专利名称：用于在哺乳动物细胞中表达的密码子优化的IL-15和IL-15Rα基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及哺乳动物细胞中提高的细胞因子表达，通过优化细胞因子基因表达的所有步骤。
背景技术：
白介素-15(IL_15)是一种多效细胞因子，对先天性和获得性免疫系统非常重要(Diab，等人，Cytotherapy (2005) 7 :23_35)。IL-15促进中性粒细胞和巨噬细胞的活化，是树突状细胞(DC)、天然杀伤(NK)细胞、NK T细胞和CD8+T细胞(Id.)的发育和功能必不可少的。IL-15在淋巴和非淋巴隔室作用于细胞(Van Belle和Grooten,Arch Tmmunol TherExp(2005)53 :115)。基于其多种功能和动物模型中的相对安全性，发现了 IL-15给药在治疗免疫缺陷中的用途，用于T细胞和NK细胞的体外扩增，和作为疫苗的佐剂，包括抗HIV疫苗(Diab，等人，上述；Ahmad,等人，CurrHIVRes (2005) 3 261 ；Alpdogan and van den Brink, TrendsImmunol (2005) 26 :56)。例如，已经发现外源IL-15给药显著增强感染人类免疫缺陷性病毒(HIV)的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者的免疫细胞功能(Ahmad，等人，上述；还可参见，Pett和Kelleher,Expert Rev Anti Infect Ther (2003) I :83 ;和Ansari,等人，ImmunolRes (2004) 29 1)。IL-15给药对淋巴组织生成的作用和免疫缺陷病症的治疗也在研究中(Alpdogan and van den Brink,上述)。来自数个研究者的结果已经表明IL-15受体α的天然可溶形式是IL_15的拮抗剂(参见，Mortier,等人，(2004) J. Immunol. 173,1681-1688 ;Ruchatz,等人,(1998)J. Immunol. 160, 5654-566 ;和 Smith,等人，(2000) J. Immunol. 165,3444-3450)。相反，当通过柔性氨基酸连接区融合到IL-15时，IL-15受体α的sushi结构域已经被认为是IL-15功能的体外激动剂(J Biol Chem. 2006Jan 20 ；281(3) :1612-9)。可溶性白介素-15受体a (IL-15Ra)-sushi是通过IL-15R β/γ的IL-15作用的选择性和有效的激动剂(参见，Mortier E，等人，J Biol Chem. 2006281 :1612)。为了提供用于作为编码核酸或者蛋白给药的治疗性的单独的IL-15、或者与完整IL-15受体a或者可溶性IL-15受体a组合的IL-15，非常重要的是发展用于该细胞因子的有效表达载体和有效表达编码核酸序列。本发明涉及这种需要。发明简述本发明提供用于单独的白介素-15 (IL-15)以及与完整IL-15受体a (IL15Ra)或者IL15Ra的可溶形式(IL15sRa)组合的白介素_15 (IL-15)的高水平表达的核酸序列、表达载体和哺乳动物细胞。本发明还提供用于单独的白介素-15以及与完整IL-15受体a (IL15Ra)或者IL15Ra的可溶形式(IL15sRa)组合的白介素_15在哺乳动物细胞中高水平表达的方法。在一个相关方面，本发明提供用于完整IL-15受体a (IL15Ra)或者IL15Ra可溶形式(IL15sRa)高水平表达的核酸序列、表达载体和哺乳动物细胞。本发明还提供用于完整IL-15受体a (IL15Ra)或者IL15Ra可溶形式(IL15sRa)高水平表达的方法。一方面，本发明提供核酸序列，所述核酸序列编码与天然哺乳动物IL-15蛋白具有至少 90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一丨注的白介素-15(IL-15)蛋白，其中该核酸序列与编码天然哺乳动物IL-15的核酸序列在图8所标识的改变的核苷酸位置具有至少50%的差异。在一些实施方式中，核酸序列与编码天然哺乳动物IL-15的核酸序列在图4和/或图6所标识的改变的密码子位置具有至少50%的差异。在一些实施方式中，改变的核苷酸和密码子位于成熟IL-15序列。天然哺乳动物IL-15可以是任何哺乳动物IL-15，包括人IL-15、灵长类动物IL-15、猪IL-15、小鼠IL-15，等等。
在一些实施方式中，编码IL-15的核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图8所标识的115个改变的核苷酸位置(阴影)具有至少大约55% (例如，59个核苷酸)>60%(例如，64个核苷酸)、65% (例如，70个核苷酸)、70% (例如，75个核苷酸)、75% (例如，81个核苷酸)、80% (例如，86个核苷酸)、85% (例如，91个核苷酸)、90% (例如，97个核苷酸)、95% (例如，109个核苷酸)的差异。在一些实施方式中，编码IL-15的核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图4所标识的121个改变的密码子位置(阴影，加框或者下划线)具有至少大约55% (例如，66个密码子)、60% (例如，73个密码子)、65% (例如，78个密码子)、70% (例如，85个密码子)、75% (例如，91个密码子)、80% (例如，97个密码子)、85% (例如，103个密码子)、90% (例如，109个密码子)、95% (例如，115个密码子)的差异。