml过量IgE、k和1%正常小鼠血清条件下，用与过氧化物酶结合的多克隆抗人IgG检测人IgG(圈)。在存在1%正常小鼠血清条件下，用与过氧化物酶结合的多克隆抗人K试剂检测人K轻链(方块)。列出了一个小鼠(#9344;HC2系2550，KCo4系4436)的代表性结果。各点代表两个孔减背景吸收值的的平均值。图72表示用杂交瘤上清液进行人PBL的FACS分析，将人⑶4+淋巴细胞和人⑶8+淋巴细胞区分开来。图73表示在转基因小鼠血清中的人a -⑶4IgM和IgG。图74表示竞争结合试验，以比较转基因小鼠a-人⑶4杂交瘤单克隆、2C11-8与RPA-TA 和 Leu-3A 单克隆。图75表示培养的2C 11-8杂交瘤的Ig表达的生产数据。图76表示构成Hco7转基因的重叠的质粒插入片段组。
图77A描述了 pGP2b质粒载体的核苷酸序列和限制图谱。图77B描述了 pGP2b质粒载体的限制图谱。图78(A和B)描述了组装大转基因的克隆策略。图79表示大插入片段在高拷贝的pUC衍生的质粒中是不稳定的。图80表示噬菌体Pl克隆P1-570。插入片段覆盖包含Y 3和Y I的人重链恒定区部分以及转换元件。N，NotI ；S, Sail ；X, XhoIo图81表示在HCo7转基因动物中，人U和Y I的血清表达。图82表示在HCo7/Kco4双转基因/双缺失小鼠中，人免疫球蛋白的血清表达。图83表示在HCo7转基因小鼠脾RNA中，人Y I和Y 3转录物的RTPCR检测。图84表示用LPS和IL-4体外诱导人IgGl和IgG3。图85表示浓缩YAC DNA浓度的琼脂糖凝胶电泳装置。图86表示来自HC2/KCo5/JHD/JKD和HC2/KCo4/JHD/JKD小鼠的骨髓细胞的双色FACS分析。以百分数给出了 B2207CD43_、B2207CD43+和B220+IgM+栅的细胞馏分中的细胞数。图87表示来自HC2/KCo5/JHD/JKD和HC2/KCo4/JHD/JKD小鼠的脾细胞的双色FACS分析。以百分数给出了在各B220s/IgM+和B220 /IgM+栅的细胞馏分的细胞数。图88IgGK抗-nCD4单克隆抗体与CD4+SupTl细胞的结合。图89通过流式细胞计数对IgG抗-⑶4单克隆抗体的表位测定。SupTl细胞与缓冲液(左列)、2. 5mg/ml RPA-T4 (中列)、或2. 5mg/mlLeu3a (右列)预保温,然后再与10种人IgG单克隆抗体(用上清液I : 2稀释的)之一，或嵌合Leu3a预保温。在该图中表明了 3种人IgG单克隆抗体的结果。图90用人IgGk抗-CD4单克隆抗体抑制MLR。表I描述载体pGPe的序列。表2描述基因VH49. 8的序列。表3描述在本发明转基因小鼠血清中人IgM和IgG的检测结果。表4描述VDJ连接的序列。表5描述了掺入到编码转录物的、pHCl转基因中的J片段在成人外周血淋巴细胞(PBL)的J片段中的分布。表6描述了掺入到编码转录物的、pHCl转基因中的D片段在成人外周血淋巴细胞(PBL)的D片段中的分布。表7描述了在pHCl转基因小鼠和人PBL中，来自框架区VDJ连接的转录物的⑶R3肽的长度。表8描述了在30个被分析的pHCl转基因克隆中，VDJ区的推测氨基酸序列。表9列出了在所说明的试验中，所用品系112的转基因小鼠；⑴表示存在相应的转基因，(++)表示动物对VhD失效转基因是纯合的。表10表示数个0011小鼠的基因型。表11表示人可变区用于转基因小鼠的杂交瘤。表12表示转基因V和J片段的使用。
表13表示在转基因小鼠的HC2重链转基因中，体细胞突变的发生率。表14表示在YAC 4xl7El上鉴定人Vk片段。表15列出了在小鼠品系KCo5_9272中表达的人V Y基因的鉴定。表16列出了 IgGK抗-n⑶4单克隆抗体的分泌水平。表17列出了与人CD4结合的单克隆抗体的速率和亲合力常数。表18列出了人抗-人CD4单克隆抗体的亲合力和速率常数。表19列出了人抗-人CD4单克隆抗体的亲合力和速率常数。表20报道了抗-⑶4单克隆抗体的亲合力和速率常数。表21列出了用流式细胞计数确定的人抗-人CD4单克隆抗体的亲合力常数。表22列出了功能转录物的部分核苷酸序列。表23列出了在杂交瘤转录物中种系V(D) J片段的使用。表24描述了在小基因构建中所用的引物、载体和产物。表25描述了人mAb对猩猩外周淋巴细胞的影响。发明详述如上文所讨论的，需要生产与特异性人抗原有反应性的人免疫球蛋白，所述抗原是有前途的治疗和/或诊断靶。但生产与人抗原特异性结合的人免疫球蛋白还有许多问题。首先，作为B细胞源的被免疫的动物必须对提呈的抗原产生免疫反应。为了使动物产生免疫反应，提呈的抗原必须是外源的，而且所述动物对所述抗原不耐受。因此例如，如果需要生产与人蛋白质结合的、具有个体型的单克隆抗体，自身耐受性会使被免疫的人不会对人蛋白质产生实质性的免疫反应，因为可致免疫的抗原表位仅是起因于人群中的蛋白质多态性的表位(同种异型表位)。第二，如果作为形成杂交瘤的B细胞源的动物(以人为例)对真正的自身抗原产生免疫反应，在动物中将产生严重的自身免疫疾病。若人作为杂交瘤的B细胞源，根据目前的标准，认为所述自身免疫是不道德的。因此，开发分泌与预定人抗原有特异性反应之人免疫球蛋白的杂交瘤存在许多问题，因为需要可靠的分泌人抗体的B细胞源，所述B细胞会弓I发抗预定抗原的抗体反应。可用于得到与人抗原有特异性反应的人抗体的一种方法是，生产带有本发明人免疫球蛋白转基因构建体的转基因小鼠。总之，将含全部或部分人免疫球蛋白重链和轻链座位的转基因，或含合成“小座位”的转基因(下文描述的，在未决申请u. S. S. N. 08/352322，1994 年 12 月 7 日申请；U. S. S. N. 07/990860，1992 年 12 月 16 日申请；U. S. S. N. 07/810279，
1991年 12 月 17 日申请；U. S. S. N. 07/904068，1992 年 6 月 23 日申请；U. S. S. N. 07/853408，
1992年 3 月 18 日申请；U. S. S. N. 07/574748，1990 年 8 月 29 日申请；U. S. S. N. 07/575962，1990年8月31日申请，以及PCT/US9I/06185，1991年8月28日申请，以上文献均引入本文作为参考)用于生产转基因非人动物，所述转基因均含有人重链和轻链座位必需的功能元件。所述转基因非人动物有能力生产由人免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白链，此外并能对人抗原产生免疫反应。因此，所述转基因动物可作为与特定人抗原具有反应性的免疫血清源，可将来自所述转基因动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合以产生分泌由人免疫球蛋白基因编码的、并与人抗原有特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤。此前已经报道了含各种免疫球蛋白基因的转基因小鼠的制备。已经用重排的小鼠免疫球蛋白重链或轻链基因生产转基因小鼠。此外，在转基因小鼠中已经表达了含U或Y I恒定区的功能重排的人Ig基因。但其中含未重排的(V-D-J或V-J未重排)免疫球蛋白基因的转基因的试验是不稳定的，在某些情况下，产生出不完整或很小的重排转基因。但 没有公开的实例说明重排或未重排的免疫球蛋白转基因在转基因内的Ch基因之间进行了成功地同种型转换。本发明还提供了鉴定候选杂交瘤的方法，所述杂交瘤分泌含人免疫球蛋白链的单克隆抗体，所述免疫球蛋白链主要是由与人恒定区序列相连的多肽中的人VDJ序列组成。从含有下列杂交瘤的杂交瘤克隆池中鉴定所述候选杂交瘤(1)表达主要由人VDJ区和人恒定区组成的免疫球蛋白链的杂交瘤克隆，和(2)表达主要由人VDJ区和鼠恒定区组成的异种杂种免疫球蛋白链的反式转换的杂交瘤。在筛选与预定抗原具有结合特异性之抗体的结合条件下，将各个或合并的杂交瘤克隆上清液与预定的抗原接触，通常是与通过吸附到固体基质(如微滴定孔)上而固定的抗原接触。还将与人恒定区特异性结合的抗体与杂交瘤上清液和预定抗原在结合条件下接触，以便所述抗体选择性地与至少一种人恒定区表位结合，并基本上不与鼠恒定区表位结合；因此形成复合物，所述复合物主要由与预定抗原结合的杂交瘤上清液(转基因单克隆抗体)和与人恒定区特异性结合的抗体(并可用可检测标记或报告基团标记)组成。所述复合物的形成表明杂交瘤克隆或克隆池表达人免疫球蛋白链。在本发明优选的实施方案中，在筛选中所用的抗人恒定区免疫球蛋白特异性地识另IJ非U、非6同种型，优选a或e，更优选Y同种型恒定区。Y同种型的单克隆抗体是优选的(i)因为对于一些治疗应用而言，IgG免疫球蛋白的特征比IgM免疫球蛋白的更好(例如由于IgG二聚体比IgM五聚体小些)和(ii)因为体细胞突变的过程与从U恒定区向非U (如Y)恒定区的型转换有关。从已经进行了型转换的免疫球蛋白种群中选出的免疫球蛋白(如IgG)与抗原的亲和力，高于从未经型转换的种群中选出的免疫球蛋白(如IgM)与抗原的亲合力。参见例如 Lonberg 和 Huszar. Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93 (199),该文献引入本文作为参考。在一个实施方案中，首先就Y同种型恒定区来筛选候选杂交瘤，然后就与预定抗原的特异性结合来筛选表达IgG的杂交瘤群。因此根据本发明方法，将本发明的转基因小鼠用预定的抗原免疫以诱导免疫反应。从所述小鼠中收集B细胞，然后将所述B细胞与无限增殖细胞融合以产生杂交瘤。首先筛选杂交瘤以鉴定分泌非U、非6同种型Ig(如IgG)的杂交瘤。然后对针对与所需预定抗原的特异性结合该组杂交瘤进行筛选。用如Harlow和Lane,抗体实验室手册,冷泉港，纽约(1988)中所述的标准技术完成筛选。利用该方法，可以从实践上有效鉴定高亲和力的免疫球蛋白(如Ka大于约IO7IT1)。定义如本文所用的，术语“抗体”指含有至少两个轻多肽链和两个重多肽链的糖蛋白。每个重和轻多肽链都含有可变区(通常是多肽链的氨基末端部分)，所述可变区含有与抗原可相互作用的结构域。每个重和轻链还含有多肽链的恒定区(通常为羧基部分)，所述恒定区介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞、一些吞噬细胞和常规补体系统的第一组分(Clq))的结合。如本文所用的“异源抗体”是相对于生产所述抗体的转基因非人动物而言的。将其定义为具有在不构成转基因非人动物的生物(通常来自于除转基因非人动物以外的品种)中发现之氨基酸序列或相应DNA序列编码的抗体。 如本文所用的，“异种杂种抗体”指含有不同生物源的轻和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链相结合的人重链的抗体就是异种杂种抗体。如本文所用的，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类型(如IgM或IgG1)。如本文所用的，“同种型转换”指抗体类型或同种型从一种Ig类型转变成另一种Ig类型的现象。如本文所用的，“未转换的同种型”指在未发生同种型转换时生产的重链的同种型类型；编码未转换同种型的Ch基因通常是紧接功能重排的VDJ基因下游的第一个Ch基因。如本文所用的，术语“转换序列”指引起转换重组的DNA序列。“转换供体”序列，通常是U转换区，是转换重组过程中待缺失构建体区的5’(即上游)。“转换受体”区则是在待缺失构建体区和取代恒定区之间的区(如Y，e等)。由于没有总是发生重组的特异性位点，因此通常从构建体无法预测最后的基因序列。如本文所用的，“糖基化方式”是指与蛋白质，更具体地说与免疫球蛋白共价相连的碳水化合物单位的方式。本领域专业人员可认识到与转基因Ch基因从中衍生的品种相t匕，在异源抗体的糖基化方式与非人转基因动物中的所述糖基化方式更相似时，可将异源抗体的糖基化方式表征为与天然发生的非人转基因动物品种产生之抗体的糖基化方式基本相似。如本文所用的，“特异性结合”指下列抗体特征(I)与预定抗原结合的亲和力至少为IXlO7M'和⑵以比其与除预定抗原或极为相关抗原以外的非特异性抗原(如BSA、酪蛋白)结合的亲和力至少高2倍的亲和力，优先与预定抗原结合。本文中用于形容某对象的术语“天然产生的”是指该对象可以在自然界中发现。例如，在生物(包括病毒)中存在的并从天然来源分离的以及未经实验室人们故意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然产生的。本文所用的术语“重排(的)”指重链或轻链免疫球蛋白座位的构型，其中在分别主要编码完整Vh或\结构域的结构中，V片段与D-J或J片段紧密相连。可通过与种系DNA进行比较来鉴定重排的免疫球蛋白基因座位；重排的座位至少是一个重组的七/九聚体同源元件。
本文所用的与V片段有关的“未重排(的)”或“种系构型”指其中V片段不进行重组以便紧邻D或J片段的一种构型。对于核酸而言，术语“基本同源”指在进行最佳排列和比较时，两个核酸或指定的序列至少约80%的核苷酸，通常至少约90% -95%，最佳至少约98-99. 5%的核苷酸是相同的，所述核酸含有适宜的核苷酸插入或缺失。或者，在选择性杂交的条件下，当片段与互补链杂交时，则表示基本同源。核酸可存在于完整细胞、细胞溶解产物中或是以部分纯化的或基本上纯的形式存在。当通过标准技术包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他技术，纯化掉其他细胞组分或其他污染物如其他细胞核酸或蛋白质后，则核酸是“分离的”或“基本上纯的”。参见F. Ausubel等编，Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York(1987)。尽管常常是天然序列(除修饰的限制位点等外)，可按照标准技术将来自cDNA、基因组DNA或其混合物的本发明核酸进行突变以提供基因序列。对于编码序列，这些突变可按需要改变氨基酸序列。具体地说，提供了与天然V、D、J、恒定区、转换区和本文所述的其他序列基本上同源或自这些序列衍生的DNA序列(其中“衍生”指序列是与另一序列相同 的或从另一序列修饰得到的)。核酸是“可操作相连的”指与另一核酸序列的功能关系。例如，如果要使启动子或增强子影响序列的转录，则需将其与编码序列可操作相连。就转录调节序列而言，若需连接两个蛋白质的编码区，可操作相连指被连接的DNA序列是相邻的，而且必要的时候使两个蛋白质的编码区相邻连接在解读框架中。对于转换序列，可操作相连指序列能够影响转换重组。能够生产异源抗体的转基因非人动物以异源抗体库应答外源抗原刺激的转基因非人动物的设计要求在转基因动物中所含的异源免疫球蛋白转基因在B细胞发育的整个过程中均能正确地发挥其功能。在优选的实施方案中，异源重链转基因的正确功能包括同种型转换。因此，构建本发明的转基因以便产生同种型转换以及实现下列一种或多种功能(I)高水平和细胞类型特异性的表达，
(2)功能基因重排，(3)激活并应答等位排斥，(4)表达足够的一级抗体，(5)信号传导，(6)体细胞超突变，和(7)在免疫反应过程中，转基因抗体座位的控制。从下列公开中显而易见的是，并不需要满足前述所有标准。例如，在其中转基因动物的内源免疫球蛋白座位被功能性破坏的那些实施方案中，转基因不需激活等位排斥。此夕卜，在其中转基因含有功能性重排的重和/或轻链免疫球蛋白基因的那些实施方案中，无需功能基因重排的第二种标准，至少对于已经重排的转基因是如此。关于分子免疫学背景，参见 Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul WilliamE. 1 , Raven Press,N. Y.,该文献引入本文作为参考。在本发明的一个方面，提供了在转基因动物种系中含重排的、未重排的或重排和未重排组合的异源免疫球蛋白重和轻链转基因的转基因非人动物。每个重链转基因至少含有一个Ch基因。此外，重链转基因可含有功能同种型转换序列，该序列能够支持编码多个Ch基因的异源转基因在转基因动物的B细胞中进行同种型转换。所述转换序列可以是来自作为转基因Ch基因来源之品种的种系免疫球蛋白座位中天然的转换序列，或所述转换序列可衍生于接受转基因构建体的品种(转基因动物)中的转换序列。例如，如果人转基因构建体含有类似于天然小鼠重链座位中转换序列的转换序列，用于产生转基因小鼠的人转基因构建体可发生较高频的同种型转换，可能是由于小鼠转换序列与小鼠转换重组酶系统一起可发挥最佳功能，而人转换序列则不行的缘故。可通过常规克隆方法分离并克隆所述转换序列，或以与免疫球蛋白转换区序列有关的公开的序列资料为基础设计的重叠合成寡核苷酸，重新合成所述转换序列(Mills 等,Nucl. Acids Res. 18 :7305-7316 (1991) ;Sideras 等,Intl. Immunol.，1 :631-642 (1989)，所述文献引入本文作为参考)。对于前述各个转基因动物，在转基因动物的大部分B细胞(至少10% )中发现了功能重排的异源重和轻链。本发明的转基因包含重链转基因，含有编码至少一个可变片段、一个多样性基因片段、一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA。免疫球蛋白轻链转基因含有编码至少一个可变基因片段、一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA。编码轻和重链基因片段的基因片段与转基因非人动物异源，因为它们衍生于或相应于编码免疫球蛋白重和轻链基因片段的DNA，所述DNA来自转基因非人动物以外的品种。在本发明的一个方面，构建转基因以便各个基因片段是未重排的，即不被重排以便编码有功能的转基因轻或 重链。所述未重排的转基因有利于V、D和J基因片段的重组(功能性重排)，并当与抗原接触时，优选有利于将全部或部分D区基因片段掺入到转基因非人动物内所得的重排免疫球蛋白重链中。在另一实施方案中，转基因含有未重排的“小座位”。所述转基因通常含有C、D和J片段的主要部分以及V基因片段的子序列。在所述转基因构建体中，各种调节序列，如启动子、增强子、型转换区、用于RNA加工的剪接-供体和剪接-受体序列、重组信号等，含有衍生于异源DNA的相应序列。可将所述调节序列掺入到转基因中，所述转基因来自与本发明所用非人动物相同的或相关的品种。例如，可将人免疫球蛋白基因片段与啮齿类免疫球蛋白增强子序列组合在转基因中，用于转基因小鼠。或者，可将合成的调节序列掺入到转基因中，其中所述合成调节序列与哺乳动物基因组中已知的天然功能性DNA序列不同源。按照一致的规则如说明剪接-受体位点或启动子/增强子基元之许可序列的规则来设计合成的调节序列。例如，与天然种系的Ig座位相比,小座位含有基因组免疫球蛋白座位的一部分，所述免疫球蛋白座位含有至少一个非必需DNA部分(例如间插序列；内含子或其部分)的中间(即不在该部分末端)缺失。本发明还包括含具有重和轻链转基因之种系细胞的转基因动物，其中所述转基因之一含有重排的基因片段，另一个含有未重排的基因片段。在优选的实施方案中，重排的转基因是轻链免疫球蛋白转基因，而未重排的转基因是重链免疫球蛋白转基因。抗体的结构和产牛所有免疫球蛋白的基本结构均是以由两个轻多肽链和两个重多肽链组成的单位为基础。每个轻链均含有称为可变轻链区和恒定轻链区的两个区。同样，免疫球蛋白重链含有称为可变重链区和恒定重链区的两个区。重或轻链的恒定区均由被称为重或轻恒定区基因(Ch)片段的基因组序列编码。用特定的重链基因片段定义免疫球蛋白的类型。例如，在人类中，U恒定区基因片段确定了IgM类型的抗体,而y、y2、y3或Y 4恒定区基因片段确定了 IgG类型的抗体以及IgG亚型IgG I-IgG 4抗体。同样，用\或Ci2恒定区基因片段确定了 IgA类型的抗体以及亚型IgAl和IgA2抗体。5和e恒定区基因片段分别确定了 IgD和IgE抗体类型。重和轻免疫球蛋白链的可变区都含有抗体的抗原结合结构域。因为需要抗体在该区具有多样性以结合各种抗原，所以编码起始或一级可变区的DNA含有许多不同的DNA片段，所述DNA片段衍生于特定可变区基因片段的家族。在轻链可变区的情况下，所述家族含有可变(V)基因片段和连接(J)基因片段。因此，轻链的起始可变区由一个V基因片段和一个J基因片段编码，所述V基因片段和J基因片段分别选自生物基因组DNA中所含的V和J基因片段家族。在重链可变区的情况下，编码重链的起始或一级可变区的DNA含有一个重链V基因片段、一个重链多样性(D)基因片段和一个J基因片段，每个片段分别选自基因组DNA中免疫球蛋白基因片段的V、D和J家族。为了增加有助于形成抗体结合位点的序列多样性，优选重链转基因包括有利于V-D-J功能重排的顺式作用序列，在所述重排过程中，可将全部或部分D区基因序列掺入到重排的V-D-J基因序列中。通常至少约I %表达的由转基因-编码的重链(或mRNA)在V区中包含可识别的D区序列。优选，至少约10%转基因-编码的V区包含可识别的D区序列，更优选至少约30 %，且最优选50 %以上包含可识别的D区序列。 可识别的D区序列通常是对应于重链转基因D区基因片段中的序列的至少约8个的连续的核苷酸和/或由所述D区核苷酸序列编码的氨基酸序列。例如，如果转基因包含D区基因DHQ52，则含有位于V基因片段和J基因片段之间的V区内之序列5’ -TAACTGGG-3’的转基因-编码的mRNA就可识别为含D区序列，具体地说为DHQ52序列。同样，例如如果转基因包含D区基因DHQ52，则含有位于V基因片段氨基酸序列与J基因片段氨基酸序列之间的V区内的氨基酸序列-DAF-的转基因-编码的重链多肽就可识别为含D区序列，具体地说是DHQ52序列。但，由于可将D区片段以不同程度掺入到VDJ连接和各解读框架中，所以就需要将重链可变区的D区与转基因中的D区片段进行比较以确定掺入的特定D片段。此夕卜，重组过程中，可能的外切核酸酶消化也会在V-D-J重组过程中产生不精确的V-D和D-J连接。但由于体细胞突变和N区添加，有些D区序列也是可识别的，但可能不会等同于转基因中的连续的D区序列。例如，可将核苷酸序列5’-CTAAXTGGGG-3’(其中X是A、T或G，而且位于重链V区，两侧翼为V区基因序列和J区基因序列)识别为对应于DHQ52序列5 ’ -CTAACTGGG-3 ’。同样，例如可将位于V区内的多肽序列-DAFDI -、-DYFDY-或-GAFDI -(这些序列在氨基末端一侧翼为由转基因V基因序列编码的氨基酸序列，在羧基末端一侧翼为由转基因J基因序列编码的氨基酸序列)识别为D区序列。因此，由于体细胞突变和N区添加可在衍生于转基因D区的序列中产生突变，所以用下列定义作为确定是否存在可识别D区序列的标准。氨基酸序列或核苷酸序列可识别为D区序列如果(1)该序列位于V区内，而且其两侧翼一侧翼为V基因序列(核苷酸序列或推测的氨基酸序列)，另一侧翼为J基因序列(核苷酸序列或推测的氨基酸序列)和(2)该序列基本上相同或相似于已知的D基因序列(核苷酸序列或编码的氨基酸序列)。本文所用术语“基本相同”指多肽序列或核酸序列的特征，其中多肽序列与参考序列有至少50%的一致性，常常有至少约80%的序列一致性，有时有约90%以上的序列一致性，而核酸序列与参考序列有至少70%的序列一致性。除去总共占不到参考序列35%的小缺失或增加，计算出该序列一致性的百分数。参考序列可以是较大序列如整个D基因的子序列；但如果是多核苷酸，参考序列至少应有8个核苷酸长，如果是多肽，至少应有3个氨基酸长。通常，参考序列至少是8-12个核苷酸或至少3-4个氨基酸，优选参考序列是12-15个核苷酸或更多，或至少5个氨基酸。术语“基本相似”指多肽序列的特征，其中多肽序列与参考序列有至少80%的相似性。通过记录相同氨基酸或位置保守的相似氨基酸取代来计算序列相似性百分比。位置保守的氨基酸取代是由单个核苷酸取代产生的；第一个氨基酸由第二个氨基酸取代，其中第一个氨基酸的密码子与第二个氨基酸的密码子只因一个核苷酸取代而不同。因此，例如序列-Lys-Glu-Arg-Val-与序列-Asn-Asp-Ser-Val-基本相似，因为通过只导入3个取代突变，在4个源密码子中的3个进行单个核苷酸取代，就可将序列-AAA-GAA-AGA-GUU-突变成-AAC-GAC-AGC-GUU-。参考序列可以是较大序列如整个D基因的子序列；但参考序列至少有4个氨基酸长。通常，参考序列至少有5个氨基酸，优选参考序列有6个氨基酸长或更多。初级库
