专利名称：用于在酵母细胞表面上展示多肽的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本文中提供了用于在酵母的细胞表面上展示多肽(例如，抗体多肽或抗体多肽片段)的方法和组合物。可以与本文中公开的各种方法和组合物联合使用的例示性酵母包括耶氏酵母属(Yarrowia)的那些酵母,例如,解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)。
背景技术：
高亲和力试剂，例如抗体或其片段对于临床和研究应用两者都是有用的工具。许多体外和体内平台已经用于分离和表征抗体，包括核糖体展示、噬菌体展示、和大肠杆菌(E. coli)中的周质表达。已经使用的另一种平台是是酵母细胞表面展示(YSD)。用于在耶氏酵母属菌株的细胞表面上展示抗体及其片段的组合物和方法会是有 利的。发明概述本文中提供了用于在酵母细胞的表面上展示多肽(例如，抗体多肽或抗体多肽片段)的方法和组合物。可以与本文中公开的各种方法和组合物联合使用的例示性酵母包括耶氏酵母属的那些酵母，例如，解脂耶氏酵母。在某些实施方案中，本文中提供的组合物包含表达盒，所述表达盒包含与融合序列可操作连接的启动子，所述融合序列包含与第二核酸序列以符合读码框的方式融合的第一核酸序列，所述第一核酸序列包含编码锚多肽的核苷酸序列，所述第二核酸序列包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，本文中提供的组合物包含表达盒，所述表达盒包含与第一核酸序列可操作连接的启动子，所述第一核酸序列包含编码锚多肽的锚核苷酸序列，其中所述第一核酸序列可以在融合多肽中作为第一融合配偶体表达，所述融合多肽包含由第二核酸序列编码的感兴趣的第二融合配偶体。在某些实施方案中，表达盒进一步包含编码所述感兴趣的第二融合配偶体的第二核酸序列，例如，整个或部分的限制性位点。在某些实施方案中，所述感兴趣的第二融合配偶体包含抗体多肽或抗体多肽片段。在某些实施方案中，抗体多肽片段是scFv片段、Fab片段的重链、或Fab片段的轻链。在某些实施方案中，在第二核酸序列3’融合表达盒的第一核酸序列，使得自所述融合序列生成的融合多肽包含N端抗体多肽或抗体多肽片段和C端锚多肽。在某些实施方案中，在第二核酸序列5’融合表达盒的第一核酸序列，使得自所述融合序列生成的融合多肽包含N端锚多肽和C端抗体多肽或抗体多肽片段。在某些实施方案中，表达盒包含组成性启动子。在某些实施方案中，表达盒包含诱导型启动子，例如，P0X2或LIP2启动子。在某些实施方案中，表达盒包含半诱导型启动子，例如ph4d启动子。在某些实施方案中，表达盒包含前导核酸序列，所述的前导核酸序列包含编码前导多肽的核苷酸序列，其中在所述第一和第二核酸序列的5’以符合读码框的方式融合所述前导核酸序列。例示性的前导核酸序列包括但不限于前LIP2 (LIP2 pre)、前原LIP2 (LIP2prepro)、前 XPR2 (XPR2 pre)、和前原 XPR2 (XPR2 prepro)。
在某些实施方案中，表达盒包含接头核酸序列，所述接头核酸序列包含编码接头多肽的核苷酸序列。例如，所述接头核酸序列可以在所述第一和第二核酸序列间以符合读码框的方式融合。在某些实施方案中，所述抗体多肽包含SCFv抗体多肽，且所述接头核酸序列在编码所述scFv多肽的可变区的重链核酸序列和编码可变区的轻链核酸序列间以符合读码框的方式融合。接头多肽的非限制性例子包括(Gly4Ser)3* (GlySer)5。在某些实施方案中，表达盒包含一种或多种核酸序列，所述一种或多种核酸序列包含编码一种或多种表位标签的核苷酸序列。例不性的表位标签包括但不限于c_Myc、V5、六组氨酸、谷胱甘肽-S-转移酶、链霉亲合素、生物素、血凝素、Flag标签、和E标签。在某些实施方案中，表达盒包含锚多肽。锚多肽的非限制性例子包括Agalp多肽或其片段、Aga2p多肽或其片段、和Saglp多肽或其片段。在某些实施方案中，表达盒包含抗体多肽或抗体多肽片段、锚多肽、或这两者，其经密码子优化以在耶氏酵母属细胞中表达。