在一些实施方式中，改变的核苷酸和密码子位于成熟IL-15序列。例如,编码改进的IL-15的核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图8所标识的成熟IL-15的78个改变的核苷酸位置(阴影)具有至少大约65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的差异。在另一个实施方式中，编码改进的IL-15的核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图4所标识的成熟IL-15的84个改变的密码子位置(阴影，加框或者下划线)具有至少大约65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 的差异。在一些实施方式中，核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在下列核苷酸位置不同6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、I14、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483 和 486，其中核苷酸位置如图 8所鉴定的。在一些实施方式中，核酸序列在下列核苷酸位置包括鸟嘌呤(g)或者胞嘧啶(C)核苷酸6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483 和 486，其中核苷酸位置如图 8所鉴定的。密码子可以任何方式不同使得相同或者相似的(即，保守取代的)氨基酸被编码。在一些实施方式中，改变密码子以增加GC含量。在一些实施方式中，改进的IL-15核酸序列均包括占序列长度至少大约50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %或者更高的GC含量(例如，脱氧鸟苷和脱氧胞苷脱氧核糖核苷残基或者鸟苷和胞苷核糖核苷残基)。编码IL-15 的核酸与 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4 和 / 或 SEQ ID NO 16 的核酸具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性。在一些实施方式中，如图8(SEQ ID NO :3或者SEQ ID NO 4)或者
图16(SEQ ID NO :16)所标识的，编码IL-15的核酸序列不同于编码天然IL-15的核酸序列。 在一些实施方式中，编码IL-15信号肽-前肽(SIG-PRO)的核酸序列被替换为编码异源蛋白的信号肽(SIG)或者信号肽-前肽(SIG-PRO)的核酸序列。在一些实施方式中，编码IL-15信号肽的核酸序列被替换为编码异源蛋白信号肽的核酸序列。异源蛋白可以来自，例如，组织纤溶酶原活化因子(tPA)、生长激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或者免疫球蛋白(例如，IgE)。在一个实施方式中，编码IL-15信号肽-前肽(SIG-PRO)的核酸序列被替换为编码tPA SIG-PRO的核酸序列，所述tPA SIG-PR0与SEQID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :25 或者 SEQ ID NO :27 具有 95%的序列同一性。在一些实施方式中，编码IL-15的核酸被可操作的连接到编码RNA输出元件的核酸，例如CTE或者 RTEm26CTE。在一些实施方式中，编码IL15Ra信号肽的核酸序列被替换为编码异源蛋白的信号肽(SIG)或者信号肽-前肽(SIG-PRO)的核酸序列。在一些实施方式中，编码IL15Ra信号肽的核酸序列被替换为编码异源蛋白信号肽的核酸序列。异源蛋白可以来自，例如，组织纤溶酶原活化因子(tPA)、生长激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或者免疫球蛋白(例如，IgE)。在一些实施方式中，编码IL15Ra的核酸被可操作的连接到编码RNA输出元件的核酸，例如CTE或者RTEm26CTE。另一方面，本发明提供编码来自除了 IL-15以外的蛋白的信号肽-前肽(SIG-PRO)序列的核酸序列，例如tPA SIG-PRO序列、生长激素信号序列(SIG)、免疫球蛋白信号序列(SIG)，所述核酸序列可操作的连接到编码与天然哺乳动物IL-15蛋白具有至少90%的序列同一性的IL-15蛋白的核酸，其中所述编码IL-15的核酸序列包括至少50%的GC含量。在一个实施方式中，SIG-PRO序列来自选自如下的蛋白tPA、GM-CSF、生长激素和免疫球蛋白家族蛋白。在一个实施方式中，SIG-PRO序列编码tPA SIG-PROjy^iitPA SIG-PRO与SEQID NO :6或者SEQ ID NO :8具有至少95 %的氨基酸序列同一性。在另一个实施方式中，SIG-PRO序列是tPA SIG-PR0，其与SEQ ID NO :5或者SEQID NO :7具有至少95%的核酸序列同一'I"生。其他实施方式如上所述。另一方面，本发明包括包含本发明核酸序列的表达载体和哺乳动物细胞，包括如上所述的实施方式。