专利名称：无指盘臭蛙促皮肤修复多肽ah90和cw49的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49在促进皮肤修复、减少疤痕以及治疗相关皮肤性疾病中的应用。
背景技术：
皮肤作为机体天然的保护屏障，有机械阻挡病原体的作用。一旦皮肤的天然屏障作用被损坏，机体就会立即自动开启生理开关进行皮肤的损伤修复。人体皮肤损伤后的愈合，同时存在上述的组织补充和疤痕愈合两个过程。上皮细胞由正常皮肤边缘向心性爬行生长，或由皮肤附属器汗腺、毛囊的上皮向外扩展生长，最后完成创面上皮覆盖。真皮组织对损伤的反应，是形成肉芽组织，肉芽组织实际上是ー种炎症组织，从细胞学角度来看，肉 芽组织包括新生的毛细血管内皮细胞，由局部原始的中胚层细胞分化来的纤维母细胞及其合成物，如胶原纤维、粘多糖等。疤痕是由肉芽组织发育形成，生长到一定阶段后自行停止并逐渐吸收消退。一般的创面愈合后半年至一年内瘢痕仍在增生，其后逐渐吸收平复。但此过程可延续几年、十几年尚不能完成。无指盘臭蛙为蛙科蛙属的两栖动物，是中国的特有物种。分布于四川、贵州、云南等地，常生活于中小山溪内植物茂盛以及阴暗潮湿处。其生存的海抜范围为720至3200米。无指盘臭蛙适应其自生存的自然环境以及避免受伤等机体损伤，在长期的进化过程中，无指盘臭蛙的皮肤发展成为具有多种功能的器官，如分泌大量抗菌肽抵御微生物侵袭；分泌神经毒素对抗各类天故；分泌生长因子促进伤ロ愈合等。本发明研究的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对皮肤修复功能，目前为止尚未有这两种多肽能修复皮肤的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49在制备治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡、减少疤痕产生、加快疤痕修复药物中的应用。本发明的所用的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49采用常规的化学合成的方法获得；其中I.无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90的分子量为2657. 18 Da，等电点为10. 26，其全序列ー级结构为 ATAWDFGPHGLLPIRPIRIRPLCG。2、无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49的分子量为1210. 43 Da，等电点为8. 29，全序列ー级结构为APFRMGICTTN。本发明的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49在制备治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡、减少疤痕产生、加快疤痕修复药物中的应用。本发明的内容在小鼠的动物模型上试验，其试验方案为常规方法，具体如下I.无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对伤ロ的愈合作用小鼠用2%戊巴比妥钠麻酔后，背部两侧皮肤用剃毛器除毛，酒精消毒后，在其后背开两个直径7mm的创ロ，样品溶解于PBS中(AH的浓度O. 05mg/ml，Cff浓度为lmg/ml )，每天给药两次，每次30ul。样品加在右侧创面，左侧创面加相应体积的PBS作阴性对照。每隔两天用相机拍下创面变化，即DAYO，DAY2，DAY4，DAY6，DAY8直到加药创面完全脱痂愈合为止。拍照时用量尺比照创ロ作标尺。最后用作图软件计算创面大小变化，采用histologicalscore的评分系统评分。II.无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对真皮、表皮的增生作用。A:石蜡切片I.取材将小鼠处死后剪取创面皮肤组织
2.固定将切好的肝组织用生理盐水组织洗ー下，立即投入中性福尔马林固定液中3.洗涤材料经固定后，流水冲洗，数小时或过夜。4.脱水材料依次经70%、80%、90%各级こ醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，姆次20min。5.透明纯酒精、ニ甲苯等量混合液15min, ニ甲苯I 15min、II 15min (至透明为止)。6.透蜡放入ニ甲苯和石腊各半的混合液15min,再放入石腊I、石腊II透腊各50_60分钟。7.包埋用镊子夹取石蜡模子(金属质地)在酒精灯上稍加热，放在平的桌面上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡。再将镊子在酒精灯上稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整齐。再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。8.切片①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。②将切片刀固定在刀夹上，刀ロ向上。③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀ロ贴近，但不可超过刀ロ。④调整石蜡块与刀ロ之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10微米。⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将腊带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50r/min。⑦切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另ー支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。⑧用单面刀片切取蜡片ー小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净保存。
9.展片、贴片打开水浴锅，使水温维持在40_45°C，另准备30%こ醇溶液。①切片时，将ー碗30%こ醇溶液放于切片机旁的桌面上。②用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在こ醇溶液的水面上，使切片展开。③小镊子轻轻地将连在一起的切片分开，用ー个载玻片将切片完整，已展开的切片捞至温水中，使之充分展开。④另取洁净的载玻片，捞起展开的切片，使其位于切片1/3处，另一端(磨边，粗糙的一端)磨面上标记或贴上标签，放于切片架上。10.脱蜡复水
将水浴锅温度调至60°C，待水温控制在60°C时，将切片连同切片架放入一干燥的染色缸内，放入水浴锅中，盖上盖子(可密封)，30min至蜡熔化。之后，石蜡切片经ニ甲苯I、II脱蜡各5min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各3_5min，再放入蒸馏水中 3min。B: HE 染色I.切片放入苏木精中染色约10_30min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。冬季室温低时放入恒温箱中染色。2.水洗用自来水流水冲洗15min。使切片颜色变蓝(或放入碱性水中)，但要注意流水不能过大，以防切片脱落。3.分化将切片放入1%盐酸こ醇液中褪色，2秒至数十秒钟，见切片变红，颜色较浅。4.漂洗切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。5.脱水 I切片入50%こ醇一70%こ醇一80%こ醇中各3_5min。6、复染用O. 5%伊红こ醇液对比染色l_3min。7.脱水II将切片放入95%こ醇中洗去多余的红色，然后放入无水こ醇中3_5min。最后用吸水纸吸干多余的こ醇。8.透明切片放入ニ甲苯I、II中各3_5min。9.封藏中性树胶封存C:表皮厚度计算。将染色后的切片拍照，最后用软件ImageJ计算表皮厚度，采用histologicalscore的评分系统评分。本发明的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49能促进皮肤的修复，同时能减少皮肤修复过程中表皮的增生厚度，能够用于制备治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡的药物。