在某些实施方案中，本文中提供的组合物包含一种载体，其包含上文描述的任何表达盒。在某些实施方案中，载体包含捷塔(zeta，元件。例示性的捷塔元件包括但不限于反转录转座子的长末端重复，诸如例如Yltl或Tyl6反转录转座子。在某些实施方案中，载体包含一种或多种常染色体复制元件，例如，包含着丝粒(CEN)和复制起点(ORI)的常染色体复制元件。例示性的着丝粒包括但不限于CENl和CEN3。例示性的复制起点包括但不限于0RI1068或0RI3018。在某些实施方案中，载体包括自主复制序列(ARS)，其包含着丝粒和复制起点。例示性的ARS包括但不限于ARS18和ARS68。在某些实施方案中，载体包含一种或多种核酸序列，所述一种或多种核酸序列包含编码一种或多种选择标志的核苷酸序列。选择标志的非限制性例子包括LEU2、URA3dl、ADE2、Lys、Arg、Gut、Trp, G3p、和
hpho在某些实施方案中，本文中提供的方法包括用于在耶氏酵母属细胞的表面上展示抗体多肽或抗体多肽片段的方法。例如，可以如下在耶氏酵母属细胞的表面上展示抗体多肽或抗体多肽片段，即将第一载体导入第一耶氏酵母属细胞中，所述第一载体包含与融合序列可操作连接的启动子，所述融合序列包含与第二核酸序列以符合读码框的方式融合的第一核酸序列，所述第一核酸序列包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列，所述第二核酸序列包含编码锚多肽的核苷酸序列，并将所述第一耶氏酵母属细胞在耶氏酵母属细胞操作条件下温育一段时间。例示性的第一载体包括但不限于上文描述的任何载体。在某些实施方案中，抗体多肽片段是scFv片段、Fab片段的重链、或Fab片段的轻链。在某些实施方案中，方法可以包括将第二载体导入所述第一耶氏酵母属细胞中，所述第二载体包含与编码Fab片段轻链或Fab片段重链的核酸序列可操作连接的第二启动子。在某些实施方案中，第一耶氏酵母属细胞是单倍体，且导入所述第二载体的步骤包括将包含第一载体的第一单倍体耶氏酵母属细胞与包含第二载体的第二单倍体耶氏酵母属细胞交配，所述第一和第二耶氏酵母属细胞是相反交配型的。在某些实施方案中，在第二核酸序列5’融合第一核酸序列，使得由所述融合序列生成的融合多肽包含N端抗体多肽或其抗体多肽片段和C端锚多肽。在某些实施方案中，在第二核酸序列3’融合第一核酸序列，使得由所述融合序列生成的融合多肽包含N端锚多肽和C端抗体多肽或抗体多肽片段。
在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包含低诱导温度，例如，约15摄氏度和25摄氏度间的温度。非限制性的低诱导温度包括约20摄氏度的温度。在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包括短诱导时间，例如，约24小时或更少、约16小时或更少、或约16小时。在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包括低pH，例如，约2和约4间的pH，或约3的pH。在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包括高通气条件，例如，在摇瓶中温育。