在一些实施方式中，编码IL-15和/或IL15Ra的核酸序列还包括用作疫苗佐剂的药物赋形剂。在一些实施方式中，编码IL-15和/或IL15Ra的核酸序列还包括用作免疫治疗因子的药物赋形剂，例如，在体外或者体内淋巴细胞数量的扩增中，所述淋巴细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞和NK T细胞。在一些实施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列用于扩增表达IL-2/IL-15i3 Y受体的淋巴细胞群。在一些实施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列用于扩增⑶4+和/或⑶8+T细胞。在一些实施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列用于在抗原刺激后扩增双分泌IL-2和IFN- Y的多功能细胞(例如，多功能T细胞)的数量。另一方面，本发明提供在哺乳动物细胞中表达IL-15的方法，该方法包括重组修饰哺乳动物细胞以表达编码IL-15蛋白的核酸，所述IL-15蛋白与天然哺乳动物IL-15蛋白具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性，其中该核酸序列与编码天然哺乳动物IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少·50%的不同。所述方法的实施方式如上所述用于核酸序列。在相关方面，本发明部分基于以下发现包括受体全部胞外结构域的完整IL-15受体a (IL15Ra)或者IL15Ra的可溶形式(IL15sRa)在体外和体内是IL-15的有效稳定剂。IL-15和IL15sRa复合物在循环中具有增强的稳定性，并具有增加的IL-15效力，这是通过包括天然杀伤(NK)细胞和T细胞的多个淋巴细胞亚群的扩增测定的。本发明提供在体外和体内增加IL-15效力的方法、表达载体和蛋白组合。这些方法可用于在给予个体(例如，哺乳动物、人)时增强IL-15的生物利用率、稳定性和效力，以及用于增强IL-15的生物学功效。本发明提供用于IL-15与其受体IL-15受体a (IL15Ra)协同表达的表达载体。该载体通常包含一个拷贝的IL-15编码序列或/和一个拷贝的IL-15受体a (IL15Ra)(完整或者可溶的)。两个蛋白的表达比例可以调整为I : 1、1 : 2或者I : 3，例如，通过利用不同的质粒DNA比例(w/w)或者通过选择不同表达强度的启动子。在一些实施方式中，IL-15细胞因子和IL-15受体a (IL15Ra)表达的摩尔比例为I : 3。在一个实施方式中，根据此处描述的本方法,至少一个IL-15细胞因子和IL-15受体a (IL15Ra)的核酸序列被改进。IL-15细胞因子和完整或者可溶的IL-15受体a (IL15Ra)的共表达增加从细胞表达和分泌的IL-15细胞因子和IL15Ra的量，与IL-15单独表达相比，尤其是与野生型IL-15序列相比，超过10倍、100倍、10，000倍、100, 000倍、1，000, 000倍或者更高。与单独的IL-15相比，使用这种载体增强IL-15和IL15ra的稳定性超过10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或者更高，并且在体内增加IL-15蛋白的稳态水平。与单独的IL-15相比，与IL15Ra共表达的IL-15的生物功能(例如，淋巴细胞扩增的活化和诱导，所述淋巴细胞包括B细胞、T细胞、天然杀伤(NK)细胞和NK T细胞)在体内也显著增强，超过10倍、15倍、20倍或者更高。这些载体可用于增加生物活性细胞因子在特定组织中的递送。发现IL-15和IL15Ra载体和蛋白在预防和治疗性疫苗接种、癌症免疫治疗或者任何用于增强淋巴细胞数量和功能的适应症和任何免疫缺陷状况中的用途。一方面，本发明提供用于IL-15与完整IL15Ra或者可溶性IL15Ra协同表达的表达载体。IL-15和完整IL15Ra或者可溶性IL15Ra可以包含在相同的表达载体或者包含在多个表达载体中。在一些实施方式中，根据用于高效表达的本方法，至少一个IL-15和完整IL15Ra或者可溶性IL15Ra的编码核酸序列被改进。本发明的一方面是提供的载体能够快速产生可溶性胞外IL15sRa的天然形式，当递送到哺乳动物细胞或者哺乳动物时所述载体表达IL-15和全长IL15Ra。因此，IL-15和IL15Ra的共递送和表达在细胞表面产生IL-15/IL-15R复合物以及IL_15/IL15sRa复合物，它们被释放到循环中，可以在远处组织中起作用。另一方面，本发明提供编码完整IL-15受体a (IL15Ra)或者IL15Ra可溶形式(IL15sRa)的改进的核酸序列，它们与天然哺乳动物IL-15受体a (IL15Ra)或者IL15Ra可溶形式(IL15sRa)的蛋白(参见，例如，NM_002189)具有至少90%、91 %、92%、93%、94%、95%,96%,97%,98%、99%的序列同一性，其中该核酸序列与编码天然哺乳动物IL-15的核酸序列在图35-38所标识的改变的核苷酸位置具有至少50%的不同。在一些实施方式中，IL15Ra(完整或者可溶形式的)的编码序列与图35_38中任意 一个所示的核酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或者99%的序列同一性。