产生编码重和轻链免疫球蛋白基因DNA的过程主要发生在正在发育的B细胞中。在连接各免疫球蛋白基因片段前，在初级B细胞的前体中，发现大部分V、D、J和恒定(C)基因片段是V、D、J和C基因片段簇。通常重或轻链的所有基因片段位于一个染色体上相当接近的位置上。在各免疫球蛋白基因片段重组前，将所述基因组DNA称为“未重排的”基因组DNA。在B细胞分化的过程中，V、D、J (或在轻链基因的情况下只有V和J)的适宜的家族成员之一进行重组以形成功能重排的重和轻免疫球蛋白基因。所述功能重排是可变区片段重排，以便形成编码有功能可变区的DNA。该基因片段重排过程似乎是按序进行的。首先，产生重链D到J连接，然后产生重链V到DJ连接和轻链V到J连接。将编码轻和/或重链中有功能可变区的该起始形式的DNA称为“功能重排的DNA”或“重排的DNA”。在重链的情况下，将所述DNA称为“重排的重链DNA”，在轻链的情况下，将所述DNA称为“重排的轻链DNA”。用相似的语言来描述本发明转基因的功能重排。形成功能性重和轻链可变区的可变区基因片段的重组是由重组信号序列(RSS)介导的，该序列位于可发生重组的V、D和J片段侧翼。必需并足以进行同向重组的RSS含有一对称的七聚体、一个AT富集的九聚体和一个12或23个碱基对的间插序列区。在不同的座位和进行D-J(或V-J)重组的品种中，这些信号是保守的并且是功能上可交换的。参见Oettinger等，(1990)科学，248，1517-1523及其中引述的参考文献。七聚体含有序列CACAGTG或其类似物，其后是一不保守的序列的间隔区，接下来的九聚体含有序列ACAAAAACC和其类似物。这些序列是在J或V和D基因片段的下游发现的。紧接着种系D和J片段之前，又是两个重组信号序列，第一个是九聚体，然后是七聚体，两者由一非保守序列隔开。在\、Vh或D片段后的七聚体和九聚体序列与它们将与之重组的I、D或Jh片段前的序列互补。七聚体与九聚体之间的间隔序列有12个碱基对或22-24个碱基对长。除V、D和J片段的重排外，通过轻链V和J片段之间以及重链D和J片段之间的可变重组，也可在初级免疫球蛋白重和轻链中产生多样性。所述可变重组是通过在所述片段的被连接处发生变化而产生的。在轻链中的所述改变通常发生在V基因片段最后的密码子内以及在J片段开始的密码子内。同样的不精确连接也会在D和Jh片段之间的重链染色体上发生，并可能延伸长达10个核苷酸。此外，可将不由基因组DNA编码的数个核苷酸插入在D和Jh之间以及Vh和D基因片段之间。这些核苷酸的添加称为N区多祥性。在VJ和/或VDJ重排后，位于重排可变区下游的重排可变区和一个或多个恒定区基因片段的转录，产生ー初级RNA转录物，将其适当剪接后，得到编码全长重或轻免疫球蛋白链的mRNA。所述重和轻链包含一个前导信号序列以使免疫球蛋白分泌和/或插入到B细胞的跨膜区。编码该信号序列的DNA被包含在用于形成重或轻免疫球蛋白链可变区之V片段的第一外显子内。适宜的调节序列也存在于所述mRNA中以控制mRNA的翻译，从而产生编码的重和轻免疫球蛋白多肽，在将其彼此适宜连接后，形成抗体分子。可变区基因片段中的所述重排以及所述连接过程中可能发生之可变重组的结果是产生了初级抗体库。通常，已经分化到该阶段的ー种B细胞产生単一的初级抗体。在该分化过程中，抑制基因片段功能重排的细胞事件发生，所述基因片段不是功能重排的Ig基因中所含的那些片段。将二倍体B细胞保持所述单特异性的过程称为等位排斥。ニ级库为应答外源抗原从含有初级库的ー组序列表达免疫球蛋白的B细胞克隆是立即可得的，由于简单VJ和VDJ连接所产生的有限的多样性，由所谓初级应答产生的抗体的亲合力相对较低。两种不同类型的B细胞产生这种初始反应形成初级抗体之细胞的前体和产生ニ级抗体的B细胞的前体(Linton等，细胞，59 :1049-1059(1989))。在应答特定的抗原时第一类B细胞成熟成分泌IgM的浆细胞。另ー类B细胞通过进入T细胞依赖的成熟途径而对与抗原的最初接触作出反应。在抗原刺激的B细胞克隆的T细胞依赖性成熟作用中，细胞表面上的抗体结构以两种方式发生改变恒定区转换成非IgM亚型，通过多个的单氨基酸取代而修饰可变区的序列以产生亲合力较高的抗体分子。如前所述，重或轻Ig链的各可变区含有抗原结合结构域。通过氨基酸和核酸测序已经确定，ニ级反应过程中的体细胞突变可在包含三个互补决定区(⑶R1、⑶R2和⑶R3)的整个V区内均可能发生，所述决定区也称为超变区1、2和3(Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest (1991)U. S. Department of Health and HumanServices, Washington, DC,该文献引入本文作为參考)。CDRl和CDR2位于可变基因片段内，而⑶R3主要是V和J基因片段或V、D和J基因片段重组的結果。不由⑶Rl、2或3组成的可变区的那些部分通常称为框架区，FR1、FR2、FR3和FR4。參见图1，在超突变过程中，重排的DNA产生突变以产生具有改变的Ig分子的新克隆。与外源抗原具有较高亲合力的那些克隆通过辅助T细胞选择性地扩增，使表达的抗体亲合力成熟。克隆选择通常会导致在CDRl、2和/或3区内含有新突变的克隆表达。但突变也会在这些区外发生，从而影响抗原结合结构域的特异性和亲合力。能够生产异源抗体的转基因非人动物本发明ー个方面的转基因非人动物是通过将本发明的至少ー种免疫球蛋白转基因(下文讨论的)导入到非人动物的受精卵或早期胚胎中而产生的。用于本发明的非人动 物通常包含能够重排免疫球蛋白基因片段以产生初级抗体反应的任何哺乳动物。所述非人转基因动物包括，例如转基因猪、转基因大鼠、转基因兔、转基因牛以及其它转基因动物品种，特别是本领域已知的哺乳动物。特别优选的非人转基因动物是小鼠和啮齿类的其它成员。
但，本发明不限于使用小鼠。反之，能够产生初级和ニ级抗体反应的任何非人哺乳动物均可使用。所述动物包括非人灵长类如猩猩、牛、绵羊和猪，啮齿类家族的其它成员如大鼠，以及兔和豚鼠。特别优选的动物是小鼠、大鼠、兔和豚鼠，最佳为小鼠。在本发明的一个实施方案中，可将来自人基因组的各种基因片段以未重排的形式用于重和轻链转基因中。在该实施方案中，将所述转基因导入到小鼠中。轻和/或重链转基因的未重排基因片段具有人独特的DNA序列，它们不同于小鼠基因组中的内源免疫球蛋白基因片段。它们 在不由B细胞组成的种系和体细胞中很容易以未重排形式检测到，在B细胞中以重排形式很容易被检测到。在本发明的另ー实施方案中，转基因包括重排的重和/或轻免疫球蛋白转基因。相应于功能性重排的VDJ或VJ片段的所述转基因的具体片段含有明显区别于小鼠内源免疫球蛋白基因片段的免疫球蛋白DNA序列。与由小鼠B细胞编码的氨基酸序列相比，在DNA序列中的这些差异也反映在由所述人免疫球蛋白转基因编码的氨基酸序列中。因此用抗体可以检测本发明转基因非人动物中的人免疫球蛋白氨基酸序列，所述抗体是对人免疫球蛋白基因片段编码之免疫球蛋白表位特异性的。含来自人或其它品种之未重排转基因的转基因B细胞，可功能性地重排适宜的基因片段以形成功能重排的轻和重链可变区。显而易见的是，由所述重排转基因编码的抗体含有的DNA和/或氨基酸序列与实施本发明所用的非人动物中的正常DNA和/或氨基酸序列是异源的。未重排的转基因如本文所用的，“未重排的免疫球蛋白重链转基因”含有编码至少ー个可变基因片段、一个多样性基因片段、一个连接基因片段和一个恒定区基因片段的DNA。所述重链转基因的每个基因片段都衍生于编码免疫球蛋白重链基因片段的DNA，或具有与其相应的序列，所述重链基因片段来自与所述转基因被导入的非人动物不同的种。同样，如本文所用的，“未重排的免疫球蛋白轻链转基因”含有编码至少ー个可变基因片段、一个连接基因片段和至少ー个恒定区基因片段的DNA，其中所述轻链转基因的各基因片段衍生于编码免疫球蛋白轻链基因片段的DNA，或具有与其相应的序列，所述轻链基因片段来自与所述轻链转基因被导入的非人动物不同的种。本发明该方面的所述重和轻链转基因含有未重排形式的上述基因片段。因此，适宜的重组信号序列(RSS)被置于重链转基因的V、D和J片段之间以及轻链转基因的V和J片段之间。此外，所述转基因还包含适宜的RNA剪接信号以便将恒定区基因片段与VJ或VDJ重排的可变区相连。为了有利于在含有ー个以上C区基因片段，如来自人基因组的C U和C Y I的重链转基因内进行同种型转换，将下文解释的“转换区”插入到各恒定区基因片段的上游和可变区基因片段的下游以便在所述恒定区之间进行重组，使得免疫球蛋白发生类型转换，如从IgM转换成IgG。所述重和轻链免疫球蛋白转基因还含有位于可变区基因片段上游的包含启动子区的转录控制序列，它们通常含有TATA基元序列。可近似地将启动子区定义为当与下游序列可操作相连时，可使下游序列进行转录的DNA序列。启动子还需要其它相连的顺式作用序列存在以便产生有效的转录。此外，优选还可包括參与无效(Sterile)转录物转录的其它序列。在公开的文献中可发现參与无效转录物表达的其它序列的实例，所述文献句,栝 Rotlinian 等，Tntl. TmmunoI. 2 :62ト627 (1990) :Reid 等,Proc. Natl. AcacL Sci. USA 86 840-844(1989) Stavnezer 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7704-7708(1988);和 Mills等，Nucl. Acids Res. 18 :7305-7316 (1991)，各文献均引入本文作为參考。这些序列通常包括紧接转换区上游的至少50bp，优选转换区上游的约至少200bp ;更优选转换区上游约至少200-1000bp或更长的序列。适宜的序列在紧接着人SYl、SY2、SY3、SY4、Sal、Sa2和Se转换区的上游；优选紧接人Sy1和Sy3转换区上游的序列，其中Sy1最为优选。另外，或者结合鼠Ig转换序列一起使用；一般最好使用与转基因非人动物相同种的Ig转换序列。此外，在紧邻转基因转换序列的上游优选包含干扰素(IFN)可诱导转录调节元件如IFN-可诱导增强子。除启动子外，可使用主要在B谱系细胞中发挥功能的其它调节序列。因此，例如采用优选位于轻链转基因的J和恒定区基因片段之间的轻链增强子序列，来增强转基因的表达，由此有利于等位排斥。在重链转基因的情况下，也使用调节增强子。用所述调节序列使转基因的转录和翻译达到最大程度以便诱导等位排斥并产生相对高水平的转基因表达。尽 管已经对前述启动子和增强子调节控制序列进行了一般性描述，但所述调节序列可以是与非人动物异源的，从所述非人动物的基因组中得到异源转基因免疫球蛋白基因片段。或者，所述调节基因片段衍生于含重和轻转基因的非人动物或很相近品种基因组中的相应调节序列。在优选的实施方案中，基因片段衍生于人类。含所述重和轻转基因的转基因非人动物能够针对施用于该动物之特异性抗原产生Ig-介导的免疫反应。在所述动物体内产生能够生产异源人抗体的B细胞。无限増殖化并针对适宜的单克隆抗体(Mab)进行筛选后，提供了治疗性的人单克隆抗体源，如杂交瘤。当治疗性地施用于人时，所述人Mab具有显著降低的免疫原性。尽管优选的实施方案公开了含人基因片段的重和轻转基因的构建，但本发明不限于此。就此而言，应理解本文所述的教导很容易适用于来自人以外品种的免疫球蛋白基因片段。例如，除用本发明的抗体治疗人外，可将由适宜基因片段编码的治疗抗体用于产生用在兽类中的单克隆抗体。重排的转基因在另ー实施方案中，转基因非人动物含有转基因动物种系中的至少ー个功能重排的异源重链免疫球蛋白转基因。所述动物含有表达所述重排重链转基因的所有初级B细胞。当与抗原接触后，所述B细胞优选能够发生体细胞突变以形成与抗原具有高亲和カ和对抗原具特异性的异源抗体。所述重排的转基因含有至少两个Ch基因以及同种型转换所必需的相关序列。本发明还包括含有带重和轻链转基因之种系细胞的转基因动物，其中所述转基因之一含有重排的基因片段，另ー个含有未重排的基因片段。在所述动物中，重链转基因应含有至少两个Ch基因以及同种型转换所必需的相关序列。本发明还包括生产本发明转基因所用的合成的可变区基因片段库的方法。所述方法包括产生免疫球蛋白V片段DNA的种群，其中每个V片段DNA编码ー个免疫球蛋白V片段，并在每个末端含有一个限制核酸内切酶切割识别位点。此后将免疫球蛋白V片段DNA种群串连起来以形成合成的免疫球蛋白V片段群。所述合成的可变区重链转基因应含有至少两个Ch基因以及同种型转换所必需的相关序列。同种型转换在B淋巴细胞的发育中，细胞最初生产具有结合特异性的IgM，所述结合特异性是由产生重排的Vh和\区決定的。随后各B细胞和其子代细胞合成具有相同L和H链V区的抗体，但它们可转换H链的同种型。U和8恒定区的使用主要是由不同的剪接決定的，这样可以在单ー细胞中共表达IgM和IgD。在基因重排缺失了 Cii和CS外显子后,其它重链同种型(Y a和e)只天然表达。称为同种型转换的该基因重排过程通常是通过位于各重链基因上游的所谓转换片段(除Sタト)之间的重组而进行的。各转换片段为2-10kb长，并主要由短重复序列組成。 重组的精确位置随各类型的转换而不同。研究表明转换可能是与细胞Ch序列的丢失有夫，所述研究是利用溶液杂交动力学或采用cDNA衍生的Ch探针的Southern印迹进行的。u基因的转换(S)区，Sli位于编码序列5’的约l_2kb处，并由许多串联重复的(GAGCT)n(GGGGT)序列组成，其中n通常为2到5，但最多可达17。(參见T. Nikaido等，Nature 292:845-848(1981))。在其它Ch基因的5’也发现了类似的跨数千个碱基对的内部重复转换序列。Sa区已被测序并发现其由串联重复的80-bp同源单位组成，而鼠SY2a、SY2b和SY3均含有彼此很相似的重复的49-bp同源单位。(參见P. Szurek等，J. Immunol 135 :620-626 (1985)和T. Nikaido等，J. Biol. Chem. 257 :7322-7329 (1982)，所述文献引入本文作为參考)。所有已测序的S区均包含出现率很高的五聚体GAGCT和GGGGT，它们是Sli基因的基本重复元件(T. Nikaido等，J. Biol. Chem. 257 :7322-7329 (1982)，所述文献引入本文作为參考);在其它S区，这些五聚体不象在Sli中那样精确地串联重复，但它们夹在较大的重复单位中间。Sy1区有另外的较高级的结构两个同向重复序列，两侧翼各有两个49-bp串联重复序列簇。(參见M. R. Mowatt等，J. Immunol. 136 :2674-2683 (1986)，该文献引入本文作为參考)。已发现人H链基因的转换区与小鼠H链基因的转换区很相似。实际上，发现人与小鼠Ch基因5’克隆之间的相似性只限于S区，这证明了这些区在生物学上是很重要的。ii和a基因之间的转换重组产生了混合的Sli-Sa序列。在总是发生重组的Sli或在任何其它S区中，通常都没有特异性位点。通常，与V-J重组的酶机制不同，转换机制显然容纳了种系S前体的重复同源区的不同排列，然后在排列内的不同位置将序列连接。(參见T.H. Rabbits等，NucleicAcids Res. 9 :4509-4524(1981)和 J. Ravetch 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6734-6738 (1980)，该文献弓I入本文作为參考)。尚不了解转换成特定同种型的选择性激活机制的确切内容。尽管内源性因素如淋巴因子和细胞因子可能会上调节同种型-特异性重组酶，但也可能是相同的酶促机制催化向所有同种型的转换，而且特异性依赖于将这种机制靶导向特异的转换区。已经表明T细胞衍生的淋巴因子IL-4和IFNy特异性地促进某些同种型的表达在小鼠中，IL-4降低IgM、IgG2a、IgG2b和IgG3的表达，提高IgE和IgGl的表达；而IFNy选择性地刺激IgG2a的表达并对IL-4-诱导的IgE和IgGl表达的增加有拮抗作用(Coffman等，J. Tmmun01. 136 949 (1986)和 Snapper 等，Science 236 :944(1987)，所述文献引入本文作为參考)。IL-4和IL-5的组合可促进IgA的表达(Coffman等，J. Immunol. 139 3685(1987))。
说明T细胞对转换所起作用的大部分试验并未排除这样ー种可能性，即在发生特定转换重组的细胞中观察到的增加可能反映了对转换前或定型前细胞的选择；但最可能的解释是淋巴因子实际上促进了转换重组。类型转换的诱导似乎是与无效转录物有关，所述转录物起始于转换片段的上游(Lutzker 等，Mol. Cell. Biol. 8 :1849 (1988) ；Stavnezer 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 7704(1988) ；Esser and Radbruch,EMBO J. 8 :483 (1989) ;Berton等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86 :2829(2989) ;Rothman 等，Int. Immunol. 2 :621 (1990)，各文献均引入本文作为參考)。例如，观察到的IL-4对Y I无效转录物的诱导作用和IFN- y的抑制作用分别与IL-4促进培养B细胞中向Yl的转换以及IFN-Y抑制Y I表达有夫。因此，包含影响无效转录物转录的调节序列也可以影响同种型的转换率。例如，増加特定无效转录物的转录通常会提高涉及相邻转换序列的同种型转换重组的频率。出于以上原因，优选在用于同种型转换的各转换区上游的约l_2kb处，转基因包含转录调节序列。这些转录调节序列优选包括启动子和增强子元件，更优选包含与转换区天然相连(即在种系构型中存在的)的5’侧翼区(即上游)。该5’侧翼区通常约至少50个核苷酸长，优选约至少200个核苷酸，最佳为至少500-1000个核苷酸。尽管可将来自ー个转换区的5’侧翼序列与用于转基因构建的不同转换区相连(例如，可将来自人Sy1转换序列的5’侧翼区移植到Sal转换序列的上游；将鼠Sy1侧翼区移到与人Y I转换序列相邻处；或将鼠Sy1转换序列移到人Y I编码区上)，在一些实施方案中，优选插入在转基因构建体中的各转换区含有5’侧翼区，该侧翼区在天然种系构型的上游。单克降抗体可用本领域熟知的各种技术生产单克隆抗体。总之，将来自用目标抗原免疫之动物的脾细胞无限増殖化，通常是通过与骨髄瘤细胞融合而达到的(參见，Kohler和Milstein, Eur. J. Immunol. 6 :511-519 (1976))。无限增殖化的其它方法包括用E-B病毒、癌基因或反转录病毒转化或本领域熟知的其它技术。从单ー无限増殖细胞产生的克隆中筛选生产对所需抗原具特异性和亲和カ的抗体，通过各种技木，包括注射到脊椎动物宿主的腹腔中，可提高所述细胞的单克隆抗体产率。这些领域有用的各种技术的有关讨论參见例如Harlow and Lane,抗体实验室手册 ,冷泉港,纽约(1988),所述技术包括免疫接种动物以生产免疫球蛋白；生产单克隆抗体；标记免疫球蛋白以用作探针；免疫亲和纯化；以及免疫检测。转基因初级库A.人免疫球蛋白座位转基因功能的ー个重要要求是产生初级抗体库，所述成分必需足够多以引发对各种抗原的ニ级免疫反应。重排的重链基因由ー个肽外显子、一个可变区外显子和串联排列的多-结构域恒定区组成，每个组分均是由数个外显子编码的。每个恒定区基因编码不同类型免疫球蛋白的恒定部分。在B细胞发育的过程中，缺失与V区邻近的恒定区，从而表达新的重链。对各类型的重链，RNA剪接的不同方式会产生跨膜和分泌的免疫球蛋白。