在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞操作条件包括在极限培养基，例如，缺乏酵母提取物、细菌用蛋白胨、或这两者的培养基中温育。在某些实施方案中，将第一载体整合入耶氏酵母属基因组中。在某些实施方案中，耶氏酵母属细胞表达蛋白伴侣，例如，蛋白质二硫键异构酶，和/或Kar2/Bip。在某些实施方案中，本文中提供的组合物包含通过上文描述的任何方法获得的抗体多肽或抗体多肽片段。在某些实施方案中，提供了选择包含结合靶多肽的抗体多肽或抗体多肽片段的耶 氏酵母属细胞的方法。例如，可以如下选择包含结合靶多肽的抗体多肽或抗体多肽片段的耶氏酵母属细胞，即提供在其表面上展示抗体多肽或抗体多肽片段的亲本耶氏酵母属细胞(例如，通过上文描述的任何方法生成的耶氏酵母属细胞)，使所述亲本耶氏酵母属细胞与测试多肽接触，并且如果所述展示的抗体多肽或抗体多肽片段结合所述靶多肽，那么选择所述亲本耶氏酵母属细胞。在某些实施方案中，此类方法包括自所述选定的亲本耶氏酵母属细胞分离所述抗体多肽或抗体多肽片段的第一表达盒，在编码所述抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列中引入一处或多处变化以生成经修饰的表达盒，将所述经修饰的表达盒导入缺乏所述第一表达盒的第二耶氏酵母属细胞中以生成经修饰的耶氏酵母属细胞，将所述经修饰的耶氏酵母属细胞在耶氏酵母属细胞操作条件下温育一段时间，将所述经修饰的耶氏酵母属细胞与所述靶多肽接触，并且如果所述经修饰的耶氏酵母属细胞以比所述亲本耶氏酵母属细胞更大的亲和力或亲合力结合所述靶多肽，那么选择所述经修饰的耶氏酵母属细胞。在某些实施方案中，本文中提供了试剂盒。在某些实施方案中，本文中提供的试剂盒包含表达盒，诸如上文描述的任何表达盒。在某些实施方案中，本文中提供的试剂盒包含载体，诸如上文描述的任何载体。在某些实施方案中，本文中提供的试剂盒包含耶氏酵母属细胞。在某些实施方案中，本文中提供的试剂盒包含关于使用表达盒、载体、或这两者的书面用法说明书。除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。本文中描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域中已知的其它合适的方法和材料。材料、方法和例子仅是例示性的，而并不意图为限制性的。通过提及而完整收录本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目、和其它参考文献。在矛盾的情况中，应以本说明书，包括定义为准。从以下发明详述和附图，及从权利要求书看，本发明的其它特征和优点会是显而易见的。附图简述图I是用于scFv和Fab片段的解脂耶氏酵母展不的表达质粒和表达盒的图不。图IA显示用于随机整合的耶氏酵母属表达质粒的构件和图。靶基因的表达由诱导型pP0X2启动子驱动。不同转化标志物可用于容许创建完全互补的菌株(Leu2，Ade2，Ura3)。使用此质粒作为模板来克隆不同抗体片段。图IB显示用于AGA1、scFv片段和Fab片段轻链ckl域的可溶性表达的表达盒。使用显示的限制性位点将合成的盒克隆入耶氏酵母属表达质粒中。可以将轻链可变域分开克隆入所得的质粒中，创建含有轻链可变区(VL)和轻链恒定区的全长Fab轻链片段(VL-Ckl)的展示质粒。图IC显示使用显示的限制性位点克隆入耶氏酵母属表达质粒中的scFv抗体片段。生成总共4种合成构建体，其容许以不同融合模式并使用不同锚定分子锚定。图ID显示使用显示的限制性位点克隆入耶氏酵母属表达质粒中的Fab CHl抗体片段(含有重链恒定区CHl域的Fab片段)。