在一个实施方式中，IL15Ra由图35-38中任意一个所不的核酸序列编码。在一个实施方式中，改进的IL15Ra (完整或者可溶的)编码核酸序列具有至少50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80%或者85%的GC含量。本发明还提供增加IL-15数量、稳定性和生物活性的方法。该方法可以在体外进行，通过在哺乳动物宿主细胞中共表达IL-15和IL15Ra或者IL15sRa。该方法可以在体内进行，通过给个体给予IL-15和IL-15受体α (完整或者可溶的)的组合，作为用于注射的蛋白或者作为在体内产生的DNA构建体(天然或者改进的)。根据此处描述的方法，可以改进IL-15和IL15Ra编码序列中的一个或者两个。本发明还提供协同产生IL-15和IL-15可溶性受体a (IL15sRa)的宿主细胞和细胞系，或者协同产生IL-15以及可溶性和全长IL15Ra混合物的细胞系。另一方面，本发明提供增强个体抗一种或者多种抗原的免疫应答的方法，通过给予本发明改进的单独的IL-15核酸或者与IL15Ra组合的IL-15核酸。IL15Ra可以是野生型或者改进的蛋白或者核酸形式。另一方面，本发明提供扩增淋巴细胞数量的方法，例如，用于体内或者体外减轻免疫缺陷状况，通过给予本发明改进的IL-15核酸(单独的或者与IL15Ra组合)。IL15Ra可以是野生型或者改进的蛋白或者核酸形式。在一些实施方式中，淋巴细胞选自B细胞、T细胞、NK细胞和NK T细胞。在一些实施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列促进表达IL-2/IL-Ιδβ Y受体的淋巴细胞群的扩增。在一些实施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列刺激⑶4+和/或⑶8+T细胞的扩增。在一些实施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列在抗原刺激时诱导双分泌IL-2和IFN- Y的多功能细胞(例如，多功能T细胞)数量的扩+
>曰ο在一些实施方式中，通过注射和/或电穿孔给予DNA构建体中的一个或者两个。通过注射和电穿孔两种途径的给药可以在相同或者不同的位点同时或者连续进行。定义术语“天然哺乳动物白介素-15(IL_15) ”是指来自哺乳动物种的IL-15的任何天然存在的白介素-15核酸和氨基酸序列。本领域技术人员清楚白介素-15核酸和氨基酸序列在基因数据库中已经公开提供，例如，在万维网ncbi. nlm. nih. gov上National Centerfor Biotechnological Information (国家生物技术信息中心)提供的GenBank。不例性的天然哺乳动物IL-15核酸或者氨基酸序列可以来自于，例如，人、灵长类动物、犬、猫、猪、马、牛、绵羊、啮齿目、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠，等等。示例性天然哺乳动物IL-15核酸序列的登录号包括 NM_172174(人；SEQ ID NO :1)、NM_172175 (人)、NM_000585 (人)、U19843 (恒河猴；SEQ ID NO :14)、DQ021912 (恒河猴)、ABOOO555 (恒河猴)、NlL2H39O (猪)、DQ152967(绵羊)、NM_174090 (牛)、NM_008357 (小鼠)、NM_013129(鼠属)、DQ083522 (水牛)、XM_844053 (犬)、DQ157452 (兔类)、和NM_001009207 (猫)。示例性天然哺乳动物IL-15氨基酸序列的登录号包括 NP_751914 (人；SEQ ID NO :2)、CAG46804 (人)、CAG46777 (人)、AAB60398(恒河猴；SEQ ID NO :15)、AAY45895 (恒河猴)、NP_999555 (猪)、NP_776515 (牛)、AAY83832 (水牛)'ABBO23OO (绵羊)、XP_849146 (犬)、NP_001009207 (猫)、NP_037261 (鼠属)、和 NP_032383(小鼠)。术语“白介素-15”或者“IL-15”是指与天然哺乳动物IL-15氨基酸序列具有 至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者 99%序列同一性的多肽，或者编码这种多肽的核苷酸，是有生物学活性的，意思指突变的蛋白(“突变蛋白”)与天然IL-15蛋白在至少一种功能检测中具有功能性的相似(75%或者更高)。IL-15多肽的示例性功能检测包括T细胞的增殖(参见,例如，Montes,等人,Clin Exp Immunol (2005) 142 292)，以及NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的活化。用于特定免疫细胞亚群的分离和增殖检测(即，3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法)的方法是本领域公知的。细胞-介导的细胞毒性检测可用于测量NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞活化。