估计人重链座位由近200个2Mb的V基因片段(目前的数据认为存在约50-100个V基因片段)、约40kb的近30个D基因片段、3kb内的6个J片段簇和约300kb以上的9个恒定区基因片段组成。整个座位占据14号染色体长臂远端的约2. 5Mb。B.基因片段转基因
I.重链转某闵在优选的实施方案中，免疫球蛋白重和轻链转基因含有来自人的未重排的基因组DNA。在重链的情况下，优选的转基因含有长度为670-830kb的NotI片段。该片段的长度是不确定的，因为尚未精确确定3’的限制位点。但已知其位于a I和V a基因片段之间。该片段含有已知Vh家族的所有6个成员、D和J基因片段，以及U、S、Y3、Yl和a I恒定区(Berman等，EMBO J. 7 :727-738 (1988)，该文献引入本文作为參考)。含所述转基因的转基因小鼠品系正确地表达B细胞发育所需的重链(IgM)，和至少ー种转换的重链(IgG1)，以及足够大量的可变区库以弓I发针对大部分抗原的ニ级反应。2.轻链转某闵可同样构建含有来自人轻链座位所有必需基因片段和调节序列的基因组片段。按实施例和题目为“能够生产异源抗体的转基因非人动物”(1990年8月29日申请，U. S. S. N07/574748)的未决申请中的描述构建所述转基因。C.通过体内重组在细胞内产生的转基因无需分离在ー个DNA片段上的所有或部分重链座位。因此例如可在转基因(transgenesis)过程中，在非人动物体内形成来自人免疫球蛋白重链座位的670_830kbNotI片段。所述体内转基因构建是通过将两个或多个重叠DNA片段导入到非人动物的胚胎核内而产生的。DNA片段的重叠部分含有基本上同源的DNA序列。在与包含在胚胎核内的 重组酶接触后，重叠的DNA片段以适宜的方向进行同源重组以形成670-830kb NotI重链片段。可将体内转基因构建用于形成任何数量的免疫球蛋白转基因，这是因为用目前的技术很难或不可能进行如此大小的操作。因此体内转基因构建可用于产生比用YAC载体操作产生的DNA片段大的免疫球蛋白转基因(Murray和Szostak，Nature 305:189-193)。可将所述转基因构建用于将基本上整个的免疫球蛋白座位导入非人动物中，所述免疫球蛋白座位来自与转基因非人动物不同的种。除形成基因组免疫球蛋白转基因外，还可将体内同源重组用于形成实施例中所述的“小座位”转基因。在利用体内转基因构建体的优选实施方案中，各重叠的DNA片段优选含有重叠的基本上同源的DNA序列，该序列位于ー个DNA片段的ー个末端和第二个DNA片段的ー个末端之间。DNA片段的所述重叠部分优选含有约500bp-约2000bp，最佳为I. Okb-2. Okb。在普通转让的题目为“通过DNA片段的同源重组而使DNA在细胞内产生”(1990年8月29日申请，U. S. S. N. 07/574, 747)的美国专利申请中也描述了在体内形成转基因的重叠DNA片段的同源重组。D.小座位转基因如本文所用的，术语“免疫球蛋白小座位”指通常不到约150kb，一般在约25-200kb之间，含至少ー种下列组分的DNA序列(可在较长的序列内)功能可变(V)基因片段、功能连接(J)区片段、至少ー个功能恒定(C)区基因片段，而且如果是重链小座位，还可以含有功能多祥性(D)区片段，以便所述DNA序列含有至少ー种实质性的不连续(如相对于基因组DNA序列而言，通常至少约2-5kb，优选10-25kb或更长)。轻链小座位转基因至少25kb长，通常为50-60kb。重链转基因通常约70-80kb，优选至少约60kb，并含有两个与转换区可操作相连的恒定区。此外，小座位的个体元件优选是种系构型的，井能够在转基因动物的前B细胞中进行基因重排以便表达具有各种抗原特异性的功能抗体分子，所述各种抗原特异性全部是由小座位元件编码的。另外，含有至少两个C0基因和必需转换序列的重链小座位通常能够进行同种型转换，以便产生不同免疫球蛋白类型的功能抗体分子。所述同种型转换可在转基因非人 动物体内的B细胞中发生，或发生在从转基因非人动物中取出的B细胞谱系的培养细胞中。在另ー优选实施方案中，免疫球蛋白重链转基因含有一个或多个各种VH、D和Jh基因片段以及两个或多个ら基因。至少将每种适宜类型的基因片段中的一个插入到小座位转基因中。就重链转基因的Ch片段而言，优选转基因含有至少ー个y基因片段和至少ー个其它恒定区基因片段，优选Y基因片段，最佳为Y3或Y1。这种优先选择会在编码的免疫球蛋白的IgG与IgM形式之间进行类型转换并生产可分泌的高亲和カ非IgM免疫球蛋白。也可以使用其它恒定区基因片段如编码用于IgD、IgA和IgE生产的那些。本领域专业人员还可以构建这样的转基因，即其中重链Ch基因出现的顺序不同于作为Ch基因供体之品种种系中的天然空间顺序的转基因。另外，本领域专业人员可以选择来自品种内多个个体的Ch基因(如同种异体的Ch基因)并将所述基因插入到转基因中，作为能够进行同种型转换的额外的Ch基因；然后在一些实施方案中，所得的转基因非人动物可生产各种类型的抗体，包括转基因Ch基因所得自的品种所代表的所有同种异型。另外，本领域专业人员可从不同品种中选择Ch基因以将其插入到转基因中。各Ch基因包括功能转换序列，尽管所用的转换序列不必是那些与Ch基因天然相邻的那些序列。种间Ch基因组合会产生可生产各种类型抗体的转基因非人动物，所述抗体对应于来自各个种的Ch基因。含种间Ch转基因的转基因非人动物可作为构建杂交瘤的B细胞源以生产兽用单克隆抗体。人中的重链J区片段含有6个功能J片段和3个DNA为3kb长的假基因簇。已知其相对紧密的大小和分离这些片段以及U基因和ー个23kb SFil/Spel片段上5基因5’ 部分的能力(Sado 等,Biochem. Biophys. Res. Comm. 154 :264271 (1988),该文献引入本文作为參考)，优选将所有J区基因片段均用于小座位构建体。由于该片段包括U和6基因之间的区域，因此它可能含有U表达所需的所有顺式连接的3’调节元件。此外，由于该片段包括整个J区，所以它含有重链增强子和U转换区(Mills等，Nature 306809 (1983) ；Yancopoulos 和 Alt, Ann. Rev. Immunol. 4 :339-368 (1986)，所述文献引入本文作为參考)。该片段还含有引发VDJ连接以形成初级B细胞的转录起始位点(Yancopoulos和Alt，Cell40 :271-281 (1985)，该文献引入本文作为參考)。或者，可用包含部分D区的36kb BssHII/Spell片段代替23kb Sfil/Spell片段。用所述片段増加5’侧翼序列的量以促进有效的D到J连接。人D区由4个同源的9kb亚区组成,所述亚区是串联的(Siebenlist等，(1981)Nature，294，631-635)。各亚区含有最多达10个D片段。已将这些片段中的ー些作了图谱分析并列在图4中。可用两种不同的方法产生小座位D区。第一种方法是只使用位于短连续区之DNA上的那些D片段，该DNA包含一个或两个重复的D亚区。候选物是含12个D片段的ー个15kb片段。该DNA由2个连续的EcoRI片段组成，并已将其完全测序(Ichihara等，(1988)，EMBO J. ,7,4141-4150) 0 12个D片段足以满足初级库。但由于D区分散的性质，因此另ー种方法是将数个不连续的含D-片段的片段连接在一起，以产生片段数量较多的小片段DNA。例如通过确定是否存在侧翼九聚体和七聚体序列(同上文)并參考有关文献可鉴定出其它的D-片段基因。用至少ー个，优选ー个以上的V基因片段来构建重链小座位转基因。按未决申请 U. S. S. N 07/574748 (1990 年 8 月 29 日申请)、PCT/US91/06185 (1991 年 8 月 28 日)和U. S. S.N 07/810279 (1991年12月17日申请)(所述文献均引入本文作为參考)所述，可分离带有或不带有侧翼序列的重排的或未重排的V片段。
按未决申请U.S. S. N 07/574748(1990 年 8 月 29 日申请)、PCT/US91/06185 (1991年8月28日)中所述，可分离带有或不带有侧翼序列的重排的或未重排的V片段、D片段、J片段和C基因。可从人\或K免疫球蛋白座位相似地构建小座位轻链转基因。因此例如可从多个DNA片段构建例如约75kb编码V、D、J和恒定区序列的免疫球蛋白重链小座位转基因构建体，所述每个序列均与人基因序列基本同源。优选将所述序列与转录调节序列可操作相连并使所述序列能进行重排。用两个或多个适宜排列的恒定区序列(如U和Y)和转换区，也可进行转换重组。如未决申请U.S. S. N 07/574748(1990年8月29日申请)中所述，从多个与人DNA基本上同源并能进行重排的DNA序列可构建举证性的轻链转基因构建体。E.能够进行同种型转换的转基因构建体理论上，要进行类型转换的转基因构建体应包括调节无效转录物所需的所有顺式作用序列。天然转换区和上游启动子以及调节序列(如IFN-可诱导的元件)是优选包含在能够进行同种型转换的转基因构建体中的顺式作用序列。应将转换区(优选人IY转换区)相邻上游的至少50个碱基对，优选约至少200个碱基对，最佳至少500-1000个碱基对或更长的序列与转换序列优选人YI转换序列可操作相连。此外，可将转换区与天然不和特定转换区相连的Ch基因的上游相连(并与之相邻)。例如，但不是为了限制，可将人Yl转换区与人a2CH基因的上游相连，或可将鼠Y I转换区与人Ch基因相连。在转基因小鼠中达到非典型同种型转换(如8相关的缺失)的其它方法涉及包含在人V-基因侧翼的400bp同向重复序列(O y和e u ) (Yasui等，Eur. J. Immunol. 19 1399(1989))。这两个序列间的同源重组使只产生IgD的B细胞中的y基因缺失了。可用下列结构式表示重链转基因 (Vh) x- (D) y- (Jh) z- (Sd) m- (C1) n- [ (T) - (Sa) p- (C2) ] q其中Vh是重链可变区基因片段，D是重链D (多祥性)区基因片段，Jh是重链J (连接)区基因片段，Sd是能够參与与Sa受体区的片段重组以便同种型转换发生的供体区片段，
CiiB细胞发育中所用的编码同种型的重链恒定区基因片段(如U和S)，T是含至少ー个启动子的顺式作用转录调节区片段，Sa是能够參与与所选Sd供体区片段进行重组以便进行同种型转换的受体区片段，C2是编码除ii以外同种型(如ん、y2、y3、y4、a p a2、e )的重链恒定区基因片段。 x、y、z、m、n、p 和 q 是整数。x 是 1-100，n 是 0-10，y 是 1-50，p 是 1-10，z 是 1-50，q是0-50，m是0_10。通常当转基因能 够进行同种型转换时，q必须至少是1，m至少是1，n至少是1，m大于或等于n。Vh、D、JH、SpCpT、Sa和C2片段可以来自各种品种，优选哺乳动物，最好是人和鼠种系 DNA。Vh片段可来自各种品种，但优选来自在人种系中天然存在的Vh片段，如Vh251。通常包括约2个Vh片段，优选包括约4个Vh片段，最佳至少包含约10个Vh片段。通常至少包含ー个D片段，尽管优选至少包含10个D片段，而且ー些实施方案中包括10个以上的D片段。一些优选的实施方案包含人D片段。通常将至少ー个Jh片段插入到转基因中，尽管转基因优选包含约6个Jh片段，而某些优选实施方案包括约6个以上的Jh片段。一些优选的实施方案包含人Jh片段，而在更为优选的实施方案中包含6个人Jh片段，而不包含非人Jh片段。Sd片段是能够參与与转基因的Sa片段重组的供体区。对于典型的同种型转换，Sd
这样的转换区。优选转换区是鼠或人的，更优选Sd是人或鼠的Sli，以及SAi人的或鼠Sy1。对于非典型同种型转换(如5相关的缺失)，Sx和Sa优选是在人ii基因侧翼的400bp同向重复序列。C1片段通常是U或5基因，优选ii基因，更优选人或鼠U基因。T片段通常包含与转换区天然相邻的(即种系)S’侧翼序列。T片段通常为至少约50个核苷酸，优选约至少200个核苷酸，更优选约至少500-1000个核苷酸。优选T片段是种系构型中与人或鼠转换区上游紧邻的5’侧翼序列。对于本领域专业人员显而易见的是，T片段可包含在动物种系中不天然存在的顺式作用转录调节序列(如病毒增强子和启动子，如在SV40、腺病毒和其它感染真核细胞的病毒中发现的那些)。C2片段通常是Yいy2、y3、y4、a p a 2、e Ch基因，优选这些同种型的人Ch基因，更优选人Y1或Y3基因。也可使用鼠Y2a和Y2b，作为各品种下游(即转换的)同种型基因。若重链转基因含有免疫球蛋白重链小座位，则转基因的全长通常为150kb或少ー些。总之，转基因不是天然重链Ig座位。因此例如，可以缺失非必需区或用其它品种的相应区进行取代。 F.确定Ig转基因中功能同种型转换的方法可以用本领域已知的任何方法确定转基因非人动物中同种型转换出现的频率。优选的实施方案包括下列内容，単独或组合使用I.检测mRNA转录物，所述转录物含有与至少ー个转基因下游ら基因而不是8同源的序列以及与转基因Vh-Dh-Jh重排的基因同源的相邻序列；所述缺失可通过Northern杂交、S1核酸酶保护检测、PCR扩增、cDNA克隆或其它方法来检测。2.在转基因动物血清或从转基因动物B细胞制备的杂交瘤细胞培养物的上清液中检测由下游ら基因编码的免疫球蛋白，其中可通过免疫化学方法表明所述蛋白质含有功能可变区；3.在来自转基因动物B细胞的DNA或杂交瘤细胞的基因组DNA中检测DNA重排与转基因中同种型转换的出现是否一致，所述检测可通过Southern印迹杂交、PCR扩增，基因组克隆或其它方法来完成；或4.鉴定同种型转换的其它标志，如无效转录物的生产、与转换有关的特征酶(如“转换重组酶”)的生产、或其它可检测、測量或通过目前技术可观察到的其它特征。由于各转基因品系可代表转基因整合的不同位点，以及转基因插入片段可能不同的串联排列，而且由于转基因和侧翼DNA序列各自不同的构型会影响基因表达，因此优选鉴定并使用表达高水平人免疫球蛋白(特别是IgG同种型)并含有最少拷贝的转基因的小 鼠品系。单拷贝的转基因可使出现不完全等位基因表达的情况降之最少。通常将转基因整合到宿主染色体DNA中，最经常的是插入到种系DNA中，并通过随后培育种系转基因种畜动物来扩增。但是，实施者可按情况或需要使用本领域已知或随后开发出的其它载体和转基因方法。内源非人重链恒定区基因可发生反式转换，并产生嵌合重链和含有所述嵌合人/小鼠重链的抗体。所述抗体可能适用于本文所述的某些用途，也可能是不令人满意的。G.内源免疫球蛋白座位的功能性破坏通过抑制转基因非人动物中内源免疫球蛋白基因的重排，预期成功重排的免疫球蛋白重和轻链转基因的表达会具有显性效果。但是另ー种产生没有内源抗体的非人动物的方法使内源免疫球蛋白座位突变。利用胚胎干细胞技术和同源重组，可以很容易地除去内源免疫球蛋白库。下面描述对小鼠免疫球蛋白座位的功能性破坏。但公开的载体和方法很容易经改变而适用于其它非人动物。总之，该技术包括通过同源重组使能够分化成生殖细胞组织的多潜能细胞系中的基因失活。将含有改变的、小鼠免疫球蛋白基因拷贝的DNA构建体导入到胚胎干细胞核中。在细胞的一部分中，导入的DNA与内源小鼠基因拷贝重组(用不同的拷贝代替之)。将含新的遗传工程损伤的细胞注射到宿主小鼠胚胎中，然后将该胚胎再植入到雌性受体中。有些胚胎发育成嵌合小鼠，这些小鼠具有完全衍生于突变细胞系的生殖细胞。因此，通过繁殖嵌合小鼠，可以得到含导入的遗传损伤的新小鼠品系(见Capecchi (1989), Science, 244,1288-1292中的综述)。由于小鼠\座位只占免疫球蛋白的5%，所以重链和/或K轻链座位的失活就足够了。有3种方法来破坏这些中的每个座位，缺失J区、缺失J-C内含子增强子以及通过导入终止密码子而破坏恒定区编码序列。就DNA构建体的设计而言，最后这种方法是最直接的。除去U基因破坏了 B细胞的成熟，由此防止通过类型转换而转换成任何有功能的重链片段。下面列出使这些座位失效的方法。为了破坏小鼠U和K基因，以Jaenisch和其同事(Zi jlstra等，(1989)Nature,342,435-438)用于成功地破坏小鼠P 2微球蛋白基因的设计为基础，使用靶向载体。将来自质粒pMCIneo的新霉素抗性基因(neo)插入到祀基因的编码区。pMCIneo插入片段使用杂合病毒启动子/增强子序列以驱动neo表达。该启动子在胚胎干细胞中有活性。因此，可用neo作为失效构建体整合的选择性标记。将HSV胸苷激酶(tk)基因加到构建体的一端，作为抗随机插入的阴性选择性标记(Zijlstra等，同上文)。破坏重链座位的一种优选方法是除去J区。该区在小鼠中相当小，只有I. 3kb。为了构建基因的靶向载体，分离15kb KpnI片段，该片段含有小鼠基因组文库中的所有分泌的A恒定区。用来自pMCIneo的I. Ikb插入片段取代I. 3kb的J区。然后将HSV tk基因加到KpnI片段的5’末端。通过同源重组，该构建体的正确整合，会导致用neo基因取代小鼠Jh区。采用以neo基因为基础的引物和与D区KpnI位点5’末端的小鼠序列同源的引物，通过PCR筛选重组体。或者，通过破坏U基因的编码区使重链座位失效。该方法也使用前述方法中所用的相同的15kb KpnI片段。将来自pMCIneo的I. Ikb插入片段插入到外显子II中特有的BamHI位点，然后，将HSV tk基因加到KpnI 3’末端。然后筛选在neo插入片段任ー侧翼的、除去tk基因的双交換。通过PCR扩增，从筛选的克隆池中检测这些結果。ー个PCR引 入衍生于neo序列，另一分来自靶向载体外的小鼠序列。在实施例中说明了小鼠免疫球蛋白的功能性破坏。G.内源免疫球蛋白座位的抑制表达除内源Ig座位的功能性破坏外，抑制是防止内源Ig座位表达的另ー种方法。可用从ー种或多种整合转基因产生的反义RNA，通过反义寡核苷酸，和/或通过施用一种或多种对内源Ig链具特异性的抗血清来抑制内源Ig基因。反义多核苷酸可用反义RNA转基因使特定的基因部分或完全不能表达(Pepin等，(1991)Nature355 :725 ；Helene.，C.和 Toulme, J. (1990)Biochimica Biophys. Actal049 :99 ；Stout, J.和 Caskey, T. (1990) Somat. Cell Mol. Genet. 16 :369 ；Munir 等，(1990) Somat.Cell Mol. Genet. 16 :383，各文献均引入本文作为參考)。“反义多核苷酸”是有下列性质的多核苷酸(I)与全部或部分參考序列，如内源Ig Ch或4区的序列互补，和(2)与靶序列如染色体基因座位或Ig mRNA特异性杂交。所述互补反义多核苷酸可包含核苷酸取代、増加、缺失或转座，只要还保留了与相关靶序列特异性杂交的所述多核苷酸的功能特性。互补的反义多核苷酸包括可与各种mRNA特异性杂交并防止mRNA转录和/或RNA加工和/或所编码多肽翻译的可溶性反义RNA或DNA寡核苷酸(Ching 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 :10006-10010(1989) ;Broder 等,Ann.Int. Med. 113 :604-618(1990) ；Loreau 等，FEBS Letters 274:53-56(1990) ；Holcenberg等，W091/11535 ；U. S. S. N. 07/530165( “新的人 CRIPTO 基因”)；W091/09865 ；W091/04753 ；W090/13641 ;和EP 386563，所述文献均引入本文作为參考)。反义序列是与至少ー种至少约15个连续核苷酸长，通常至少20-30个核苷酸长，且优选30个以上核苷酸长的免疫球蛋白基因序列互补的多核苷酸序列。但在某些实施方案中，与互补的免疫球蛋白基因序列相比，反义序列可以有取代、増加或缺失，只要还保留了与相关靶序列可特异性杂交的反义多核苷酸特性。通常反义序列与在DNA重排后编码或可以编码免疫球蛋白链的内源免疫球蛋白基因序列互补。在一些情况下，对应于免疫球蛋白基因序列的有义序列可以发挥功能以便抑制表达，特别是通过干扰转录来抑制表达。因此反义多核苷酸抑制所编码多肽的生产。就此而言，抑制一种或多种内源Ig座位之转录和/或翻译的反义多核苷酸可使非人动物的能力和/或特异性发生变化，以生产由内源Ig座位编码的免疫球蛋白链。可在转 染的细胞或转基因细胞(例如用于重建个体或转基因非人动物的全部或部分造血干细胞群的转基因多潜能造血干细胞)中，可从异源表达盒生产反义多核苷酸。或者，反义多核苷酸可包括在体外培养基中或在体内循环系统或组织液中被施用到外环境的可溶性寡核苷酸。已经表明在外环境中存在的可溶性反义多核苷酸可接近胞质并抑制特定种类mRNA的翻译。在一些实施方案中，反义多核苷酸含有甲基膦酸酯部分，或者也可以用硫代磷酸酯或邻甲基核糖核苷酸，也可用嵌合寡核苷酸(Dagle等，(1990) Nucleic AcidsRes. 18 :4751)。对于某些应用，反义寡核苷酸可含有多酰胺核酸(Nielsen等，(1991)Science254 :1497)。与反义多核苷酸有有关的一般方法，參见反义RNA和DNA(1988)，