生成总共4种合成构建体，其容许以不同融合模式并使用不同锚定分子锚定。可以将重链可变域分开克隆入所得的质粒中，创建由VH和重链恒定区CHl域构成的全长Fab重链(VH-CHl)的展示质粒。图IE显示就像它们会在解脂耶氏酵母细胞表面上表达那样自scFv和Fab片段之每种及其合适的锚 多肽表达的各种多肽的共转化策略和图示。图2是一系列一维荧光流式细胞术(FFC)直方图，其描绘了对于FALCON和摇瓶(SF)培养物(86%)两者在极限补充培养基(MM)和丰富培养基(RM)中于20° C诱导20小时的解脂耶氏酵母细胞中加有C-Myc标签的scFv表达。还将细胞在丽中于28° C在摇瓶中培养。顶部小图显示加有C-Myc标签的scFv片段的FFC直方图，而底部小图显示表达完全大小单克隆赫赛汀抗体的菌株1T2的FFC直方图。检测荧光，如下文实施例I中所描述的。加阴影的直方图显示自身荧光(阴性对照)，而实线代表c-myc表达。图3是一系列一维FFC直方图，其描绘了诱导不同时间量的解脂耶氏酵母细胞中加有c-Myc标签的scFv表达。直方图描绘了诱导时间对加有c_Myc标签的scFv在解脂耶氏酵母细胞中表面展示水平的影响。将细胞培养16、20、24、32和43小时。表达c_Myc的细胞的相对比例随诱导时间延长而降低(24小时后的54%、32小时后的19%、和43小时后的7%)。检测荧光，如实施例I中所描述的。加阴影的直方图显示自身荧光(阴性对照)，而实线代表c-myc表达。图4是一系列一维FFC直方图，其描绘了 pH对加有c-Myc标签的scFv在解脂耶氏酵母细胞中表面展示水平的影响。将细胞于pH 6.8, pH 5和pH3培养24小时(顶部小图)和32小时(底部小图)。左侧小图显示不在其表面上表达scFv的细胞的背景荧光。右侧小图显示在其表面上表达scFv的细胞的荧光。检测荧光，如实施例I中所描述的。图5是一系列一维FFC直方图,其描绘了两种不同加有c-Myc标签的scFv片段的表面表达4-4-20scFv (在“4-4-20scFv”标记下的图)和赫赛汀scFv (在“赫赛汀scFv”标记下的图)。创建总共4种展示质粒,其容许以与酿酒酵母(S. cerevisiae) Saglp的C端部分(320个C端AA ;标记为“Al”的行中的直方图)的N端融合物、与酿酒酵母Aga2p的N端融合物(标记为“A2”的行中的直方图)、与解脂耶氏酵母CwpIp的C端部分(110个C端AA)的N端融合物(标记为“A3”的行中的直方图)和与Aga2p的C端融合物(标记为“A4”的行中的直方图)展示scFv片段。scFv片段能够结合抗原(标记为“配体结合”的栏中的小图)。对于配体结合检测，用链霉亲合素-藻红蛋白检测生物素化的抗原。检测荧光，如实施例I中所描述的。对于每幅图，加阴影的直方图代表自身荧光(阴性对照)。实线代表c-myc表达或配体结合，如每栏上方标示的。图6是表达加有c-Myc标签的4-4_20scFV融合蛋白(图6A)或加有c_Myc标签的4-4-20重和轻链融合蛋白(图6B)的细胞的一系列免疫荧光显微图。通过用抗c-Myc抗体染色检测表达。图7是一系列一维FFC直方图,其描绘了两种不同加有c-Myc标签的Fab片段的表面表达4-4-20Fab (在“4_4_20Fab”题目下的直方图)和赫赛汀Fab (在“赫赛汀Fab”题目下的直方图)。创建总共4种展示质粒，其容许以与酿酒酵母Saglp的C端部分(320个C端AA)的N端融合物(标记为“Al”的行中的直方图)、与酿酒酵母Aga2p的N端融合物(标记为“A2”的行中的直方图)、与解脂耶氏酵母CwpIp的C端部分(110个C端AA)的N端融合物(标记为“A3”的行中的直方图)和与Aga2p的C端融合物(标记为“A4”的行中的直方图)展示Fab重链片段。