细胞-介导的细胞毒性检测，包括同位素(51Cr)、染料(例如四唑、中性红)或者酶的释放，也是本领域公知的，可利用商品化供应的试剂盒(Oxford Biomedical Research, Oxford, M ；Cambrex, ffalkersville, MD ；Invitrogen, Carlsbad, CA)。IL-15 还显不抑制 Fas 介导的凋亡(参见，Demirci and Li,Cell Mol Immunol (2004) I :123)。凋亡检测，包括例如TUNEL检测和膜联蛋白V检测，是本领域公知的，可利用商品化供应的试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN)。还可参见，Coligan,等人，Current Methods in Immunology, 1991-2006, John Wiley&Sons。术语“天然哺乳动物白介素-15受体a (IL15Ra) ”是指来自哺乳动物种的IL-15受体α的任何天然存在的白介素-15受体α核酸和氨基酸序列。本领域技术人员清楚白介素-15受体α核酸和氨基酸序列在基因数据库中已经公开提供，例如，在万维网ncbi.nlm. nih. gov上国家生物技术信息中心提供的GenBank。示例性的天然哺乳动物IL-15受体α核酸或者氨基酸序列可以来自于，例如，人、灵长类动物、犬、猫、猪、马、牛、绵羊、啮齿目、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠，等等。示例性天然哺乳动物IL-15核酸序列的登录号包括ΝΜ_002189(智人白介素15受体，a (IL15RA)，转录变异体1，mRNA)。术语“白介素-15受体α ”或者“IL15Ra”是指与天然哺乳动物IL15Ra氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者99%序列同一性的多肽，或者编码这种多肽的核苷酸，是有生物学活性的，意思指突变的蛋白(“突变蛋白”)与天然IL15Ra蛋白在至少一种功能检测中具有功能性的相似(75%或者更高)。一种功能检测是与天然IL-15蛋白的特异结合。术语“核酸”是指采用单-链或者双-链形式的脱氧核糖核酸或者核糖核苷酸和其聚合物。该术语包括包含已知核苷酸类似物或者修饰的骨架残基或者键的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，与参照核酸具有相似的结合性质，以类似于参照核苷酸的方式进行代谢。这种类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺脂、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另外指出，特定核酸序列还隐含的包括其保守修饰的变异体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指定的序列。通过产生序列实现简并密码子取代，该序列中一个或者多个选择的(或者所有的)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081 (1991) ；0htsuka 等人，J. Biol. Chem. 260 2605-2608(1985) ;Rossolini 等人，Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。术语核酸可以与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。天然存在氨基酸的简并密码子取代显示于表I。表I
权利要求
1.编码白介素-15(IL-15)蛋白的核酸序列，所述IL-15蛋白与天然哺乳动物的IL-15蛋白具有至少90%的序列同一性，其中所述核酸序列与编码天然哺乳动物IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少50%的差异。
2.如权利要求I所述的核酸序列，其中所述天然IL-15是人IL-15。
3.如权利要求I所述的核酸序列，其中所述天然IL-15是灵长类动物IL-15。
4.如权利要求I所述的核酸序列，其中所述核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少80%的差异。
5.如权利要求I所述的核酸序列，其中所述核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少90%的差异。
6.如权利要求I所述的核酸序列，其中所述核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少95%的差异。
7.如权利要求I所述的核酸序列，其中所述核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在下列核苷酸位置不同:6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、I14、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483 和 486，其中所述核苷酸位置如图8所鉴定的。
8.如权利要求I所述的核酸序列，其中所述核酸序列在下列核苷酸位置包括鸟嘌呤(g)或者胞嘧啶(c)核苷酸6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483 和486，其中所述核苷酸位置如图8所鉴定的。