D.A. Melton编，冷泉港实验室，冷泉港(NY)。用与ー种或多种序列互补的反义多核苷酸抑制转录、RNA加工和/或相应mRNA的翻译，以此降低所编码多肽的数量。所述反义多核苷酸可通过抑制体内一种或多种内源Ig链的形成而提供治疗作用。无论是作为可溶性的反义寡核苷酸，还是作为从反义转基因转录出的反义RNA，都可以对本发明的反义多核苷酸进行筛选以便在体内生理条件下优先与内源Ig序列杂交。最典型的是，所选的反义多核苷酸不会与由本发明重或轻链转基因编码的异源Ig序列杂交(即反义寡核苷酸对转基因Ig表达的抑制不会超过约25-35% )。杭血清抑制通过用抗一种或多种内源Ig链的抗血清注射小鼠来部分或完全抑制内源Ig链的表达(Weiss 等，(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81 :211，该文献引入本文作为參考)。对抗血清进行筛选以便其只与一种或多种内源(如小鼠)Ig链发生特异性反应，而与由本发明Ig转基因编码的异源Ig链的交叉反应最小或没有。因此，按照Weiss等人确立的方案(出处同上)，施用所选的抗血清将抑制内源Ig链的表达，但可以表达由本发明转基因编码的异源Ig链。用于抗体的适宜的抗体源包括(I)单克隆抗体，如与鼠U、Y、K或X链特异性结合但不与由本发明的人Ig转基因编码的人免疫球蛋白链反应的单克隆抗体；(2)所述单克隆抗体的混合物，以便所述混合物与一种内源Ig链上的多个表位、多个内源Ig链(如鼠U和鼠Y)或多表位和多链或内源免疫球蛋白结合；(3)多克隆抗血清或其混合物，通常所述抗血清是单特异性的，用于结合一种内源Ig链(鼠U、鼠Y、鼠K或鼠入)或多种内源Ig链，最优选的是所述抗血清与由本发明转基因编码的人免疫球蛋白链只有微不足道的结合；和/或(4)与一种或多种内源Ig链结合的多克隆抗血清和单克隆抗体的混合物，最优选的是与由本发明转基因编码的人免疫球蛋白链只有微不足道的结合。通常多克隆抗体是优选的，而且该基本上单特异性的多克隆抗体最好是由抗人免疫球蛋白抗血清生产的，即通过用衍生于非人动物(如鼠)的抗体预吸附和/或例如通过在含固定的人Ig(其中富集抗血清中具有所需抗人Ig结合的馏分；通常用低PH或离液序列高的盐溶液洗脱结合的馏分)的亲和树脂上对抗血清或其纯化的馏分进行亲和色谱来制备。可以用细胞分离和/或补体固定来增加抗体-针对的细胞的消耗，所述细胞是表达内源(鼠)免疫球蛋白链的淋巴细胞。在一个实施方案中，例如用抗体在间接体内消除表达鼠Ig的外植的造血细胞和/或从含人Ig转基因的转基因小鼠中得到的B谱系淋巴细胞。因此从含人Ig转基因(优选同时含人重链转基因和人轻链转基因)的转基因非人动物中移植造血细胞和/或B谱系淋巴细胞，并将植出的细胞与具有下列性质的抗体一起保温(I)与内源免疫球蛋白(如鼠U和/或O结合，和⑵基本上不与由转基因编码的人免疫球蛋白链结合。为了清楚起见，将所述抗体称为“抑制抗体”。移植出的细胞群选择性地消耗与抑制抗体结合的细胞，所述消耗可通过各种方法完成，如(I)物理分离以从未结合的细胞中除去抑制抗体结合的细胞(如可将抑制抗体与固体支持物或磁珠结合以固定并除去与抑制抗体结合的细胞)，(2)通过抗体依赖性的细胞杀死作用来杀死抑制抗体结合的细胞(如通过ADCC，通过补体固定、或通过与抑制抗体结合的毒素)，和(3)由抑制抗体诱导的克隆无反应性等。通常，用于产生内源Ig链的抗体抑制的抗体能够固定补体。通常优选对所述抗体进行筛选以便使之与用于间接体内/体外消耗的方便补体源，如兔或豚鼠补体很好地进行反应。对于体内消耗，通常优选抑制剂抗体在非人转基因动物中具有效应子功能；因此具有鼠效应子功能(如ADCC和补体固定)的抑制抗体通常可优选用于转基因小鼠。 另ー种情况是，将与预定内源免疫球蛋白链特异性结合的抑制抗体用于间接体内/体外消耗表达内源免疫球蛋白的淋巴细胞。将来自含人免疫球蛋白转基因的转基因非人动物的细胞外植体(如淋巴细胞样品)与抑制抗体结合，与抑制抗体特异性结合的细胞(如通过固定、补体固定等)就被消耗掉了，因此，产生一细胞亚群，表达内源(非人)免疫球蛋白的细胞(如表达鼠Ig的淋巴细胞)则被消耗掉了。将所得的消耗过的淋巴细胞种群(T细胞，人Ig阳性B细胞等)转移到免疫相容的(即MHC相容的)相同种的非人动物中，该动物基本上不能生产内源抗体(如SCID小鼠、RAG-I或RAG-2失效小鼠)。然后可用抗原免疫该重建的动物(小鼠)(或用用于免疫供体动物的抗原再免疫接种，外植物是从所述供体动物中得到的)以得到高亲和カ(亲和力成熟的)抗体和生产所述抗体的B细胞。可用所述B细胞通过常规细胞融合产生并筛选杂交瘤。可将抗体抑制作用与其它内源Ig失活/抑制方法(如Jh失效、Ch失效、D区删除、反义抑制、补偿的移码失活)结合使用。完全的内源Ig座位失活在某些实施方案中，需要产生内源Ig座位的完全失活以便不会形成含人可变区和非人(如鼠)恒定区的杂合免疫球蛋白链(如通过转基因和内源Ig序列之间的反式转换)。携帯内源重链等位基因的小鼠(该小鼠在Jh区发生功能性破坏)，只是经常表现为反式转换，通常其中由转基因编码的重排的人可变区(VDJ)表达为与内源鼠恒定区相连的融合蛋白，尽管其它反式转换连接也是可能的。为了克服这ー潜在的问题，通常需要用各种方法使内源重链座位完全失活，所述方法包括但不限于(I)通过同源重组来进行功能性破坏和/或消耗掉至少一个优选所有内源重链恒定区基因，(2)使至少ー个优选所有内源重链恒定区基因发生突变以编码ー终止密码子(或移码)，从而产生截短的或移码产物(如果是反式转换的话)，以及对于本领域专业人员是显而易见的其它方法和策略。可以用各种方法来缺失主要或全部重链恒定区基因和/或D区基因，所述方法包括通过同源重组特别是“hit-and-run”型的靶向载体而进行连续缺失等。同样，常常优选的是功能性地破坏和/或缺失至少ー个内源轻链座位(如K)以除去内源轻链恒定区基因。通常，需要使用移码的转基因，其中异源转基因在J片段含有移码而在一种或多种(优选所有的)转基因恒定区基因的起始区(即氨基末端的编码区)含有补偿移码(即，重新产生原始的解读框架)。反式转换内源IgH座位恒定基因(不含有补偿移码)会产生截短的或错义产物，所述产物会导致应被缺失或不选择的反式转换B细胞的产生，因此抑制反式转换表型。也可用反义抑制和抗体抑制来使内源Ig基因产物的表达(如鼠重和轻链序列)和/或反式转换的抗体(如人可变/鼠恒定嵌合抗体)基本上完全功能性地失活。可以用失活和抑制策略的各种组合来基本上实现内源(如鼠)Ig链表达的完全抑制。反式转换
在某些方案中，可以生产反式转换的免疫球蛋白。例如，所述反式转换的重链可以是嵌合(非鼠(人)可变区和鼠恒定区)的。可以将含所述嵌合反式转换免疫球蛋白的抗体用于需要具有非人(如鼠)恒定区的各种应用中(如抑制在宿主中的效应子功能，用于存在鼠免疫决定簇的情况，如用于结合不与人恒定区结合的ニ级抗体)。例如，就针对特定抗原而言，与鼠可变区库相比，人可变区库可能更有利。可能在进化过程中，已经对人vh、d、Jh>ん和I基因编码免疫球蛋白的能力进行了选择，所述免疫球蛋白可结合进化上重要的某些抗原；给鼠库提供进化选择压カ的抗原不同于给人库提供进化压力的那些抗原。可能存在其它库上的优点，当与鼠恒定区(如反式转换的鼠)同种型结合时，使人可变区库更有利。鼠恒定区的存在可比人恒定区有利。例如与人可变区相连的鼠Y恒定区通过反式转换可提供具有鼠效应子功能(如ADCC、鼠补体固定)的抗体，以便与预定抗原(如人IL-2受体)反应的所述嵌合抗体(优选单克隆)可用小鼠疾病模型来检测，如移植-宿主疾病的小鼠模型，在该模型中小鼠中的T淋巴细胞表达功能性人IL-2受体。随后可分离人可变区编码序列(如通过PCR扩增或自来源(杂交瘤克隆)进行cDNA克隆)并与编码所需人恒定区的序列剪接在一起以编码更适用于人治疗用途的人序列抗体，对所述抗体而言，优选使免疫原性最小。可在宿主细胞中表达含有所得全长人编码序列的多核苷酸(如在哺乳动物中从表达载体开始表达)并将其纯化用于药物制剂。对于某些应用，可直接用嵌合抗体而无需用人恒定区取代鼠恒定区。反式转换的嵌合抗体的其它改变和用途对于本领域专业人员是显而易见的。本发明提供了含B淋巴细胞的转基因非人动物，所述B淋巴细胞表达嵌合抗体，所述抗体通常是人重链转基因和内源鼠重链恒定区基因之间的反式转换而产生的。所述嵌合抗体含有人可变区序列和鼠恒定区，通常是鼠转换的(即非レ、非6)同种型。如果编码人可变区和人恒定区基因的人重链和其轻链转基因均被整合，则能够产生与预定抗原反应之嵌合抗体的转基因非人动物也能生产全部的人抗体序列。最典型的是，所述动物是功能性破坏的重链座位和/或轻链座位纯合的，但保留了一个或多个能够进行反式转换的内源重链恒定区基因(如Y、a、O并通常保留顺式连接的增强子。用预定抗原(通常与佐剂结合)免疫接种所述小鼠，产生含有可检测量嵌合抗体的免疫反应，所述嵌合抗体含有由与鼠恒定区序列相连的人可变区序列组成的重链。通常所述免疫动物的血清会含有浓度约至少为I U g/ml、经常约至少10 V- g/ml、常常至少30 u g/ml或高达50-100 u g/ml或更多的嵌合抗体。含有包含嵌合人可变/小鼠恒定区重链之抗体的抗血清通常也含有包含人的变/人恒定区(完全的人序列)重链的抗体。嵌合反式转换的抗体通常含有(I)由人可变区和鼠恒定区(通常是鼠Y)组成的嵌合重链，和(2)人转基因编码的轻链(通常K)或鼠轻链(通常K失效背景中的入)。所述嵌合反式转换的抗体通常与预定的抗原(如免疫原)结合，亲和カ为约至少I X IO7M'优选亲和カ为约至少5 X IO7M'更优选亲和カ为至少ixio^-ixkAt1或更高。通常预定的抗原是人蛋白质，如人细胞表面抗原(如⑶4、⑶8、IL-2受体、EGF受体、PDGF受体)，其它人生物大分子(如凝血调节蛋白、蛋白C、碳水化合物抗原、sialyl Lewis抗原、L-选择蛋白)或非人疾病相关的大分子(如细菌LPS、病毒颗粒衣壳蛋白或包膜糖蛋白)等。
本发明提供了含基因组的转基因非人动物，所述基因组含有(I)纯合的功能性破坏了的内源重链座位，所述座位含有至少ー个能够反式转换的鼠恒定区基因(如与功能性转换重组序列并通常与功能性增强子顺式连接的恒定区基因)，(2)能够进行重排以编码并表达功能性人重链可变区并能够反式转换的(如，含有顺式连接的RSS)人重链转基因；可选择性地含有(3)能够进行重排以编码功能性人轻链可变区并表达人轻链序列的人轻链(如，K)转基因；还可选择性地含有(4)纯合的功能性破坏了的内源轻链座位(K，优选K和X);并可选择性地含有(5)含有包含嵌合重链之抗体的血清，所述嵌合重链由人转基因编码的人可变区序列和内源鼠重链恒定区基因编码的鼠恒定区序列(如，Y I、
Y2a、y 2b、y 3)组成。所述转基因小鼠还可含有含嵌合抗体的血清，所述嵌合抗体与预定的人抗原(如⑶4、⑶8、CEA)结合，亲和カ为约至少I X IO4M'优选亲和カ为约至少5X IO4M'更优选亲和力为至少IX IOl1至IXKAT1或更高。通常可制备所产单克隆抗体的亲和カ至少为SXlO7M-1的杂交瘤。含由鼠恒定区和人可变区组成的重链的、并经常能够与非人抗原结合的嵌合抗体也可存在于血清或从杂交瘤分泌的抗体中。在一些改变中，需要产生转基因小鼠，所述转基因小鼠保留了完整重链恒定区基因的内源小鼠重链座位已经失活了，并含有能够进行反式转换的人重链转基因，另外可选择性地含有人轻链转基因，所述轻链转基因可选择性地含有一个或多个失活的内源小鼠轻链座位。所述小鼠通过反式转换可有利于生产B细胞，所述B细胞能够表达含全部人重链的抗体以及含嵌合(人可变/小鼠恒定区)重链的抗体。所述小鼠的血清应含有包含全部人重链的抗体和包含嵌合(人可变/小鼠恒定区)重链的抗体，所述重链优选与完整人轻链组合。可从所述小鼠的B细胞产生杂交瘤。通常，可通过反式转换生产所述嵌合抗体，其中编码人可变区(如由体内生产性V-D-J重排编码的)与人恒定区(通常是人iO的人转基因，与非转基因免疫球蛋白恒定基因转换序列(RSS)进行转换重组，由此将转基因编码的人可变区与不由所述转基因编码的重链恒定区(通常是内源鼠免疫球蛋白重链恒定区或由第二转基因编码的异源(如人)重链恒定区)可操作相连。而顺式转换指通过转基因内RSS元件的重组而进行的同种型转换，反式转换指转基因RSS与转基因外RSS元件(常常位干与含所述转基因之染色体不同的染色体上)之间的重组。反式转换通常发生于被表达转基因重链恒定区基因的RSS与内源鼠恒定区基因(非U同种型，通常是Y)的RSS或在第二转基因(通常整合在另外的染色体上)中所含的人恒定区基因的RSS之间。当反式转换发生于被表达转基因重链恒定区基因(如U )的RSS与第二转基因上所含的人重链恒定区基因的RSS之间时，会生产出基本上含有完整人序列的非嵌合抗体。例如但并非限制，可将编码人重链恒定区(如Yl)的多核苷酸和可操作相连的RSS(如YlRSS)导入(如转染进)从转基因小鼠B细胞(或B细胞种群)产生的杂交瘤细胞中，所述B细胞表达含转基因编码的人y链的抗体。可凭所得的杂交瘤细胞是否存在导入的多核苷酸和/或表达含重链的反式转换的抗体而对杂交瘤进行筛选，所述重链带有人U链可变区(个体型/抗原反应性)和由导入的多核苷酸序列编码的恒定区(如人Y1)。在转基因编码的人U链的RSS与编码下游同种型(如Yl)的导入的多核苷酸RSS之间的反式转换重组可产生反式转换的抗体。本发明还提供了生产所述嵌合反式转换之抗体的方法，所述方法包括用预定抗原免疫接种转基因小鼠的步骤，所述转基因小鼠的基因组含有(I)纯合的功能性破坏了的内源重链座位，所述座位含有至少ー个能够反式转换的鼠恒定区基因(如，Y 2a、y 2b,Yl> Y3), (2)能够进行重排以编码有功能的人重链可变区并表达人重链序列而且能够进 行同种型转换(和/或反式转换)的人重链转基因；可选择性地含有(3)能够进行重排以编码有功能的人轻链(如，K )可变区并表达人轻链序列的人轻链(如，K)转基因；还可选择性地含有(4)纯合的功能性破坏了的内源轻链(K，优选K和X)座位；并可选择性地含有(5)含有包含嵌合重链之抗体的血清，所述嵌合重链由人转基因编码的人可变区序列和内源鼠重链恒定区基因编码的鼠恒定区序列(如，YU Y 2a, y 2b, y 3)组成。亲和カ标记转换同种型的筛选有利的是，反式转换(和顺式转换)与体细胞突变有夫。体细胞突变扩大了由B细胞克隆子代编码的抗体的亲和性范围。例如由进行了转换(反式或顺式)的杂交瘤细胞生产的抗体，其抗原结合亲和性的范围大于在未进行转换的杂交瘤细胞中的抗体的。因此，可从表达第一抗体的杂交瘤细胞群(通常是克隆的)(所述细胞群表达含一重链的第一抗体，所述重链含有在多肽中与第一人重链恒定区(如U)相连的人重链可变区)中筛选杂交瘤细胞克隆变体，所述变体表达含有在多肽中所述第一人重链可变区与第二重链恒定区(如人Y、a或e恒定区)相连的重链的抗体。可通过产生体外顺式转换的自然克隆变异、通过施用促进同种型转换的试剂如T细胞衍生的淋巴因子(如IL-4和IFNy)诱导类型转换(反式或顺式)、通过导入含功能性RSS和异源(如人)重链恒定区基因的多核苷酸作为反式转换的底物或通过上述方法的结合等可生产所述克隆变体。通常将含人下游同种型恒定区(如Y I、Y 3等)和可操作连接的RSS的多核苷酸导入杂交瘤细胞以促进通过反式转换机制的同种型转换。类型转换和亲和力成熟发生在由本发明转基因动物产生的B细胞的同一种群中。因此可将鉴定类型转换的B细胞(或从其衍生的杂交瘤)作为得到高亲和カ单克隆抗体的筛选步骤。可以用各种方法促进类型转换如顺式转换(基因内转换)、反式转换或两者。例如可将含有U和Y恒定区基因以及相关RSS元件和转换调节元件(如无效转录物启动子)的单个连续人基因组片段用作转基因。但是，所需单个连续人基因组片段的某些部分可能很难有效地克隆，例如由于当在克隆宿主中复制时不稳定等问题；具体地说，证明S与Y3之间的区域很难有效克隆，特别是含U基因、Y3基因、V基因、D基因片段和J基因片段的连接片段。例如不连续的人转基因(小基因)由人U基因、人Y 3基因、人V基因、人D基因片段和人J基因片段组成，其中可带有ー个或多个间插序列(内含子)或其它非必需序列(如ー个或多个V、D和/或J片段和/或ー个或多个非U恒定区基因)的缺失。与含有免疫球蛋白有效表达和转换所必需的所有元件的单个连续基因组DNA片段相比，所述小基因有ー些优点。例如所述小基因不需分离大的DNA片段，所述大DNA片段可能含有很难克隆的序列(如不稳定的序列、毒序列等)。此外含进行顺式或反式转换所必需的同种型转换元件(如人Y无效转录物启动子)的小座位对于进行体内体细胞突变和类型转换也有利。由于许多真核DNA序列很难克隆，因此删除非必需序列是有利的。在一种改变中，从衍生于转基因小鼠B细胞的杂交瘤池中，通过筛选得到生产具有高亲和カ(如至少I X IO7M'优选至少I X IO8M'更优选至少I X IO9M^1或更高)之抗体的杂交瘤克隆，所述转基因小鼠含有能够进行同种型转换(见上文)并基本上没有内源鼠重链座位(能够进行生产性(框架内)V-D-J重排)的人重链转基因，所述杂交瘤表达含重链的抗体，所述重链含有在多肽中与人(或小鼠)非U重链恒定区相连的人重链可变区；将所述抗体称为“转换的抗体”，因为它们含有作为体内顺式转换和/或反式转换或细胞培养结果的“转换的重链”。生产所述转换抗体的杂交瘤通常可进行体细胞突变，所述杂交瘤 池通常具有很宽的抗原结合亲和性，从中可筛选分泌高亲和カ抗体的杂交瘤。通常通过包括两个步骤的方法，可筛选分泌人序列抗体的杂交瘤，所述人序列抗体具有与预定抗原的主要结合亲和力(大于I X IO7IT1-I X IO8IT1),而且其中所述人序列抗体含有人免疫球蛋白可变区。一个步骤是鉴定并分离能分泌含有转换的重链免疫球蛋白的杂交瘤细胞(如通过将杂交瘤细胞与固定的免疫球蛋白结合，所述固定的免疫球蛋白与转换的重链特异性结合，并基本上不与未转换的同种型(如y)结合)。另ー步骤是鉴定以主要结合亲和カ与预定抗原结合的杂交瘤细胞(如通过杂交瘤克隆上清液的ELISA、使用标记抗原的FACS分析等)。通常，在鉴定与预定抗原结合的杂交瘤细胞前，进行分泌转换抗体的杂交瘤的筛选。分离表达与预定抗原具有主要结合亲和力的转换抗体的杂交瘤细胞，然后在本领域已知的适宜生长条件下培养(通常为单个选择的克隆)。可选择的，所述方法还可包括在适宜于表达单克隆抗体的条件下培养所选克隆的步骤；收集所述单克隆抗体并可将其用于治疗、预防和/或诊断目的。通常，所选的杂交瘤克隆可作为DNA或RNA源，用于分离编码与预定抗原结合的(或能使其与之结合的)免疫球蛋白(如可变区)的免疫球蛋白序列。随后，可(如通过PCR扩增或从源(如杂交瘤克隆)进行cDNA克隆)分离人可变区编码序列，然后与编码所需人恒定区的序列剪接在一起以编码更适用于人治疗用途的人序列抗体，在所述治疗用途中优选抗体的免疫原性最小。可将含有所得全长人编码序列的多核苷酸在宿主细胞(如来自哺乳动物细胞中的表达载体)中表达，然后纯化用于药物制剂。异增强子能够编码人免疫球蛋白(如重链)的异源转基因最好含有顺式连接的增强子，所述增强子不是衍生于小鼠基因组，和/或不是与所述异源转基因的外显子以顺式天然相连。例如，人K转基因(如K小座位)最好含有人Vk基因、人Jk基因、人Ck基因和ー异增强子，通常所述异增强子含有人重链内含的增强子和/或鼠重链内含子增强子，通常它们位于Jk基因和Ck基因之间，或位于Ck基因下游。例如可将小鼠重链J-U内含子增强子(Banerji 等，(1983)Cell 33 :729)分离在质粒 pKVe20. 9kb XBaI 片段上(參见下文)。可将人重链J-U内含子增强子(Hayday等，(1984) Nature 307 :334)分离为I. 4kb MluI/HindIII片段(见下文)。将有转录活性的异增强子，如主要由与小鼠J-U内含子增强子顺式相连的人J-U内含子增强子组成的结合异增强子加到转基因中，这样可以高水平地表达所述转基因，特别是在所述转基因编码轻链如人K的情况下。同样，最好将大鼠3’增强子包含在能够编码人重链的小座位构建体中。具体的优选实施方案本发明优选的实施方案是含至少ー种、通常2-10、有时25-50或更多拷贝的实施例12所述转基因(pHCl或pHC2)的动物，所述动物是用含单拷贝的实施例5、6、8或14中所述轻链转基因的动物和实施例10所述Jh缺失动物繁殖的后代繁殖的。将动物培育至这三个特征均纯合。所述动物具有下列基因型单拷贝(每个单倍体的染色体组)的人重链未重排的小座位(实施例12中所述的)、单拷贝(每个单倍体的染色体组)重排的人K链 构建体(实施例14所述的)、并在除去所有功能性1片段的各内源小鼠重链座位上有缺失(实施例10所述)。