图1-A、图1-B、图1-C、图1_D、图1_E分别显示O天、2天、4天、6天、8天无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90对小鼠皮肤损伤模型的对照及治疗作用。图2-A、图2-B、图2-C、图2-D、图2-E分别显示O天、2天、4天、6天、8天无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49对小鼠皮肤损伤模型的对照及治疗作用。图3-A、图3-B、图3_C、图3-D、图3_E、图3_F分别为无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90对小鼠皮肤的对照及治疗作用切片图。
图4-A、图4-B、图4-C、图4-D、图4-E、图4-F分别为无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49对小鼠皮肤的对照及治疗作用作用切片图。图5-A、图5-B分别为无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对皮肤愈合的评分。图6-A、图6-B分别为无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对表皮増殖作用。
图7-A、图7-B分别为无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对表皮增殖评分。
具体实施例方式本发明的所用的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49采用常规的化学合成的方法获得；其中I.无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90的分子量为2657. 18 Da，等电点为10. 26，其全序列ー级结构为 ATAWDFGPHGLLP IRPIRIRPLCG。2、无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49的分子量为1210. 43 Da，等电点为8. 29，全序列ー级结构为APFRMGICTTN。本发明的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49在制备治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡药物中的应用。本发明的内容在小鼠的动物模型上试验，其试验方案为常规方法，具体步骤同发明内容部分的描述。实施例I :无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90对小鼠皮肤损伤模型的修复作用。取O. 05mg/ml无指盘臭娃促皮肤修复多肽AH90进行试验,结果为能迅速促进皮肤的修复功能(图1-A、图1-B、图1-C、图1-D、图1-E)，第二天的修复效果比较明显，第四天结痂，第六天基本上完全恢复，并且和对照小鼠的皮肤修复有明显的差异。实施例2 无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49对小鼠皮肤损伤模型的修复作用。取lmg/ml无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49进行试验，结果为能迅速促进皮肤的修复功能(图1-A、图1-B、图1-C、图1-D、图1-E)，第二天的修复效果比较明显，第四天结痂，第八天基本上完全恢复，并且和对照小鼠的皮肤修复有明显的差异。实施例3 无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90对小鼠皮肤修复作用切片图。小鼠皮肤在恢复的过程中，将每天恢复效果做成切片，观察皮肤表皮生长情況。图3-A、图3-B、图3-C、图3-D、图3-E、图3-F显示加入AH90治疗后的第三天肉芽组织形成，第五天表皮组织基本上完全恢复，第九天治疗组的表皮组织厚度与对照组相比明显減少。实施例4
无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49对小鼠皮肤修复作用切片图。切片结果表明(图4-A、图4-B、图4-C、图4-D、图4-E、图4-F)，无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49治疗后第三天形成较厚的增生表皮组织，第五天增生的表皮组织厚度減少，第九天表皮厚度恢复正常且有腺体产生。实施例5 无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对肉芽组织愈合的评分。小鼠皮肤的创伤后涂抹无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49，对每天小鼠伤ロ的愈合情况拍照，采用histological score的评分系统对肉芽组织愈合进行评分。结果表明(图5-A、图5-B)，使用无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49后，肉芽组织愈合的程度和对照有明显统计学差异(*P〈0. 01)。 实施例6 无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对表皮増殖作用。如图6-A、图6-B所示，小鼠皮肤损伤恢复的过程中表皮的厚度明显增加，涂抹无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49后表皮的厚度増加明显小于对照组并且和对照组有明显统计学差异(*P〈0. 01)，AH90和CW49具有预防疤痕产生的作用。实施例7 无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对真皮和表皮增殖评分。将小鼠皮肤恢复的部位做成切片，然后拍照观察表皮的増殖厚度，采用histological score的评分系统对皮肤修复进行评分。结果表明(图7-A、图7-B),使用指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49表皮和真皮评分和对照组有显著性的差异。
权利要求
1.分子量为2657.18 Da,等电点为10. 26，其全序列一级结构为ATAffDFGPHGLLPIRPIRIRPLCG的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90在制备治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡、减少疤痕产生、加快疤痕修复药物中的应用。
2.分子量为1210.43 Da，等电点为8. 29，全序列一级结构为APFRMGICTTN的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49在制备治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡、减少疤痕产生、加快疤痕修复药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49的应用。本发明的分子量为2657.18 Da，等电点为10.26，其全序列一级结构为ATAWDFGPHGLLPIRPIRIRPLCG的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90作为药物在治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡、减少疤痕产生、加快疤痕修复方面的应用。本发明的分子量为1210.43 Da，等电点为8.29，全序列一级结构为APFRMGICTTN的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49作为药物在治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡、减少疤痕产生、加快疤痕修复方面的应用。本发明的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49能促进皮肤的修复，同时能减少皮肤修复过程中表皮的增生厚度，能够用于制备治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡、减少疤痕产生、加快疤痕修复的药物。
文档编号A61K38/17GK102657845SQ20121017427
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者刘涵, 容明强, 赖仞 申请人:中国科学院昆明动物研究所