9.如权利要求I所述的核酸序列,其中所述核酸序列包括至少50%的GC含量。
10.如权利要求I所述的核酸序列，其中所述核酸序列与SEQIDNO :3具有至少90%的序列同一性。
11.如权利要求I所述的核酸序列，其中所述编码IL-15信号肽-前肽(SIG-PRO)的核酸序列被替换为编码异源蛋白的SIG-PRO或者信号肽(SIG)的核酸序列。
12.如权利要求11所述的核酸序列，其中所述异源蛋白选自组织纤溶酶原活化因子(tPA)、生长激素和免疫球蛋白。
13.如权利要求I所述的核酸序列，其中所述编码IL-15SIG-PR0的核酸序列被替换为编码 tPA SIG-PRO 的核酸序列，所述 tPA SIG-PRO 与 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ IDNO 25或者SEQ ID NO 27具有95%的序列同一性。
14.如权利要求I所述的核酸序列，其中与天然IL-15核酸序列的IL-15生成相比，所述核酸序列的IL-15生成增加至少5倍。
15.如权利要求I所述的核酸序列，被可操作的连接到编码RNA输出元件的核酸。
16.包括如权利要求I所述核酸序列的表达载体。
17.包括如权利要求I所述核酸序列的哺乳动物细胞。
18.如权利要求I所述的核酸序列，还包括药物赋形剂。
19.在哺乳动物细胞中表达IL-15的方法，所述方法包括重组修饰哺乳动物细胞以表达编码IL-15蛋白的核酸，所述IL-15蛋白与天然哺乳动物IL-15蛋白具有至少90%的序列同一性，其中所述核酸序列与编码天然哺乳动物IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少50%的不同。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少80%的差异。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少90%的差异。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少95%的差异。
23.如权利要求19所述的方法，其中所述核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在下列核苷酸位置不同:6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、I14、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483 和 486，其中所述核苷酸位置如图8所鉴定的。
24.如权利要求19所述的方法，其中所述核酸序列在下列核苷酸位置包括鸟嘌呤(g)或者胞嘧啶(c)核苷酸:6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483 和486，其中所述核苷酸位置如图8所鉴定的。
25.如权利要求19所述的方法，其中所述核酸序列包括至少50%的GC含量。
26.如权利要求19所述的方法，其中所述核酸序列与SEQID NO :3具有至少90%的序列同一'I"生。
27.编码与SEQID NO:5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :24或者SEQID NO :26具有至少95%序列同一性的tPA SIG-PRO序列的核酸序列，可操作地连接到编码与天然哺乳动物IL-15蛋白具有至少90%序列同一性的IL-15蛋白的核酸，其中所述编码IL-15的核酸序列包括至少50%的GC含量。
28.如权利要求27所述的核酸序列，其中所述天然IL-15是人IL-15。
29.如权利要求27所述的核酸序列，其中所述天然IL-15是灵长类动物IL-15。
30.如权利要求27所述的核酸序列，其中所述核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少50%的差异。
31.如权利要求27所述的核酸序列，其中所述核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少80%的差异。
32.如权利要求27所述的核酸序列，其中所述核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少90%的差异。
33.如权利要求27所述的核酸序列，其中所述该核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在下列核苷酸位置不同:6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483 和486，其中所述核苷酸位置如图8所标识的。
34.如权利要求27所述的核酸序列，其中所述该核酸序列在下列核苷酸位置包括鸟嘌呤(g)或者胞嘧啶(c)核苷酸6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483 和486，其中所述核苷酸位置如图8所鉴定的。
35.如权利要求27所述的核酸序列，其中所述核酸序列与SEQIDNO :9或者SEQ ID NO:11具有至少90%的序列同一性。
36.如权利要求27所述的核酸序列，其中与天然IL-15核酸序列的IL-15生成相比，所述核酸序列的IL-15生成增加至少5倍。
37.改进的白介素15受体α编码核酸序列，与图35、36、37和38中任意一个所不的核酸序列具有至少90%的序列同一性。