用Jh片段缺失(实施例10)纯合的小鼠繁殖所述动物以产生Jh缺失纯合和人重链和轻链构建体半合的后代。将所得动物用抗原注射并用其生产抗这些抗原的人单克隆抗体。就人重和轻链而言，从所述动物中分离的B细胞是单特异性的，因为它们只含各基因的ー个拷贝。此外，就人或小鼠重链而言，它们是单特异性的，因为由于按实施例9和12所述缺失了 Jh区，所以两个内源小鼠重链拷贝均是非功能性的。另外，就人或小鼠轻链而言，B细胞的主要馏份也是单特异性的，因为单拷贝的重排的人K轻链基因的表达从等位基因和同种型上，在B细胞的主要馏份中排除了内源小鼠K和\链基因的重排。优选实施方案的转基因小鼠可生产含有库的大部分的免疫球蛋白，理想的是基本上与天然小鼠的相似。因此，例如在内源Ig基因已失活的实施方案中，总的免疫球蛋白水平为约0. l-10mg/ml血清，优选0. 5-5mg/ml,理想的至少约I. Omg/ml。在已经将能够使IgM转换成IgG的转基因导入到转基因小鼠中后，成年小鼠血清IgG与IgM的比例优选为约10 I。当然，在未成熟的小鼠中，IgG与IgM的比例要低些。通常，约10%，优选40-80%以上的脾和淋巴结B细胞仅仅表达人IgG蛋白质。该库理想的是接近非转基因小鼠的，通常至少高达约10%，优选25-50%或更多。通常，主要根据导入到小鼠基因组中的不同V、J和D区的数量，可生产至少约一千个不同的免疫球蛋白(理想的是IgG)，优选IO4-IO6或更多。这些免疫球蛋白通常识别一半或更多的高抗原性蛋白质，包括但不限于鸽子细胞色素C、鸡溶菌酶、商陆促分裂原、牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、流感血凝素、葡萄球菌蛋白A、精鲸肌红蛋白、流感神经氨酸酶和\阻遏物蛋白。其中ー些免疫球蛋白与预选抗原的亲和カ至少为约IO7M'优选IO^r1-KAr1或更闻。在一些实施方案中，优选产生具有预定库的小鼠，以对预定抗原的抗体反应所代表的V基因进行有限的筛选。具有预定库的重链转基因可含有例如人Vh基因，该基因在人中对预定抗原的抗体反应中被优先使用。或者，由于各种原因(如编码针对预定抗原的高亲和カV区的可能性低；进行体细胞突变和亲和力加强的倾向低；或对某些人是致免疫的)，可从确定的库中除去ー些Vh基因。由于来自与转基因动物不同的生物种，因此在含各重或轻链基因片段的转基因重排之前，如通过杂交或DNA测序可很容易地鉴定出所述基因片段。可用预定抗原如跨膜蛋白、细胞表面大分子或其它需要人抗体的抗原(如TNF、LPS等)免疫接种本发明的转基因小鼠。所述小鼠将生产B细胞，所述B细胞经转基因内转换重组(顺式转换)进行了类型转换并表达与预定抗原反应的免疫球蛋白。所述免疫球蛋白可以是人序列抗体，其中重和轻链多肽由人转基因序列编码，所述转基因序列可包含通过体细胞突变和V区重组连接而产生的序列以及种系编码的序列；尽管由于体细胞突变和不同的V-J和V-D-J重组连接，可能存在其它非种系序列，但可以认为这些人序列免疫球蛋白基本等同于由人\或Vh基因片段和人叉或Jh片段编码的多肽序列。就所述人序列抗体而言，各链的可变区通常至少80%由人种系V、J (在重链的情况下，还包括D片段)编码；通常至少85%的可变区由转基因上的人种系序列编码；经常90%或95%或更多的可变区由转基因上的人种系序列编码。但是，由于通过体细胞突变和VJ以及VDJ连接而导入了非种系序列，因此人序列抗体通常含有一些不由小鼠种系中的人转基因内的人V、D或J基因片段编码的可变区序列(而在恒定区序列中不常见)。通常，所述非种系序列(或各个核苷 酸位置)在⑶R中或靠近⑶R处成簇，或是在已知体细胞突变成簇的区中。与预定抗原结合的人序列抗体可产生于同种型转换，以便产生含人序列Y链(如
Y1> Y 2a, Y 2b或Y 3)和人序列轻链(如K)的人抗体。所述同种型转换的人序列抗体经常在可变区中含有ー个或多个体细胞突变，体细胞突变经常在CDR的约10个残基处或之内，这是亲和力成熟和由于抗原特别是随后ニ级(或随后)抗原攻击而选择B细胞的結果。这些高亲和カ人序列抗体的结合亲和力至少为I X IO9M'—般亲和カ为约至少SXlO9M-1,通常亲和カ为至少I X IOkiM'有时为5 X IOkT1至I X IO11M^1或更高。可将所述高亲和カ人序列抗体制备成与人抗原如CD4等人大分子(如人跨膜或细胞表面蛋白或其它细胞表面抗原)有高结合亲和力。可将来自所述小鼠的B细胞用于产生表达高亲和力(大于2X109M_i)的单克隆人序列抗体的杂交瘤，该人序列抗体可以抗各种抗原，包括人蛋白质如⑶4等。可用这些杂交瘤生产含有免疫球蛋白的组合物，所述免疫球蛋白与预定人抗原的亲和カ常数(Ka)为至少SXio9Ir1,其中所述免疫球蛋白由下列成分组成具有下列组成的人序列轻链(I)含有多肽序列的轻链可变区，所述多肽序列基本上等同于由人\基因片段和叉片段编码的多肽序列，和(2)含有多肽序列的轻链恒定区，所述多肽序列基本上等同于人Q基因片段编码的多肽序列；和有下列组成的人序列重链(I)含有多肽序列的重链可变区，所述多肽序列基本上等同于由人Vh基因片段、或D区以及人Jh片段编码的多肽序列；和⑵含有多肽序列的恒定区，所述多肽序列基本上等同于人Ch基因片段编码的多肽序列。通常人序列重链和人序列轻链分别由人重链转基因和人轻链转基因编码，所述转基因被分别整合到小鼠细胞基因组中。但是，两个链可由ー个转基因编码，或ー个或两个链由多个转基因编码，如由从含Vh排列的YAC的V基因片段衍生的人重链转基因(如HC2)编码，所述Vh排列不被整合在与小鼠种系中人重链转基因相同的座位上。在一实施方案中，组合物含有免疫球蛋白，所述免疫球蛋白含有具有K恒定区的人序列轻链和具有Y恒定区的人序列重链。所述小鼠(和从其衍生的杂交瘤)是免疫球蛋白的来源，所述免疫球蛋白与预定人抗原的亲和カ常数(Ka)为至少IXlOuTl,其中所述免疫球蛋白由下列成分组成有下列组成的人序列轻链(I)含有多肽序列的轻链可变区，所述多肽序列基本上等同于人\基因片段和叉片段编码的多肽序列，和⑵含有多肽序列的轻链恒定区，所述多肽序列基本上等同于人Q基因片段编码的多肽序列；和有下列组成的人序列重链(I)含有多肽序列的重链可变区，所述多肽序列基本上等同于人Vh基因片段、或D区以及人Jh片段编码的多肽序列；和⑵含有多肽序列的恒定区，所述多肽序列基本上等同于人Ch基因片段编码的多肽序列。本发明提供了具有下列基因型的转基因小鼠一对纯合的功能性破坏了的内源 重链等位基因、一对纯合的功能性破坏了的内源轻链等位基因、至少ー个拷贝的异源免疫球蛋白轻链转基因和至少ー个拷贝的异源免疫球蛋白重链转基因，其中所述动物在用人抗原免疫后产生抗体反应，其中所述抗体反应含有与预定人抗原的亲和カ常数(Ka)为至少2X109M_1的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白由下列成分组成有下列组成的人序列轻链(I)含有多肽序列的轻链可变区，所述多肽序列基本上等同于人\基因片段和叉片段编码的多肽序列，和⑵含有多肽序列的轻链恒定区，所述多肽序列基本上等同于人Q基因片段编码的多肽序列；和有下列组成的人序列重链(I)含有多肽序列的重链可变区，所述多肽序列基本上等同于人Vh基因片段、或D区以及人Jh片段编码的多肽序列；和⑵含有多肽序列的恒定区，所述多肽序列基本上等同于人Ch基因片段编码的多肽序列。所述转基因小鼠可生产人序列免疫球蛋白，所述免疫球蛋白与至少ー种人体细胞上的人表面或跨膜蛋白质结合，其中所述免疫球蛋白与所述人表面或跨膜蛋白质结合的亲和力常数(Ka)为Lsxioi1-LsxiokT1ij所述表面或跨膜蛋白质的ー个实例是⑶4，尽管根据需要也可以使用其它蛋白质。通过扩展转基因小鼠中人可变区基因片段库的方法，促进了抗预定抗原的高亲和力人序列抗体的发展，所述转基因小鼠具有含有整合的人免疫球蛋白转基因的基因组，所述方法包括将含有V区基因片段的V基因转基因导入到基因组中，所述V基因转基因不存在于所述被整合的人免疫球蛋白转基因中。通常V区转基因是酵母人工染色体，该染色体含有部分人Vh或VJVk)基因片段排列，所述排列可能在人基因组中天然存在或可通过重组方法分别剪接在一起，所述排列可含有无序的或删除的V基因片段。通常在YAC中含有至少5个或更多的功能性V基因片段。在该改变中，可通过V库扩展法生产转基因小鼠，其中所述小鼠表达免疫球蛋白链，所述免疫球蛋白链含有由V区转基因上的V区基因片段编码的可变区序列和由人Ig转基因编码的C区。通过V库扩展法，可以产生具有至少5个不同V基因的转基因小鼠；小鼠可含至少24个V基因或更多。当然有些V基因片段可能是无功能的(如假基因等)；如果需要可以保留这些片段或通过本领域专业人员已知的重组方法将其选择性地缺失。在小鼠种系经过遗传工程处理使之含有带扩展V片段库的有功能的YAC后，所述V片段库基本上不存在于含J和C基因片段的人Ig转基因中，将所述特征繁殖并培育到其它遗传背景中，包括将具有扩展的V片段库的功能性YAC培育到含有不同人Ig转基因的小鼠种系中的背景。可将具有扩展的V片段库的多功能性YAC培育到种系中以便与人Ig转基因(或多个人Ig转基因)一起发挥作用。尽管本文称为YAC转基因，但整合到基因组中的所述转基因基本上不含酵母序列，如酵母自我复制所需的序列；在酵母中复制后，不再需要的话(即在导入小鼠ES细胞或小鼠前受精卵之前)，也可将所述序列通过遗传工程方法(如限制消化和脉冲场凝胶电泳或其它适宜的方法)除去。本发明还提供了扩增人序列免疫球蛋白表达之特征的方法，该方法包括培育具有人Ig转基因，或也含有具有扩展的V片段库的功能性YAC的转基因小鼠。Vh和\基因片段均可在YAC上。实践者可将转基因小鼠培育到任何所需的背景中，包括含其它人转基因的背景，所述人转基因含有人Ig转基因和/或编码其它人淋巴细胞蛋白的转基因。本发明还提供了由转基因小鼠生产的高亲和カ人序列免疫球蛋白，所述转基因小鼠含有扩展的V区库的YAC转基因。尽管前文描述了本发明转基因动物的优选实施方案，但本文公开的内容，更具体地说，由实施例中描述的转基因定义了其它实施方案。可定义四种转基因动物 I.含未重排重链和重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物。II.含未重排重链和未重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物。III含重排重链和未重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物。IV含重排重链和重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物。在这几种转基因动物中，优选的顺序是II > I > III > IV，其中通过同源重组(或其它方法)已经使内源轻链基因(或至少K)失效，以及I > II > III > IV，其中内源轻链基因未被失效并必须通过等位排斥而显性化。如上文所讨论的，本发明提供了用于治疗人疾病的人序列单克隆抗体。单克隆抗体的治疗用途參见如 Larrick 和 Bourla, Journal of Biological Response Modefiers,5 :379-393,该文献引入本文作为參考。人单克隆抗体的用途包括治疗自身免疫性疾病、癌、感染性疾病、移植排斥、血液病如凝集紊乱和其它疾病。可将本发明的抗体通过蛋白质传递药物领域已知的任何方法施用给患者。抗体特别适用于胃肠道外给药(即皮下、肌肉内或静脉内给药)。本发明的药物组合物也适用于通过其它药物传递方法施用(參见如Langer，Science, 249 :1527-1533 (1990))。用于胃肠道外给药的药物组合物通常含有单克隆抗体溶解于可药用载体优选含水载体中的溶液。可以使用各种含水载体，如水、缓冲液、0. 4%盐水、0. 3%甘油等。这些溶液是无菌的并通常不含颗粒物质。可通过常规的熟知的消毒技术将这些组合物消毒。所述组合物可含有接近生理条件所需的可药用添加成分，如PH调节剂和缓冲剂、张カ调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。根据所选的具体给药方式，抗体在这些制剂中的浓度可在很宽的范围内变化，即从不到约0. 5%，通常至少约0. 1% -I. 5%或2.0% (重量)，而且主要以液体体积、粘度来选择制剂中的抗体浓度。制备胃肠道外给药的组合物的实际方法是本领域专业人员已知的，并在例如Remington’ sPharmaceuticalSciences 17th Ed. Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania(1985)〈该又献gI入本文作为參考)中有更详细的描述。可以施用含本发明抗体或其混合物的组合物以用于预防和/或治疗。在治疗应用中，以足以治愈或至少部分抑制其感染和其并发症的量，将组合物施用给患者。将足以达到该目的的量定义为“治疗有效量”。有效达到该目的的量通常为约0. 05mg/kg体重-约5mg/kg体重,优选约0. 2mg/kg-体重至I. 5mg/kg体重。
在某些情况下，需要修饰本发明的免疫球蛋白分子以改变其生物活性。例如可将免疫球蛋白与其它化疗药物直接或间接结合。可结合各种化疗药物作为靶。例如可结合的抗炎药包括免疫调节剂、血小板激活因子(PAF)拮抗剂、环氧合酶抑制剂、脂质氧合酶抑制剂和白细胞三烯拮抗剂。一些优选的结合基包括环孢菌素A、消炎痛、naproxen、FK-506、酶酚酸等。同样，抗氧化剂如过氧化物歧化酶也可用于治疗再灌注损伤。同样，抗癌剂如柔毛霉素、阿霉素、长春花硷、博莱霉素等也可使用。还可将本发明的抗体用于将两亲物质(amphipaths)(如脂质体)导向患者体内位点。在这些制剂中，待传递的药物被作为脂质体的一部分掺入，在该脂质体中包埋了人单克隆抗体。本发明的人序列单克隆抗体是有用的，部分是因为它们特异性地结合它们所针对的预定抗原。当预定抗原是人抗原(即人蛋白质或其片段)时，如果本发明的人免疫球蛋白也与非人动物中的同源抗原结合，则本发明的抗体就是有利的，所述非人动物特别是指常用于药物试验(如生物活性、药物动力学和安全性的临床前试验)的动物。这些动物包 括小鼠、兔、大鼠、狗、猪，特别是非人灵长类如猩猩、类人猿和猴(如恒河猴和cynomolgus猴)。在试验动物中识别抗原的能力对于确定特异性结合对免疫球蛋白生物分布的影响是特别有用的。同源抗原是有下列性质的抗原(i)结构(如氨基酸序列)基本上类似于人抗原(即动物同源蛋白质的氨基酸序列与人蛋白质通常有约50%的一致性，优选至少约70%的一致性，最佳为至少约80%或更高的一致性)；(ii)与人抗原有基本相同的功能；和(iii)通常在与人抗原相同的细胞部分上发现。人和动物同源抗原通常(但不总是)有相同的名称。同源抗原的实例包括人微管蛋白和小鼠微管蛋白、人CD4和恒河猴CD4以及人IgG和大鼠IgG0另ー方面，本发明提供了结合抗原的人单克隆抗体，所述单克隆抗体含有至少ー条由人工基因编码的多肽。人工基因包括在体外通过化学或酶促方法合成的编码多肽的核酸片段和人工基因的子代(通过复制)，即全部合成的核酸，所述化学或酶促方法不需要细胞衍生的模板核酸链(如从细菌细胞和免疫或杂交瘤细胞达到的核酸模板)。尽管在遗传工程中，用短的合成核酸作为引物、接头等是常规的，但还可以通过化学和/或酶促方法产生完全合成的长为30、50或更多碱基的编码蛋白质的核酸。本发明的人工基因可包括合成的核酸区和细胞衍生的核酸区。人工基因的合成核酸区通常至少约50个碱基，一般至少约100个碱基，常常至少约200个碱基，经常的是至少约250个碱基，且通常超过300个碱基或400个碱基。通常合成的核酸区编码可变基因片段或其部分，如CDR区，恒定区通常由细胞衍生的核酸编码。用编码多肽的人工基因，可方便地表达免疫球蛋白多肽(即免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链)。通常人工基因与转录启动子序列，如衍生于免疫球蛋白基因或病毒(如SV40、CMV、HIV、RSV)的启动子序列或杂种启动子可操作相连。还可将人工基因与其它序列如聚腺苷酸化序列和内含子相连。表达免疫球蛋白多肽的ー种方法包括将编码免疫球蛋白多肽ー个区(如可变区或其片段)的合成核酸插入到载体中，所述载体编码免疫球蛋白链的剩余片段或部分(如U、Y、Y 2、Y 3、Y 4、S、e、a p a 2)，以及启动子(如CMV(细胞肥大病毒)启动子)、聚腺苷酸化或其它序列。构建所述载体以便在导入细胞后，载体序列的细胞转录和翻译产生免疫球蛋白多肽。用人工基因可构建有功能的人序列免疫球蛋白重和轻链基因以及多肽，并用其生产具有所需特异性(如与预定抗原的结合特异性)的免疫球蛋白。这可通过构建人工基因来完成，所述人工基因编码与细胞或杂交瘤表达的多肽基本相似的免疫球蛋白多肽，所述细胞或杂交瘤来自用预定抗原免疫的转基因动物。因此，本发明提供了编码免疫球蛋白多肽的人工基因以及用人工基因生产人序列免疫球蛋白的方法。根据该方法，将转基因动物(如具有一对纯合的功能性破坏了的内源重链等位基因、一对纯合的功能性破坏了的内源轻链等位基因、至少ー个拷贝的人免疫球蛋白轻链转基因和至少ー个拷贝的人免疫球蛋白重链转基因的转基因小鼠)用预定的抗原如人抗原免疫接种。然后从发生免疫球蛋白基因重排的ー个细胞或细胞群中收集或分离核酸，优选mRNA，确定编码免疫球蛋白重和/或轻链(特别是V片段)的核酸序列或其部分。用该序列资料作为人工基因序列的基础。序列确定通常需要分离所需基因或cDNA的至少一部分，如重排的人转基因的一部分或编码免疫球蛋白多肽的相应cDNA的一部分。通常这要求克隆编码人免疫球蛋白多肽的DNA，或优选mRNA (即cDNA)。用标准技术(參见Sambrook等，(1989)分子克隆实验室 手 ，1-3卷,冷泉港出版社,该文献引入本文作为參考)完成克隆。例如通过polyA+mRNA,优选膜相关mRNA的反转录来构建cDNA文库，然后用对人免疫球蛋白多肽基因序列特异的探针筛选所述文库。但在优选的实施方案中，用聚合酶链反应(PCR)扩增编码所需免疫球蛋白基因片段(如轻链可变片段)的cDNA (或全长cDNA的一部分)。由于本领域专业人员很容易得到人免疫球蛋白多肽基因的序列，因此可很容易设计出特异性地与人免疫球蛋白基因或其片段杂交的探针或扩增该人免疫球蛋白基因或其片段用的PCR引物。參见例如Taylor等,Nuc. Acids. Res.，20 :6287 (1992)，该文献引入本文作为參考。此外，转基因小鼠的人转基因序列通常对实施者而言是已知的，因此可以选择与转基因的适宜区杂交的引物序列。很容易将扩增的序列克隆到任何适宜的载体，如表达载体、小基因载体或噬菌体展示载体中。应理解所用的具体克隆方法并不重要，只要它可以确定所需免疫球蛋白多肽某ー部分的序列即可。如本文所述，将经克隆、扩增、标记的或不同于背景以便所需核酸的序列可被测定的核酸看作是分离的核酸。用于克隆并测序的RNA的一个来源是通过获得转基因小鼠的B细胞并将B细胞与无限增殖细胞融合而得到的杂交瘤。使用杂交瘤的优点是很容易对杂交瘤进行筛选，并且杂交瘤生产所需的人单克隆抗体。或者可从被免疫动物的B细胞(或全脾)中分离RNA。当使用杂交瘤以外的来源时，还需要筛选编码具有特异性结合特征之免疫球蛋白或免疫球蛋白多肽的序列。用于所述筛选的ー种方法是使用噬菌体展示技木。噬菌体展示描述于如 Dower 等，WO 91/17271, McCafferty 等，WO 92/01047,以及 Caton 和 Koprowski, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 87 :6450-6454 (1990)，所述文献均引入本文作为參考。在采用适宜噬菌体展示技术的ー个实施方案中，分离来自被免疫的转基因小鼠的cDNA(如全脾cDNA)，用聚合酶链反应扩增cDNA序列，所述序列编码部分免疫球蛋白多肽的一部分，如CDR区，然后将扩增的序列插入到噬菌体载体中。用标准技术如淘选来鉴定编码所需肽，如具有所需结合特征的可变区肽的cDNA。然后确定经过扩增或克隆的核酸序列。通常确定编码免疫球蛋白多肽全部可变区的序列，但有时只确定部分可变区如CDR-编码区部分就足够了。通常测序的部分至少30个碱基长，优选对至少1/3或至少一半可变区的编码碱基进行测序。
可对从cDNA文库分离的克隆进行测序，或使用PCR吋，在亚克隆扩增序列后进行测序或对扩增的片段进行直接PCR测序。用标准技术(參见例如Samtoook等，(1989)分子克隆实验室手册'，1-3卷,冷泉港出版社，以及Sanger,F.等，(1977)Proc. Natl. Acad. Sci.USA74 :5463-5467,该文献引入本文作为參考)完成测序。将克隆的核酸序列与公开的人免疫球蛋白基因和cDNA序列进行比较，根据已测序的区域，本领域专业人员很容易确定⑴杂交瘤免疫球蛋白多肽(包括重链的同种型)的种系片段用法和(ii)重和轻链可变区序列，包括因N-区添加和体细胞突变而产生的序列。免疫球蛋白基因序列资料的ー个来源是国家生物技术信息中心，国家药物库，国家健康研究所，Bethesda, Md。在另ー实施方案中，通过直接蛋白质测序来确定所需免疫球蛋白的氨基酸序列。可构建ー人工基因，所述人工基因含有等同于或基本上类似于至少部分表达免疫球蛋白之基因(即重排的转基因)的序列。同样，人工基因可编码等同于或基本相似于由重排转基因的已被测序部分编码的多肽的多肽。遗传密码的简并性使得相同的多肽可以由 多个核酸序列编码。有时需要改变核酸序列，例如以导入限制位点、改变密码子的使用，以反映特定的表达系统，或除去糖基化位点。另外，可在杂交瘤序列中导入改变以改变免疫球蛋白的特征(如结合特征)。例如，可将改变导入特别是重和轻链可变区的CDR区中，以提高免疫球蛋白与预定抗原的亲和カ。构建合成核酸的方法是熟知的。尽管全部都用化学合成是可能的，但通常用混合的化学-酶促合成法，其中将化学合成的寡核苷酸用于连接反应和/或聚合酶链反应以得到较长的多核苷酸。在最优选的实施方案中，用所选的重叠引物完成聚合酶链反应以便扩增的结果是含有人工基因所需之序列的DNA。可用固相或在溶液中合成本发明的寡核苷酸。通常固相合成是优选的。有关通过亚磷酸三酷、磷酸三酯和H-膦酸酯固相合成寡核苷酸的方法的详细描述非常多。參见例如Itakura，美国专利4401796 ；Caruthers 等美国专利 4458066 和 4500707 ；Beaucage 等，Tetrahedron Lett. ,22 1859-1862 ；Matteucci 等，J. Amer. Chem. Soc. , 103 :3185-3191 (1981) ；Caruthers 等，Genetic Engineering,4 :1-17(1982) ；Jones,第 2 章，Atkinson 等，第 3 章，和 Sproat等，第 4 章，在 Gait 编的 Oligonucleotide Systhesis A practical Approach, IRLPress, Washington, D. C. (1984) ；Froehler 等，Tetrahedron Lett. ,27 :469-472(1986)；Froehler 等，Nucleic Acids Res. ,14 :5399-5407(1986) ;Sinha 等，Tetrahedron Lett ；24 :5843-5846(1983);以及 Sinha 等，Nucleic Acids Res.，12 :4539-4557 (1984)，所述文献均引入本文作为參考。可将人工基因导入细胞中，并表达以生产免疫球蛋白多肽。用于表达的细胞类型的选择取决于许多因素(如所需的蛋白质糖基化水平)，但优选能够分泌人免疫球蛋白的细胞。特别优选的细胞包括CHO细胞和骨髓瘤衍生的细胞如SP20和NSO细胞系。标准细胞培育是熟知的，并描述于 Newman 等，Biotechnology 10:1455-1460(1992) ；Bebbington等 Biotechnology 10 169-175(1992) ；Cockett 等，Biotechnology,8 :662-667(1990)；Carter等，Biotechnology 10 :163-167 (1992)，各文献均引入本文作为參考。导入核酸如人工基因的方法是熟知的，包括转染(如通过电穿孔或脂质体介导)和转化。在Samtoook等(同上文)的书中全面描述了导入基因的表达系统。经常需要在同一细胞中表达两种免疫球蛋白多肽(即重链和轻链)，以便在体内生产免疫球蛋白(如IgG分子)。因此，有时需要将两种人工基因(即ー个编码重链，ー个编码轻链)导入细胞中。(可将两种人工基因导入同一个载体上)。或者，可将编码ー种免疫球蛋白多肽的人工基因导入已经经过遗传工程加工而表达另ー免疫球蛋白多肽的细胞中。显然，由于人工基因经转染导入其中的细胞的繁殖，人工基因全部的合成核酸部分都会作为复制和转录的模板。然而，如本文所用的，认为来源于合成核酸(即通过不需要细胞衍生的核酸模板链的化学或酶促方法，体外合成的编码多肽的核酸分子)的子代基因也是人工基因。因此，人工基因的合成部分与杂交瘤表达的转基因间的关系是ー种其中只有信息联系(即序列信息)而没有直接的物理联系的关系。本发明还提供了用于治疗和诊断，特别是治疗人疾病的抗-⑶4单克隆抗体。⑶4是主要在胸腺细胞和T细胞中表达的细胞表面蛋白，它与T细胞功能和MHC II型抗原的识别有夫。抗CD4的抗体可降低CD4细胞的活性，因此可降低不需要的自身免疫反应、炎性反 应和移植器官的排斥。事实上，已经表明，施用抗-⑶4单克隆抗体可防止(Wofsy等，J. Exp. Med.,161 :378-391(1985))或逆转(Wofsy 等，J. Immunol.，138 :3247-3253 (1987)，Waldor 等，Science, 227 :415-417(1985))动物模型中的自身免疫疾病。给类风湿性关节炎患者施用鼠或嵌合抗-⑶4单克隆抗体有显著的临床效果(Knox等，Blood，77 :20-30(1991)；Goldbery 等,J. Autoimmunity, 4 :617-630 ;Herzog 等,Lancet, ii 1461-1462 ;Horneff 等，Arthritis Rheum. 34 129-140 ；Reiter 等，Arthritis Rheum. 34 :525-536 ；ffending 等，J. Rheum. 18 :325-327 ；Van der Lubbe等，Arthritis Rheum. 38 1097-1106 ；Van der Lubbe等，Arthritis Rheum. 36 1375-1379 ;Moreland等，Arthritis Rheum. 36 :307-318,和 Choy等，Arthritis and Rheumatism, 39 (I) :52-56(1996);所有文献均引入本文作为參考)。另夕卜，如上所述，已经表明嵌合抗ー⑶4单克隆抗体在患真菌样霉菌病的患者中有一些临床效果(Knox等，(1991)Blood 77 :20 ;该文献引入本文作文參考)。在Newman等的生物技术，10 :1455-1460(1992)(该文献引入本文作为參考)中也讨论了抗⑶4抗体。实验实施例方法和材料按照Hogan等，“操作小鼠胚胎实验室手册”(冷泉港实验室，该文献引入本文作为參考)的方法得到转基因小鼠。按照公幵的方法(Teratocarcinomas and embryonic stem cell :apractica丄approach, E. J. Robertson 编，IRL Press, Washington, D. C. , 1987 ；Zjilstra 等，Nature342 :435-438(1989);和 Schwartzberg 等，Science246 :799-803 (1989)，所述文献均引入本文作为參考)操作胚胎干细胞。按照J. Samtoook等，分子克隆实验室手册，第二版，1989，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N. Y.(该文献引入本文作为參考)所述完成DNA克隆步骤。按照制造商提供的说明,用Applied Bio Systems寡核苷酸合成仪合成寡核苷酸。按照“抗体实验室手册'”，Ed Harlow和David Lane,冷泉港实验室(1988)(该文献引入本文作为參考)所述，操作杂交瘤细胞和抗体。实施例I
基因组重链人Ig转基因本实施例描述人基因组重链免疫球蛋白转基因的克隆和显微注射，将所述转基因注射到鼠受精卵中。按 Marzluff 等(“Transcription and Translation a Practical Approach，，，B. D. Hammes 和 S. J. Higgins 编，pp. 89-129, IRL Press, Oxford(1985))所述从新鲜人胎盘组织中分离核。将分离的核(或PBS洗涤的人精母细胞)包埋入低熔点的琼脂糖基质中，用EDTA和蛋白酶K溶解以暴露高分子量的DNA,然后按M. Finney in Current Protocolsin Molecular Biology (F. Ausubel 等编，Jhon ffiley&Sons, Supp. 4,1988, Section 2.5.1)中所述在琼脂糖中用限制酶NotI消化。然后按照Anand 等,Nucl. Acids Res. 17 :3425-3433 (1989)所述,用脉冲场凝胶电泳分级分离NotI消化的DNA。通过Southern杂交检测富集的NotI片段懼分以检测ー个或多个由该片段编码的序列。所述序列包含重链D片段、J片段、y和Y I恒定区以及所有6 个VH家族的代表(尽管Berman等，(1988)同上文，从Hela细胞中将该片段定义为670kb片段，我们从人胎盘中发现该片段为830kb的精DNA)。合并含NotI片段的那些馏分，然后克隆到酵母细胞中pYACNN载体的NotI位点。通过用EcoRI消化pYAC_4Neo (Cook等，Nucl.Acids Res. 16 :11817(1988))然后在寡核苷酸5’-AAT TGC GGC CGC-3’存在的条件下进行连接来制备质粒pYACNN。按Brownstein 等 Science 244 1348-1351 (1989)和 Green 等，Proc. Natl. Acad.Sci.USA 87 :1213-1217(1990)(所述文献引入本文作为參考)所述分离含重链NotI片段的YAC克隆。按M.Finney(出处同上)所述，通过脉冲场凝胶电泳从高分子量酵母DNA中分离克隆的NotI插入片段。通过加入ImM精胺浓缩DNA，并直接微注射到前述单细胞胚胎核中。实施例2通过体内同源重组形成的基因组K轻链人じ转基因Lorenz 等 Nucl. Acids Res. 15 :9667-9677 (1987)(该文献弓 I入本文作为參考)中描述了人K轻链的图谱。分离含所有Ck、3’增强子和所有J片段以及至少5个不同V片段的450kbXnoI-NotI片段，然后显微注射到实施例I所述的单细胞胚胎核中。实施例3通过体内同源重组形成的基因组K轻链人じ转基因按实施例I所述分离包含所有上述片段加至少20或更多V片段的750kbMluI-NotI片段，然后用BssHII消化以产生与400kb的片段。450kb XnoI-NotI 片段和大约 400kb MluI-NotI 片段含有 BssHII 和 XnoI 限制性位点所确定的序列重叠。在显微注射到小鼠受精卵中后，这两个片段的同源重组得到含至少增加了 15-20个V片段的转基因，所述V片段发现于450kb Xnol/Notl片段(实施例2)上。实施例4构建重链小座位A.构建 pGPl 和 pGP2
用EeoRI和StyI消化pBR322，然后与下列寡核苷酸连接以产生含图8所示限制性位点的147bp插入片段的pGPl。在图9中也列出了这些寡核苷酸的一般重叠。所示寡核苷酸是oligo-1 5' -CTT GAG CCC GCC TAA TGA GCG GGC TTTTTT TTG CAT ACT GCG GCC -3'oligo-2 5' -GCA ATG GCC TGG ATC CAT GGC GCG CTAGCA TCG ATA TCT AGA GCT CGA GCA -3'oligo-3 5' -TGC AGA TCT GAA TTC CCG GGT ACC AAG
CTT ACG CGT ACT AGT GCG GCC GCT -3'oligo-4 5' -AAT TAG CGG CCG CAC TAG TAC GCG TAAGCT TGG TAC CCG GGA ATT -3'oligo-5 5' -CAG ATC TGC ATG CTC GAG CTC TAG ATATCG ATG CTA GCG CGC CAT GGA TCC -3'oligo-6 5' -AGG CCA TTG CGG CCG CAG TAT GCA AAAAAA AGC CCG CTC ATT AGG CGG GCT -3'该质粒含ー个大型多接头，该多接头侧翼为稀少的NotI切割位点以构建可从载体序列中分离的大插入片段以便进行显微注射。该质粒是以PBR322为基础的，pBR322与PUC为基础的质粒相比，拷贝数相对较少(pGPl保留了靠近复制原点的PBR322拷贝数控制区)。低拷贝数降低了插入片段的潜在毒性。另外，PGPl含有衍生于trpA(ChriStie等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 :4180(1981))的强转录终止序列，该序列插入在氨节青霉素抗性基因与多接头之间。这样通过抑制从氨苄青霉素启动子开始的连读转录而进一歩降低了与某些插入片段有关的毒性。质粒pGP2衍生于pGPl，以便将另ー限制性位点(SfiI)导入多接头。用MluI和SpeI消化pGPl以切割质粒多接头部分的识别序列。将下列衔接子寡核苷酸连接到由此消化的pGPl中以形成pGP2。5' CGC GTG GCC GCA ATG GCC A 3'5' CTA GTG GCC ATT GCG GCC A 3'除含有位于MluI和SpeI位点之间的另一 SfiI位点外，pGP2等同于pGPl。这样可以用SfiI和NotI完全切割插入片段。B.构津dRE3(大鼠3’增强子)在重链构建体中包含位于大鼠恒定区下游的增强子序列。分离并克隆Petterson等Nature 344 :165-I68 (I99O)(本文引用作为參考)所述的重链区3’增强子。用下列寡核苷酸PCR扩增大鼠IGH3’增强子序列5' CAG GAT CCA GAT ATC AGT ACC TGA AAC AGG GCT TGC 3'5' GAG CAT GCA CAG GAC CTG GAG CAC ACA CAG CCT TCC 3'用BamHI和SphI消化由此形成的编码3’增强子的双链DNA，然后克隆到BamHI/SphI切割的pGP2以产生pRE3(大鼠增强子3’)。C.克降人.T-U区通过组合分离自\噬菌体插入片段的两个或多个片段来克隆该区的实质部分。见图9。用寡核苷酸GGA CTG TGT CCC TGT GTG ATG CTT TTG ATGTCT GGG GCC AAG 从人基因组DNA文库中分离包含所有人J片段的6. 3kb BamHI/Hindlll片段(Matsuda等，EMBOJ. 7 :1047-1051(1988) ;Ravetech 等，Cell 27 :583-591 (1981)，所述文献引入本文作为參考)。用寡核苷酸CAC CAA GTT GAC CTG CCT GGT CAC AGA CCTGAC CAC CTA TGA 相似地分离相邻的IOkb Hindlll/Bamll片段，该片段含有增强子、转换和编码外显子的恒定区(Yasui 等，Eur. J. Tmmuno1. 19 1399-1403 (1989))。用克隆pMUM插入片段(pMUM是用寡核苷酸
CCT GTG GAC CAC CGC CTC CAC CTT CATCGT CCT CTT CCT CCT mu膜外显子I从人基因组DNA文库中分离的4kb EcoRI/HindIII片段)作探针相似地分离相邻3’ I. 5kbBamHI片段，然后克隆到pUC19中。用BamHI和BglII消化pGPI，然后用牛肠碱性磷酸酶处理。将图9中的片段(a)和(b)克隆到消化的pGPl中。然后分离正向克隆以便用BamHI/Bgl融合破坏5’ BamHI位点。将其鉴定为pMU(參见图10)。用BamHI消化pMU，并插入从图9中的片段(c)。用HindIII消化来检查方向。所得的质粒pHIGl (图10)含有编码J和Cu片段的18kb插入片段。D.克隆 Cii 区用BamHI和HindIII消化pGPl，然后用牛肠碱性磷酸酶处理(图14)。将图14所处理的片段(b)和图14的片段(c)克隆至IJ BamHI/Hindlll切割的pGPl中。用HindIII消化来检查片段c的合适方向以形成pCONl，pCONl含有编码Cu区的12kb插入片段。而pHIGl在其ISkb的插入片段中含有J片段、转换和U序列，该插入片段在多接头中含有SfiI 3’和SpeI 5’位点，多接头侧翼为NotI位点，用于重排VDJ片段。pCONl相同，但区别是它没有J区并只含有一 12kb插入片段。下文将描述用pCONl构建含重排VDJ片段的片段。E. Y-I恒定区的克降(DREG2)图16中描述了人Y-I区的克隆。Yamamura 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :2152-2156(1986)报道了从转基因构建体表达人膜结合的Y-1，所述构建体已经被部分整合缺失。其结果表明3’ BamHI位点描述了ー个序列，该序列包含跨膜重排和转换拷贝的Y基因，该基因含有不到5kb的V-C内含子。因此，在未重排、未转换的基因中，全长转换区被包含在第一 Y-I恒定外显子5’端的不到5kb的序列中。因此,它被包含在5’ 5. 3kb HindIII片段(Ellison等，NucleicAcids Res. 10 :4071-4079(1982)该文献引入本文作为參考)中。Takahashi 等，Cell 29:671-679(1982)(该文献引入本文作为參考)还报道该片段含有转换序列，而且该片段与7. 7kb HindIII-BamHI片段一起必须包含我们用于转基因构建体所需的所有序列。内含子序列是在具体基因内含子中的，至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。用下列Y -I第三外显子(CH3)特异性的寡核苷酸鉴定并分离含Y -I区的噬菌体克隆。5' TGA GCC ACG AAG ACC CTG AGG
TCA AGT TCA ACT GGT ACG TGG 3'将7. 7kb Hindi II-Bgl II 片段(图 11 中的片段(a))克隆到 Hindi I I/Bgl II 切割的pRE3中以形成pREGl。将上游5. 3kb HindIII片段(图11中的片段(b))克隆到HindIII消化的PREGl以形成pREG2。用BamHI/Spel消化证实正确的方向。F.C Y 矛ロ Cu前述质粒pHIGl含有人J片段和CU恒定区外显子。为了提供含CU恒定区基因片段的转基因，用SfiI消化pHIGl (图10)。用SfiI消化质粒pREG2以产生含人C Y外显子和大鼠3’增强子序列的13. 5kb插入片段。组合这些序列以产生质粒PHIG3’(图12)，在31. 5kb的插入片段中，该质粒含人J片段、人C u恒定区、人C y I恒定区和大鼠3’增强子。
通过用SfiI消化pCONl并将其与用SfiI消化pREG2所得的含人C y区和大鼠3’增强子的SfiI片段组合，构建编码人Cu和CY1，而不编码J片段的第二质粒。所得质粒pCON(图12)含有26kb Noyl/Spel插入片段，该插入片段含有人Cu、人(^1和大鼠3’±曾强子序列。G.克隆D片段图13中描述了用于克隆人D片段的策略。用多祥性区序列特异性探针从含D片段的人基因组文库中鉴定并分离噬菌体克隆(Ichihara等，EMBO J. 7 :4141-4150 (1988))。用下列寡核苷酸DXPl :5' -TGG TAT TAC TAT GGT TCG GGG AGT TAT TATAAC CAC AGT GTC -3'DXP4 :5' -GCC TGA AAT GGA GCC TCA GGG CAC AGT GGGCAC GGA CAC TGT -3'DN4 :5' -GCA GGG AGG ACA TGT TTA GGA TCT GAG GCCGCA CCT GAC ACC -3'用寡核苷酸DXPl从鉴定的噬菌体克隆中分离含DLR1、DXP1、DXP' I和DAl的5. 2kb XhoI片段(图13中片段(b))。用寡核苷酸DXP4从鉴定的噬菌体克隆中分离含DXP4、DA4和DK4的3. 2kb XbaI片段(图13中片段(C))。组合图13中的片段(b)、(C)和(d)，然后克隆到pGPl的Xbal/Xhol位点以形成含10. 6kb插入片段的pHIG2。依次完成该克隆。首先用牛肠碱性磷酸酶处理图13中的5. 2kb片段(b)和图13中的2. 2kb片段(d)，然后克隆到用XhoI和XbaI消化的pGPl中。用5. 2kb和2. 2kb插入片段筛选所得的克隆。正如用BamHI消化确定的，试验阳性的带5. 2kb和2. 2kb插入片段的克隆，其中一半以适当的方向含有5. 2kb插入片段。然后将图13中的3. 2kb XbaI片段克隆到含片段(b)和(d)的该中间质粒以形成PHIG2。该质粒含有克隆到多接头中的多祥性片段，所述多接头含有特有的5 iSfiI和特有的3’ SpeI位点。整个多接头两侧翼为NotI位点。H.构津重链小座位下文描述含ー个或多个V片段的人重链小座位的构建。