38.包括哺乳动物IL-15和哺乳动物IL15Ra的编码序列的表达载体。
39.如权利要求38所述的表达载体，其中所述哺乳动物IL-15的编码序列编码与天然哺乳动物IL-15蛋白具有至少90%序列同一性的IL-15蛋白，其中所述核酸序列与编码天然哺乳动物IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少50%的差异。
40.如权利要求38所述的表达载体，其中所述哺乳动物IL15Ra的编码序列与图35、36、37和38中任意一个所不的核酸序列具有至少90%的序列同一'丨生。
41.包括IL-15序列和IL15Ra序列的药物组合物。
42.如权利要求41所述的药物组合物，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列是氨基酸序列。
43.如权利要求41所述的药物组合物，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列是核酸序列。
44.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述哺乳动物IL-15的编码序列编码与天然哺乳动物的IL-15蛋白具有至少90%序列同一性的IL-15蛋白，其中所述核酸序列与编码天然哺乳动物IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少50%的差异。
45.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述哺乳动物IL15Ra的编码序列与图35、36、37和38中任意一个所不的核酸序列具有至少90%的序列同一'丨生。
46.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列核酸序列位于单个表达载体中。
47.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列核酸序列位于多个表达载体中。
48.提高IL-15在个体中的稳定性和效力的方法，包括对个体共给药IL-15序列和IL15Ra 序列 ο
49.如权利要求48所述的方法，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列是氨基酸序列。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列是核酸序列。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述哺乳动物IL-15的编码序列编码与天然哺乳动物的IL-15蛋白具有至少90%序列同一性的IL-15蛋白，其中所述核酸序列与编码天然哺乳动物IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少50%的差异。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述哺乳动物IL15Ra的编码序列与图35、36、37和38中任意一个所示的核酸序列具有至少90%的序列同一性。
53.如权利要求50所述的方法，其中所述编码IL-15和IL15Ra的核酸序列在单个表达载体中被给药。
54.如权利要求50所述的方法，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列核酸序列在多个表达载体中被给药。
55.在需要淋巴细胞的个体中扩增淋巴细胞的方法，包括对个体共给药IL-15序列和IL15Ra 序列 ο
56.如权利要求55所述的方法，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列是氨基酸序列。
57.如权利要求55所述的方法，其中所述IL-15序列和IL15Ra序列是核酸序列。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述哺乳动物IL-15的编码序列编码与天然哺乳动物的IL-15蛋白具有至少90%序列同一性的IL-15蛋白，其中所述核酸序列与编码天然哺乳动物IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少50%的差异。
59.如权利要求57所述的方法，其中所述哺乳动物IL15Ra的编码序列与图35、36、37和38中任意一个所示的核酸序列具有至少90%的序列同一性。
60.如权利要求57所述的方法，其中所述编码IL-15和IL15Ra的核酸序列在单个表达载体中被给药。
全文摘要
本发明提供用于提高白介素-15(IL-15)在哺乳动物细胞中表达的核酸。本发明还提供在哺乳动物细胞中表达IL-15的方法，通过用包括密码子优化的IL-15序列的核酸序列转染细胞。本发明还提供表达载体，以及IL-15和IL-15受体α组合(核酸和蛋白)，所述组合增加IL-15稳定性以及体外和体内的效力。本方法用于在对个体(例如哺乳动物、人)的DNA、RNA或者蛋白给药后增强IL-15的生物利用率和生物学功效。
文档编号A61K48/00GK102796743SQ20121011921
公开日2012年11月28日 申请日期2007年1月12日 优先权日2006年1月13日
发明者芭芭拉·K·费尔博尔, 乔治·N·巴甫拉吉斯 申请人:美国政府健康及人类服务部国立卫生研究院