用下列寡核苷酸分离未重排的V片段，该片段对应于Newkirk等(J. Cl in.Invest. 81 :1511-1518 (1988)，该文献引入本文作为參考)的杂交瘤中所含的V片段5' -GAT CCT GGT TTA GTT AAA GAG GAT TTTATT CAC CCC TGT GTC -3'确定未重排V片段的限制图谱以鉴定特有的限制位点，所述位点在消化后可提供约2kb的DNA片段，所述片段含有未重排的V片段以及5’和3’侧翼序列。5’引物将包含启动子和其它调节序列，而3’侧翼序列提供用于V-DJ连接所必需的重组序列。将所述约3. Okb V片段克隆到pGB2的多接头中以形成pVHl。SfiI消化pVHl，将所得的片段克隆到pHIG2的SfiI位点以形成pHIG5’。由于 PHIG2只含有D片段，因此所得的pHIG5’质粒含有单个V片段以及D片段。pHIG5所含插入片段的大小是10. 6kb加V插入片段的大小。通过用NotI和SpeI消化切割来自pHIG5的插入片段，然后分离。用SpeI和NotI消化含J、Cu和C Y I片段的PHIG3’，分离含所述序列和大鼠3’增强子序列的3kb序列。组合这两个片段，然后连接到NotI消化的pGB I中以产生pHIG，pHIG含有编码V片段、9个D片段、6个功能性J片段、C y、C Y I和大鼠3’增强子的插入片段。该片段的大小近似43kb加V插入片段的大小。I.通过同源重组构建重链小座位如上部分所述，在使用单个V片段吋，pHIG的插入片段约43_45kb。该插入片段的大小在或接近很容易克隆到质粒载体中的限制。为了提供更多的V片段，下面描述重叠DNA片段的体内同源重组，所述DNA片段在受精卵或ES细胞内进行同源重组后，形成含大鼠3’增强子、人Cy、人C Y I、人J片段、人D片段和多个人V片段的转基因。用下列衔接子将含人J片段(參见图9中片段(a))的6.3kbBamHI/HindIII片段克隆到Mlu/Spel消化的pHIG5’中5' GAT CCA AGC AGT 3'5' CTA GAC TGC TTG 3'5' CGC GTC GAA CTA 3'5' AGC TTA GTT CGA 3'所得的质粒命名为pHIG5’ 0(重叠)。该质粒中所含的插入片段含有人V、D和J片段。当使用来自PVHl的单个V片段时，该插入片段的大小接近17kb加2kb。分离该插入片段并与含人J、Cy、Y I和大鼠3’增强子序列的PHIG3’的插入片段组合。两个插入片段均含有人J片段，这样在两个DNA片段之间，提供了约6. 3kb的重叠。当共注射到小鼠受精卵中时，发生体内同源重组，产生等同于PHIG中所含之插入片段的转基因。该方法可将多个V片段加入到在体内形成的转基因中。例如，不将单个V片段插入到pHIG5’中，而将包含在下列组成中的多个V片段克隆到pHIG2的SfiI位点以产生pHIG5’ Vn (I)分离的基因组DNA，⑵衍生于基因组DNA的连接的DNA，或(3)编码合成的V片段库的DNA。然后将图9的J片段(a)克隆到pHIG5’Vn中，分离插入片段。该插入片段现在含有多个V片段以与分离自PHIG3’所含之插入片段上所含的J片段重叠的J片段。当共同导入小鼠受精卵核后，发生同源重组以体内产生转基因，所述转基因编码多个V片段和多个J片段、多个D片段、C y、C Y I (均来自人)和大鼠3’增强子序列。
实施例5构律轻链小座位A.构律 dE U I图16中描述了 pEii I的构建。用下列寡核苷酸从曬菌体克隆中分离在XbaI-EcoRI678bp片段上的小鼠重链增强子(Banerji等，Cell33 :729-740(1983))5' GAA TGG GAG TGA GGC TCT CTC ATA CCCTAT TCA GAA CTG ACT 3'将该Eii片段克隆到通过补平EcoRI位点，用EcoRV/Xbal消化的pGPl中。将所得质粒命名为pEmul。 B.构律K轻链小座位构建体含有至少ー个人Vk片段、所有5个人Jk片段、人J-Ck增强子、人k恒定区外显子，而且理想的，人3’ K增强子(Meyer等，EMB0J. 8 :1959-1964(1989))。小鼠中的K增强子在Ck下游9kb。但在人类中尚未鉴定出。另外，该构建体含有一个拷贝的小鼠重链J-Cw增强子。 从下列4个组成片段构建小座位(a) 16kb SmaI片段，与小鼠座位类型，该片段含人Ck外显子和3’人增强子；(b) 5’相邻的5kb SmaI片段，该片段含所有5个J片段；(c)包含从pEii I中分离的小鼠重链内含子增强子(包含该序列以在B细胞发育中尽可能早地诱导轻链构建体的表达。由于重链基因转录早于轻链基因，该重链增强子可能在比内含子K增强子早的阶段有活性)；和(d)含ー个或多个V片段的片段。按如下制备该构建体。用SmaI消化人胎盘DNA，然后在琼脂糖凝胶上通过电泳分级分离。同样，用BamHI消化人胎盘DNA，然后通过电泳分级分离。从SmaI消化的凝胶中分离16kb的馏分，从含用BamHI消化的DNA中分离Ilkb区。将16kb SmaI馏分克隆到已用XhoI消化，用Klenow片段DNA聚合酶处理以补平XhoI 限制消化产物的入 FIX II (Stratagene, La Jolla, California)中。16kb SmaI 懼分的连接破坏了 SmaI位点和XhoI位点的完整。将IlBamHI 懼分克隆到克隆前用 BamHI 消化的 X EMBL3 (Stratagene, La Jolla,California)中。用下列Ck特异性寡核苷酸检测来自各文库的克隆5' GAA CTG TGG CTG CAC CAT CTG TCTTCA TCT TCC CGC CAT CTG 3'将16kb XhoI插入片段亚克隆到XhoI切割的pE ii I中以便Ck与SmaI位点相邻。将所得的质粒命名为pKap I。用上述Ck特异性寡核苷酸检测入EMBL3/BamHI文库以鉴定ー Ilkb的克隆。将5kb SmaI片段(图20的片段(b))亚克隆井随后插入用SmaI消化的pKapl中。将含正确方向的J片段、Ck和Eu增强子的那些质粒命名为pKap2。此后将ー个或多个Vk片段亚克隆到pKap2的MluI位点以产生质粒pKapH，该质粒编码人Vk片段、人Jk片段、人Ck片段和人Eu增强子。NotI消化pKapH切割该插入片段，然后用琼脂糖凝胶电泳纯化。将由此纯化的插入片段显微注射到前述小鼠受精卵的前核中。C.通过体内同源重组构建K轻链小座位将Ilkb BamHI片段克隆到BamHI消化的pGPl中以便3’末端朝向SfiI位点。将所得的质粒命名为pKAPint。将ー个或多个Vk片段插入到pKAPint BamHI和SpeI位点之间的多接头中以形成pKapHV。通过用NotI消化切割pKapHV的插入片段，然后纯化。通过用NotI消化切割pKap2的插入片段，然后纯化。每个片段均含有同源区，即来自pKapHV的片段含有5kb的DNA序列，该DNA序列含有与得自pKap2的插入片段中所含的5kb SmaI片段基本上同源的Jk片段。这样，这些插入片段在微注射到小鼠受精卵中时能够同源重组以形成编码Vk、Jk和Ck的转基因。实施例6 分离对应于免疫球蛋白K轻链基因之重排和表达拷贝的基因组克隆本实施例描述从表达所需免疫球蛋白的培养细胞中克隆免疫球蛋白K轻链基因。所述细胞可含有给定免疫球蛋白基因的多个等位基因。例如，杂交瘤可含有4个拷贝的K轻链基因，两个拷贝来自融合的配对细胞系，两个拷贝来自表达所需免疫球蛋白的源B细胞。这4个拷贝之中，只有一个编码所需的免疫球蛋白，尽管事实上，其中的ー些可能被重排过。本实施例中所述的方法可以选择性地克隆K轻链的表达拷贝。A.双链 cDNA将来自杂交瘤或淋巴瘤的细胞或其它合成带K轻链的IgM的细胞表面或分泌形式或两种形式的细胞系用于分离polyA+RNA。然后用反转录酶(有关常规方法參见Goodspeed 等，(1989) Gene 76:1 ;Dunn 等，(1989) J. Biol. Chem. 264 13057)将该 RNA 用于合成寡核苷酸dT引发的cDNA。然后分离单链cDNA,用多核苷酸末端转移酶将G残基加到3’末端。然后纯化G结尾的单链cDNA，并用作用下列寡核苷酸为引物的第二条链合成的模板(用DNA聚合酶催化的)5' -GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG CCCCCC CCC CCC -3'分离双链cDNA，并用于确定mRNA 5’末端的核苷酸序列，所述mRNA编码所表达免疫球蛋白分子的重和轻链。然后分离这些表达基因的基因组克隆。在下文部分B中说明了克隆所表达轻链基因的方法。B.轻链将部分A中所述的双链cDNA变性，并用作第三轮DNA合成的模板，该合成使用下列寡核苷酸引物5' -GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG TCA TCA GATGGC GGG AAG ATG AAG ACA GAT GGT GCA -3'该引物含有K 轻链信使(TCA TCA GAT GGC GGG AAG ATG AAGACA GAT GGT GCA)的恒定区部分以及特有序列特异性的序列，该序列可作为PCR扩增新合成的DNA链(GTACGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG)的模板。用下列两个寡核苷酸引物，通过PCR扩增所述序列5' -GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG-3'
5' -GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG-3'然后通过凝胶电泳纯化PCR扩增的序列，并用作双脱氧测序反应的模板，该反应用下列寡核苷酸作为引物5' -GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG-3'然后将序列的前42个核苷酸用于合成特有的探针，用该探针分离转录出免疫球蛋白信使的基因。下文将该DNA的合成的42个核苷酸的片段称为o-K。进行DNA Southern印迹,从表达Ig的细胞系中分离并用包括SmaI的数种限制核酸内切酶逐个并成对组合消化，然后用32-P标记的特有寡核苷酸o-K进行检測。在重排V片段的上游鉴定了ー个特有的限制核酸内切酶位点。然后用SmaI和第二种酶(如果在V片段内有SmaI，就用BamHI或KpnI)切割来自Ig-表达细胞系的DNA。用T4DNA聚合酶处理任何所得的非平整末端以得到有平整末端 的DNA分子。然后加入编码接头的限制位点(根据片段中不存在的位点，来选择BamHI.、EcoRI或XhoI)，并用相应的接头酶切割以得到带有BamHI.、EcoRI或XhoI的末端。然后，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA进行大小分级分离，接着将含有覆盖所表达V片段之DNA片段的懼份克隆到入EMBL3或入FIX (Stratagene, La Jolla, California)中。用特有的探针
o-K分离含V片段的克隆。从阳性克隆中分离DNA，然后亚克隆到pKapl的多接头中。将所得克隆称为PRKL。实施例7分离对应于免疫球蛋白U重链基因之重排的表达拷贝的基因组克隆本实施例描述从表达所需免疫球蛋白的培养细胞中克隆免疫球蛋白U重链基因。本实施例中所述的方法可以选择性地克隆U重链基因的表达拷贝。按本文前述制备并分离双链cDNA。将双链cDNA变性并用作第三轮DNA合成的模板，该合成使用下列寡核苷酸引物5' -GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG ACA GGA GACGAG GGG GAA AAG GGT TGG GGC GGA TGC -3'该引物含有U 重链信使(ACA GGA GAC GAG GGG GM MGGGT TGG GGC GGA TGC)的恒定区部分以及特有序列特异性的序列，该序列可作为PCR扩增新合成的DNA链(GTA CGCCAT ATC AGCTGG ATG AAG)的引物。用下列两个寡核苷酸引物，通过PCR扩增所述序列5' -GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG-3'5' -GTA CTC CAT ATC AGC TGG ATG AAG-3'然后通过凝胶电泳纯化PCR扩增的序列，并用作双脱氧测序反应的模板，该反应用下列寡核苷酸作为引物5' -GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG-3'然后将序列的前42个核苷酸用于合成特有的探针，用该探针分离转录出免疫球蛋白信使的基因。下文将该DNA的合成的42个核苷酸的片段称为o-mu。进行DNA Southern印迹，从表达Ig的细胞系中分离并用包括MluI (MluI是ー种很稀少的切割酶，它在J片段和mu CHl之间裂解)的数种限制核酸内切酶逐个并成对组合消化，然后用32-P标记的特有寡核苷酸o-mu进行检測。在重排V片段的上游鉴定了ー个特有的限制核酸内切酶位点。
然后用MluI和第二种酶切割来自Ig-表达细胞系的DNA。然后将MluI或SpeI衔接子接头连接到末端上，并切割以便将上游位点转变成MluI或SpeI。然后，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA进行大小分级分离，接着将含有覆盖所表达V片段之DNA片段的馏份直接克隆到质粒PGPl中。用特有的探针o-mu分离含V片段的克隆，然后将插入片段亚克隆到MluI或Mlul/Spel切割的质粒pC0N2中。将所得的质粒称为pRMGH。实施例8构建人K小座位转基因轻链小座位用K轻链特异性寡核苷酸探针筛选人基因组DNA噬菌体文库并分离覆盖Jk-C区的克隆。将含Jk I的5. 7kb Clal/Xhol片段和含Jk 2-5和Ck的13kb XhoI片段克隆到 ロ6卩1(1中，然后用于产生质粒？1^01'。该质粒含ム1-5，1^内含子增强子和Ck以及4.5kb 5，和9kb 3’侧翼序列。它还含有ー个特有的用于克隆Vk片段的5’ XhoI位点和用于插入其它顺式作用调节序列的特有3’ SalI位点。V.,某闵用Vk轻链特异性的寡核苷酸探针筛选人基因组DNA噬菌体文库，分离含人Vk片段的的克隆。用DNA序列分析确定功能性V片段。这些克隆含有TATA盒、编码前导和可变肽(包含2个半胱氨酸残基)的开放阅读框架、剪接序列和重组七聚体_12bp间隔区及九聚体序列。作出这三个克隆的图谱并测序。其中两个克隆，65. 5和65. 8似乎是有功能的，它们含有TATA盒、编码前导和可变肽(包含2个半胱氨酸残基)的开放阅读框架、剪接序列和重组七聚体_12bp间隔区及九聚体序列。第三个克隆65. 4可能编码Vk I假基因，因为该克隆含有不标准的重组七聚体。用有功能的克隆之一，Vk65-8 (编码VkIII家族基因)构建轻链小座位构建体。pKCl通过将含Vk 65. 8的7. 5kb Xhol/Sall片段插入到pKcor的5，XhoI位点来产生K轻链小座位转基因pKCl (图32)。在注射前通过用NotI消化来分离转基因插入片段。将纯化的插入片段微注射到受精(C57BL/6XCBA)F2小鼠胚胎的前核中，然后将活胚胎转移到 Hogan 等(in Methods of Manipulating the Mouse Embryo, 1986,冷泉港实验室，纽约)所述的假孕雌性小鼠中。通过尾DNA的Southern印迹分析分析从注射胚胎发育的小鼠是否存在转基因序列。根据含已知数量的克隆DNA的对照标准，通过带强度来估计转基因拷贝数。从这些动物中分离血清并按Harlow and Lane (在抗体实验室手册 ，1988，冷泉港实验室(纽约)中)所述的ELISA，分析是否存在编码人Ig K蛋白质的转基因。用人 Ig K 特异性(克隆 6E1，#0173，AMAC，Inc.，Westbiook ME)，人 IgM(克隆 AF6，#0285, AMAC, Inc. ,Wastbrook,ME)和人 IgGl (克隆 JL512，#0280，AMAC，Inc. ,WestbiookME)的小鼠单克隆抗体包被微滴定板上的孔。将系列稀释的血清样品加到孔中，然后用亲合力分离的碱性磷酸酶结合的山羊抗人Ig(多价)(已被预吸附以便使之与小鼠免疫球蛋白的交叉反应最小)检测是否存在特异性免疫球蛋白。图35 说明 8 个小鼠(I. D. #676，674，673，670，666，665，664，和 496)血清的 ELISA试验結果。前7个小鼠是从注射了 pKCl转基因插入片段的胚胎发育的，第8个小鼠是从微注射了 PHCl转基因(前述)的小鼠衍生的。从注射KCl胚胎发育的7只小鼠中，通过DNA Southern印迹分析，有两只((I. D. #666和664)不含有转基因插入片段，其它5只(I. D. #676，674，673,670和665)含有转基因。除一只外所有KCl转基因阳性动物均表达可检测水平的人Ig K蛋白，根据DNA Southern印迹分析,未表达的那只动物可能是由于基因镶嵌物。PHCl阳性的转基因小鼠表达人IgM和IgGl，但不表达IgK，这说明了试验中所用试剂的特异性。pKC2通过将含Vk 65. 5的8kb Xhol/Sall片段插入pKCl的5’ XhoI位点产生k轻链小座位转基因PKC2。在微注射前，通过NotI消化来分离含两个Vk片段的所得转基因插入片段。pKVe 2除该构建体包含Jk 5’的I. 2kb序列并丢失了 Vk 65. 83’的4. 5kb序列外，该构建体与pKCl相同。另外，它还含有0.9kb XbaI片段，该片段含有小鼠重链J-y内含子增强 子(Banerji等，Cell 33 :729-740 (1983))以及含插入在下游的人重链J-y内含子增强子(Hayday 等，Nature307 :334-340 (1984))的 I. 4kb Mlul/Hindlll 片段。用该构建体试验启始轻链小座位的早期重排以影响等位基因和同种型排斥的可行性。用不同的增强子，即小鼠或大鼠 3’ K 或重链增强子(Meyer 和 Neuberger，EMBO J. 8 :1959-1964(1989)；Petterson等，Nature 344 :165-168 (1990)，该文献引入本文作为參考)产生类似的构建体。重排的轻链转基因设计K轻链表达盒以重建功能重排的轻链基因，来自人B细胞DNA的该基因已用PCR扩增。在图33中描述了方法。将PCR扩增的轻链基因克隆到载体pK5nx中，pK5nx含有从K轻链基因65. 5分离的3. 7kb5’侧翼序列。然后将与5’转录序列融合的VJ片段克隆到载体pK31s的特有XhoI位点，pK31s含有Jk 2-4、Jk内含子增强子、Ck和9kb的下游序列。所得的质粒含有重建的功能重排的K轻链转基因，可用NotI切割该转基因以便微注射到胚胎中。该质粒还在3’末端含有単一的SalI位点，以用于插入其它的顺式作用调节序列。用两个合成的寡核苷酸(0-130，0-131)从人脾基因组DNA扩增重排的k轻链基因。寡核苷酸 0-131 (gga ccc aga(g, c) gg aac cat ggaa(g, a) (g, a, t, c))与 Vk III 家族轻链基因的5’区互补并覆盖前导序列的第一个ATC。寡核苷酸0-130 (gtg caa tea attetc gag ttt gac tac aga c)与Jk 13’的约150bp序列互补并含有XhoI位点。这两个寡核苷酸扩增来自人脾DNA的0. 7kb DNA片段，该片段对应于与Jk I片段连接的重排的VkIII基因。用NcoI和XhoI消化PCR扩增的DNA，然后将单个PCR产物克隆到质粒pNN03中。确定了 5个克隆的DNA序列，并鉴定了其中两个含有功能性VJ连接(开放阅读框架)。收集其它功能重排的轻链克隆。逐个将功能重排的克隆克隆到上述轻链表达盒(图33)中。可将用重排的轻链构建体产生的转基因小鼠与重链小座位转基因种交配，以产生表达各种全人抗体的小鼠品系，其中由重链提供初级库的多祥性。轻链多祥性的ー个来源是体细胞突变。由于就轻链与不同重链、不同品系小鼠的结合能力而言，并不是所有的轻链都是相同的，因此可产生并检测含不同轻链构建体的轻链。与用未重排的轻链小座位相反，该方案的优点是ー发生重链VDJ连接，就可以提高来自准备与重链配对之轻链的轻链等位基因和同种型排斥。该种组合会导致表达全人抗体的B细胞的频率増大，由此可有利于表达人Ig的杂交瘤的分离。通过琼脂糖凝胶电泳从载体序列中分离醇质粒pIGMl、pHCl、pIGGl、pKCl和pKC2的NotI插入片段。将纯化的插入片段微注射到受精(C57BL16xcBA)F2小鼠胚胎的前核中，然后将活胚胎转移到Hogan等(in Methods of Manipulating the Mouse Embryo, 1986,冷泉港实验室，纽约)所述的假孕雌性小鼠中。实施例9通过同源重组使小鼠K轻链基因失活本实施例描述通过在胚胎干(ES)细胞中的同源重组使小鼠内源K基因座位失活，然后通过将带失活K等位基因的靶ES细胞注射到早期小鼠胚胎(胚泡)中而将突变的基因导入小鼠种系中。 该方法是用含DNA序列的载体，通过同源重组来缺失Jk和Ck，所述DNA序列与小鼠K基因座位同源，其中4. 5kb的基因座位片段，即覆盖Jk基因和Ck片段被缺失并用选择性标记neo取代该片段。构律K靶载体质粒pGEM7 (KJl)含有新霉素抗性基因(neo)，在克隆载体pGEM7Zf (+)中小鼠磷酸甘油酸激酶(Pgk)启动子(Xbal/TaqI片段；Adra等，(1987)基因60 65)的转录控制下，用于药物选择转染的ES细胞。该质粒还含有neo基因的异源聚腺苷酸化位点，该位点衍生于小鼠Pgk基因的3’区(PvuII/HindHI片段；Boer等，生化遗传学，28 :299-308 (1990))。将该质粒用作构建K祀载体的起始材料。第一步是插入与neo表达盒3’K基因座位同源的序列。用Ck基因座位特异性5' -GGC TGA TGC TGC ACC AAC TGT ATC CAT CTT CCC ACC ATC CAG-3'和用J K 5基因片段特异性的寡核苷酸探针5' -CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGT AAG-3'.从肝DNA衍生的基因组噬菌体文库中分离小鼠K链序列(图20a)。从阳性噬菌体克隆中分离延伸到小鼠Ck片段3’的8kb Bglll/SacI片段，该片段分离在两个片段中，ー个是I. 2kb Bglll/SacI片段，ー个是6.8kb SacI片段，然后将其亚克隆至IJ Bglll/SacI消化的pGEM7 (KJl)中以产生质粒pNE0_K3，(图20b)。从阳性噬菌体克隆中也分离了延伸到Jk区5’的I. 2kb EcoRI/SphI片段。将Sphl/Xbal/Bglll/EcoRI衔接子连接到该片段的SphI位点，然后将所得EcoRI片段连接至1』已(301 1消化的？肥0-1(3’中，与neo基因和下游3’ k序列ー样的5’-3’方向，以产生PNE0-K5，3，(图 20c)。然后按Mansour等，自然336 =348-352(1988)(该文献引入本文作为參考)所述，将单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因包含在构建体中以便富集带同源重组体的ES克隆。从质粒pGEM7 (TK)得到HSV TK盒，该盒含有由小鼠pgk启动子和上述用于pGEM7 (KJl)的聚腺苷酸化序列夹在中间的HSV TK基因的结构序列。将pGEM7 (TK)的EcoRI位点修饰成BamHI位点，然后将TK盒切割为BamHI/Hindlll片段并亚克隆到pGPlb中以产生pGPlb-YK。在XhoI位点将该质粒线性化，然后将来自PNE0-K5’ 3’的XhoI片段(该片段含有neo基因，该基因两侧翼为Jk的5’和Ck的3’基因组序列)插入到pGPlb-TK中以产生靶载体J/CKI (图20d)。与J/C Kl同源重组后，基因组K基因座的推测结构示于图20e中。产生并分析含有靶失活的K等位基因的ES细胞所用的ES 细胞是在基本上按(Robertson, E. J. (1987) inTeratocarcinomas andEmbryonic Stem Cell A Practical Approach. E. J. Robertson编，(OxfordL IRL Press),p. 71-112)所述的无有丝分裂活性的SNL76/7细胞饲养层(McMahon和Bradley，Cell 62 1073-1085(1990))上生长的AB-I系。其它适宜的ES细胞系包括但不限于E14细胞系(Hooper 等,(1987)Nature 326 :292-295)、D3 细胞系(Doetschman 等，(1985) J. Embryol.Exp. Morph. 87 :27-45)和 CCE 细胞系(Robertson 等，(1986) Nature 323:445-448)。是否能够成功地产生带特异性靶突变的ES小鼠细胞系取决于ES细胞的多潜能(即在注射到宿 主胚泡后，其參与胚胎形成并有助于所得动物生殖细胞的能力)。任何给定ES细胞系的多潜能随培养时间和它所得到的管理而变化。多潜能的唯ー确定性试验是确定用作靶的ES细胞的特异性种群是否可产生能够进行ES基因组种系转递的嵌合体。由于该原因，在基因导向前，将部分AB-I细胞的亲代种群注射到C57B1/6J胚泡中以确定所述细胞是否能够与广泛的ES细胞产生嵌合小鼠并是否大部分嵌合体可将ES基因组传递给子代。用NotI消化K链失活的载体J/C Kl,然后按照所述方法(Hasty等，Nature350 :243-246(1991))电穿孔到AB-I细胞中。将电穿孔的细胞铺在IOOmm平板上，密度为1-2 X IO6细胞/平板。24小时后，将G418 (200 y g/ml活性组分)和FIAU (0. 5 y m)加到培养基中，使药物抗性克隆形成10-11天。将克隆捡出、胰蛋白酶消化、分成两部分，再増殖。然后将各克隆衍生出的一半细胞冷冻，另一半分析载体与靶序列之间的同源重组。用Southern 印迹杂交完成 DNA 分析。按所述(Laird 等，Nucl. Acids Res. 19 4293(1991))从克隆中分离DNA，用XbaI消化并用图20e中报示的800bp EcoRI/Xbal片段作为探针A检测。该探针检测野生型基因座位中的3. 7kb XbaI片段，和已与靶载体(图20a和e)同源重组过的基因座位中的I. 8kb诊断带。用Southern印迹分析筛选的901个G418和FIAU抗性克隆中，7个有1.8kb XbaI带，该带是通常重组了ー个k基因的标志。再用Bglll、SacI和PstI消化这7个克隆，以证实载体同源整合到一 K基因中。用诊断性800bp EcoRI/Xbal片段(探针A)检测时，野生型DNA的Bglll, SacI和PstI消化产物分别产生4. I、5.4和7kb片段，而2. 4、7. 5和5. 7片段分别表示存在靶k等位基因(參见图20a和e)。用XbaI消化检测的所有7个阳性克隆有预期的BglII、SacI和PstI限制片段，表明在K轻链进行了同源重组。另外，用neo特异性探针(探针B，图20e)对靶克隆的NsiI消化产物进行Southern印迹分析，只得到一个预测的4. 2kb片段，表明各克隆只含有一个拷贝的靶载体。产牛带失活K链的小鼠将前节中所述的5个靶ES克隆融解，然后注射到所述的C57B1/6J胚泡(Bradley，A. (1987)in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell APractical Approach.E. J. Robertson编(OxfordL IRL Press) ,p. 113-151)中，然后转移到假孕雌性小鼠的子宮中以产生嵌合小鼠，所述嵌合小鼠产生于输入了 ES细胞之细胞与宿主胚泡的混合物。ES细胞对嵌合体的贡献程度可通过在黑色C57B1/6J背景下，衍生于ES细胞系的野灰色皮毛的量来肉眼评估。从注射靶克隆的胚泡产生的约一半的子代是嵌合的(即有野灰色和黒色)，其中大部分表明有大多数(70%或更多的)ES细胞对皮毛着色起了作用。ABlES细胞是XY细胞系，大部分嵌合体(高百分比)由于雄性ES细胞在雌性胚胎中集落化的性别转换而是雄性的。将衍生于5个靶克隆的4个雄性嵌合体与C57B1/6J雌性交配，监测子代是否存在显性野灰色皮毛，这种颜色是ES基因组种系传递的标志。从这些克隆中的2个嵌合体始終产生野灰色子代。由于在注射的ES克隆中，只靶向ー个拷贝的K基因座位，各野灰色子代有50%的机会来遗传突变座位。用在鉴定靶ES克隆中所用的探针(探针A，图20e)，通过Southern印迹分析BglII消化来自尾活检的DNA，来筛选靶基因。正如所预期的，约50%的子代除4. Ikb的野生型带外，还有2. 4kb的杂文BglII带，这证实了靶K基因座位的种系传递。为了产生突变纯合的小鼠，将杂合子一起交配，按上述确定子代的K基因型。正如所预期的，从杂合子交配中产生了三种基因型带2个拷贝正常K座位的野生型小鼠，带 ー个靶拷贝K基因和ー个NTK基因的杂合子，以及K突变纯合的小鼠。通过将Southern印迹与Jk特异性探针(探针C，图20a)杂交，确定从后一种小鼠中缺失了 K序列。而观察到Jk探针与杂合子和野生型同胞DNA样品的杂交，在纯合子中没有杂交信号，证明产生了新的小鼠品系，在该品系中，通过靶突变的结果，通过缺失而已使2个拷贝的K基因座位失活。实施例10通过同源重组使小鼠重链基因失活本实施例描述了通过在胚胎干(ES)细胞中进行同源重组，而使内源鼠免疫球蛋白重链失活。该方法是通过与含重链序列的载体进行同源重组而缺失内源重链J片段，所述重链序列来自已经缺失了的Jh区，并有选择性标记neo的基因取代。构津重链靶载体用下列Jh4特异性的寡核苷酸探针，从衍生于D3ES细胞系(Gossler等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 83 :9065-9069(1986))的基因组噬菌体文库中分离含Jh区的小鼠重链序列(图21a):5' -ACT ATG CTA TGG ACT ACT GGG GTC AAG GAA CCT CAG TCA CCG-3'从阳性噬菌体中克隆分离覆盖Jh区的的3. 5kb基因组SacI/StuI片段，然后亚克隆到Sacl/Smal消化的pUC18中。将所得的质粒命名为pUC18JH。用于转染ES细胞药物筛选的新霉素抗性基因(neo)衍生于修补过的质粒pGEM7 (KJl)。文献中的报道(Yenofsky等，(1990)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87 :3435-3439)提供了数个常用于表达载体的 neo 编码序列的点突变的资料，所用的表达载体包括作为PGEM7 (KJl)所用之neo基因源的构建体pMCIneo (Thomas 和 Cappechi (1987) Cell51 :503-152)。所述突变降低了 neo 基因产物的活性，而且通过用来自野生型neo克隆的相应序列取代含突变的限制片段可进行修复。将制备的pGEM7 (KJl)中的HindIII位点通过加入合成的衔接子转变成SalI位点，通过XbaI/SalI消化来切割neo表达盒。然后通过用DNA poll的Klenow形式处理来补平neo片段末端，然后将neo片段亚克隆到pUC18JH的NaeI位点，产生质粒pUC18JH-neo (图21b)。用质粒pGPlb的衍生物再构建靶载体。用限制酶NotI消化pGPlb，然后与作为衔接子的下列寡核苷酸相连5' -GGC CGC TCG ACG ATA GCC TCG AGG CTA TAA ATC TAG AAG AATTCC AGC AAA GCT TTG GC —3'用称为pGMT的所得质粒构建小鼠免疫球蛋白重链靶构建体。然后按Mansour 等，Nature 336 :348-352 (1988)所述，将单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因包含在构建体中以便富集带同源重组体的ES克隆。通过用EcoRI和HindIII消化，从质粒pGEM7 (TK)得到HSV TK基因。将TK DNA亚克隆在pGMT的EcoRI和 HindIII位点之间，产生质粒pGMT-TK。为了得到与靶序列同源的更大的区域，通过XhoI对DNA的限制消化和，XbaI的部分消化，从阳性基因组噬菌体克隆中得到位于Jh区5’的5. 9kb基因组Xbal/Xhol片段。如图21a所述，该XbaI位点不在基因组DNA中，而是衍生于阳性噬菌体克隆中克隆的基因组重链插入片段侧翼的噬菌体序列。将该片段亚克隆到Xbal/Xhol消化的质粒pGMT-TK中，以产生质粒pGMT-TK-Jh5’(图21d)。构建的最后步骤是从pUC18JH-neo中切割2.8kb EcoRI片段，该片段含有neo基因和Jh 3’侧翼的基因组序列。用Klenow聚合酶将该片段补平，然后亚克隆到pGMT-TK-Jh5’的相似补平的XhoI位点。所得的构建体，JhKOI (图21e)含有Jh基因座位侧翼的6. 9kb基因组序列，覆盖Jh区的2. 3kb缺失，在该区中插入了 neo基因。图21f说明在与靶构建体同源重组后，内源重链基因的结构。实施例11产牛并分析靶ES细胞在基本上按所述(Robertson,E. J. (1987) in Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cell A Practical Approach. E. J. Robertson 编(OxfordL IRL Press), p. 71-112)的无有丝分裂活性的SNL76/7细胞饲养层上生长AB-IES细胞系(McMahon和Bradley，Cell62:1073-1085(1990))。如前实施例所述，在用靶构建体JhKOI电穿孔ES细胞前，通过产生AB-I衍生的嵌合体来确定ES细胞的多潜能，AB-I衍生的嵌合体的产生表明能够通过种系传递ES基因组。用NotI消化重链失活的载体JhKOI,然后按所述方法(Hasty等，Nature 350 243-246(1991))电穿孔到AB-I细胞中。将电穿孔的细胞铺在IOOmm平板上，密度为
1-2 X IO6细胞/平板。24小时后，将G418 (200 y g/ml活性组分)和FIAU (0. 5 y m)加到培养基中，使药物抗性克隆形成8-10天。将克隆捡出、胰蛋白酶消化、分成两部分，再増殖。然后将各克隆衍生出的一半细胞冷冻，另一半分析载体与靶序列之间的同源重组。用Southern 印迹杂交完成 DNA 分析。按所述(Laird 等，Nucl. AcidsRes. 19 4293(1991))从克隆中分离DNA，用StuI消化并用图21f中的称为探针A的500bp EcoRI/StuI片段检測。该探针检测野生型基因座位中的4. 7kb StuI片段，而3kb带是内源序列与革巴载体(图21a和21f)同源重组过的诊断带。用Southern印迹杂交筛选的525个G418和FIAU双抗性克隆中，发现12个含有表示与靶载体重组过的3kb帯。这些克隆表示在JH基因座位发生了预期的靶事件(如图21f所示)，再用HindIII、SpeI和HpaI消化来证实。探针A (见图21f)与HindIII、SpeI和HpaI消化的DNA的杂交分别产生了野生型基因座位的2. 3kb、大于IOkb和大于IOkb带(见图21a)，而预期靶重链基因座位会分别产生5. 3kb、3. 8kb和I. 9kb的带(见图21f)。用StuI消化检测的所有12个阳性克隆显示出都有靶Jh基因的预期Hindlll、SpeI和HpaI诊断带。另外，用neo特异性探针(探针B，图21f)经Southern印迹分析所有12个克隆的StuI消化产物只产生了一个预期的3kb片段，说明每个克隆只含有I个拷贝的靶载体。产生带JH缺失的小鼠将前节中所述的3个靶ES克隆融解，然后注射到所述的C57B1/6J胚泡(Bradley，A. (1987)in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell APractical Approach.
E.J. Robertson编(OxfordL IRL Press) ,p. 113-151)中，然后转移到假孕雌性小鼠的子宮中。ES细胞对嵌合体的贡献程度可通过在黑色C57B1/6J背景下，衍生于ES细胞系的野灰色皮毛的量来肉眼评估。从注射了两个靶克隆的胚泡产生的一半子代是嵌合的(即有野灰 色和黒色)，第3个靶克隆没有产生任何嵌合动物。大部分嵌合体表明有大量大约(50%或更多的)ES细胞对皮毛颜色起了作用。由于ABlES细胞是XY细胞系，大部分嵌合体是雄性的，由于雄性ES细胞在雌性胚胎中的集落化而产生性别转换。将雄性嵌合体与C57B1/6J雌性小鼠交配，然后监测子代是否存在显性野灰色皮毛，这种颜色是ES基因组种系传递的标志。这两个克隆的嵌合体始终产生野灰色子代。由于在注射的ES克隆中，只靶向ー个拷贝的重链座位，各野灰色子代有50%的机会来遗传突变的座位。用在鉴定靶ES克隆中所用的探针(探针A,图21f),通过Southern印迹分析StuI消化来自尾活检的DNA,来筛选革巴基因。正如所预期的，约50%的野灰色子代除4. 7kb的野生型带外，还有大约3kb的杂文StuI带,这证实了祀JH座位的种系传递。为了产生突变纯合的小鼠，将杂合子一起交配，按上述确定子代的重链基因型。正如所预期的，从杂合子交配中产生了三种基因型带2个拷贝正常Jh座位的野生型小鼠，带ー个拷贝靶基因和ー个正常基因的杂合子，以及Jh突变纯合的小鼠。通过StuI消化的DNA的Southern印迹与Jh特异性探针(探针C，图21a)杂交，来确定后一种小鼠中是否缺失了Jh序列。而观察到Jh探针与杂合和野生型同胞的DNA样品中4. 7kb片段杂交，在Jh突变的纯合子中没有杂交信号，证明产生了新的小鼠品系，在该品系中，通过缺失Jh序列而突变了所有两个拷贝的重链基因。实施例12重链小座位的转基因A.构津用于克降大DNA序列的质粒载体I. pGPla用EcoRI和StyI消化质粒pBR322，然后与下列寡核苷酸相连oligo-42 5' -caa gag ccc gcc taa tga gcg ggc ttt ttt ttg catact gcg gcc get -3'oligo-43 5' _aat tag egg ccg cag tat gca aaa aaa age ccg ctcatt agg egg get -3'所得的质粒称为pGPla，用于克隆很大的DNA构建体，可用稀少的限制酶NotI切割该构建体。该质粒在衍生于trpA基因(Christie等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4180(1981))强转录終止信号下游含有ー个NotI限制性位点(相当于氨苄青霉素抗性基因，AmpR)。该终止信号通过消除从AmpR基因的连读转录而降低了插入到NotI位点的编码序列的潜在毒性。另外，与PUC质粒相比，该质粒是低拷贝的，因为它含有pBR322的拷贝数控制区。由于DNA复制低拷贝数还进一歩降低了插入片段的潜在毒性并降低了对大插入片段的筛选。载体pGPlb、pGPlc、pGPld和pGPlf衍生于pGPla，含有不同的多接头克隆位点。下面给出多接头序列pGPlaNotIGCGGCCGCpGPlb
NotI XhoI ClaI BamHI HindIII NotIGiggccgcctcgagatcactatcgattaattaaggatccagcagtaagcttgcLrGCCGipGIlcNotI SmaI XhoI Sail HindIII BamHI SacII NotI(acggccgcatcccgggtctcgaggtcgacaagctttcgaggatccgcGGCCGしpGPldNotI Sail HindIII ClaI BamHI XhoI NotIGCggccgctgtcgacaagcttatcgatggatcctcgagtgcGGCCGCpGPlfNotI Sail HindIII EcoRI ClaI KpnI BamHI XhoI NotI Giggccgctgtcga caagcttcgaattcagatcgatgtggtacctggatcctcgagtgcbGCCGし将所述各质粒用于构建可用NotI切割的大转基因插入片段，以便可在显微注射前，从载体序列中纯化出转基因DNA。2. DGPlb用NotI消化pGPla，然后与下列寡核苷酸相连oligo-47 5' -ggc cgc aag ctt act get gga tcc tta att aat cgatag tga tct cga ggc -3'oligo-48 5' -ggc cgc ctc gag ate act ate gat taa tta agg atecag cag taa get tgc -3'所得质粒pGPlb在NotI位点侧翼含有短多接头区。这有利于构建可用NotI消化的大插入片段。3. DGPe通过聚合酶链反应技术，用下列寡核苷酸从大鼠肝DNA中扩增免疫球蛋白重链3’增强子(S. Petterson 等，Nature 344 :165-168(1990))oligo-44 5' —ctc cag gat cca gat ate agt acc tga aac agg gettgc -3'oligo-45 5' -ctc gag cat gca cag gac ctg gag cac aca cag ccttcc -3'用BamHI和SphI消化扩增的产物，然后克隆到BamHI/SphI消化的pNN03 (pNN03是ー个pUC衍生的质粒，该质粒含有多接头和下列限制位点，所述位点的顺序是NotI、BamHI、NcoI、ClaI、EcoRV,XbaI、SacI、XhoI、SphI、PstI、BglII、EcoRI、SmaI、KpnI、Hindi11和NotI)中。用BamHI和HindIII消化所得质粒pRE3，将含大鼠Ig重链3’增强子的插入片段克隆到BamHI/Hindlll消化的pGPlb中。所得的质粒pGPe (图22和表I)含有数个特有的限制位点，可向所述限制位点克隆序列，然后通过NotI消化所述序列与3’增强子一起切下。表I
权利要求
1.由转基因小鼠产生的免疫球蛋白，所述转基因小鼠含有一对纯合的功能破坏了的内源重链等位基因、一对纯合的功能破坏了的内源轻链等位基因、人免疫球蛋白K轻链转基因和人免疫球蛋白重链转基因， 其中所述人免疫球蛋白K轻链转基因含有5个人轻链V K片段，其中五个人轻链VK片段是1^15，1^18，1^24，六10和六27，以及 其中所述小鼠在用人抗原免疫后，产生抗体反应。
全文摘要
本发明涉及能够生产异源抗体的转基因非人动物和用于生产具有显著亲合力的人序列抗体的方法，所述抗体与人抗原结合。
文档编号A61K38/00GK102827283SQ20121011928
公开日2012年12月19日 申请日期1996年10月10日 优先权日1995年10月10日
发明者尼尔斯·隆博格, 罗伯特·M·凯 申请人:真药物国际公司