Fab轻链以可溶性片段表达。检测重链(HC)和轻链(LC)表达。对于配体结合检测，用链霉亲合素-藻红蛋白检测生物素化的抗原。检测荧光，如实施例I中所描述的。对于每幅图，加阴影的直方图代表自身荧光(阴性对照)。实线代表c-myc表达(指示锚定的重链片段表达)、V5表达(指示轻链表达)或配体结合，如每栏上方标示的。图8是一系列一维FFC直方图，其描绘了赫赛汀Fab的表面表达。重链是与酿酒酵母Aga2p的N端融合物。可溶性表达轻链。个别检测重链(HC)和轻链(LC)(分别标·记为“HC”和“LC”的行中的直方图)。使用二色FACS分析的HC和LC的同时标记(标记为“HC+LC”的行中的直方图)表明这两条链在各个酵母细胞表面上配对。检测荧光，如实施例I中所描述的。加阴影的直方图代表自身荧光(阴性对照)，而实线代表HC或LC表达，如标示的。图9是一对柱形图，其描绘了蛋白伴侣对Her-scFv和Her-Fab表达的影响。WT=野生型。TEF PD=在TEF启动子控制下表达的I3DI (蛋白质二硫键异构酶)。P0X2HACI=在P0X2启动子控制下表达的HACI，即一种诱导UPR (解折叠蛋白质应答)的转录因子。
图10是一系列线图，其描绘了展示的赫赛汀scFv的剂量响应曲线。显示了三次独立滴定。前Al-赫赛汀scFv=以与酿酒酵母Saglp的C端320个氨基酸的N端融合物融合并在前Lip2前导序列的情况中表达的赫赛汀scFv。前原Al-赫赛汀scFv=以与酿酒酵母Saglp的C端320个氨基酸的N端融合物融合并在前原Lip2前导序列的情况中表达的赫赛汀scFv。前A2-赫赛汀scFv=以与酿酒酵母Aga2p的N端融合物融合并在前Lip2前导序列的情况中表达的赫赛汀scFv。“ [Ag] ” =HER2-Fc嵌合蛋白(抗原)浓度。Y轴显示结合的分数，其以MFI/(MFI最大-MFI最小)计算，标准化，并以百分比表示。对每个滴定曲线显示计算的kD。图11是一对线图，其描绘了展示的scFv Dl. 3和突变体M3(它们各自识别鸡蛋溶菌酶01EL))的剂量响应曲线。M3比Dl. 3具有高2倍的针对鸡蛋溶菌酶的亲和力。展示的多肽以Saglp (标记为“前A1D1. 3对M3”的线图)和Aga2p (标记为“前A2D1. 3对M3”的线图)融合多肽表达。将Dl. 3或M3展示细胞与不同浓度的生物素化的鸡蛋溶菌酶一起温育(X轴显示以nM计的浓度)。对每个滴定曲线显示计算的kD。图12是用于转化解脂耶氏酵母的复制型载体的示意图。将复制型载体构建为含有由pP0X2启动子驱动的scFv-AGA2表达盒和用于复制性增殖的ARS18。图13是一对直方图，其描绘了 scFv-AGA2在用基于捷塔的整合型质粒(图13A)或复制型质粒(图13B)转化的解脂耶氏酵母细胞中的细胞表面表达。关于复制型质粒的数据代表10个克隆的平均值。将用复制型载体转化的细胞在非选择性和选择性条件下培养。X轴(标记为“FL2-H”)显示c-myc荧光信号，其使用经藻红蛋白缀合的二抗在通道2中记录。Y轴(标记为“计数”)显示细胞数目。图14是一系列一维FFC直方图,其描绘单一加c-Myc标签的全长曲妥单抗(赫赛汀)IgG的表面表达。创建总共2种展示质粒，其容许以与酿酒酵母Aga2p的N端融合物(标记为“A2”的行中的直方图)和与Aga2p的C端融合物(标记为“A4”的行中的直方图)展示IgG重链。IgG轻链以可溶性片段表达。检测重链(HC)和轻链(LC)表达。检测荧光，如实施例I中所描述的。图14A是显示c-myc和V5表达的点图。清楚地，对于与AGA2的N和C端融合物两者，所有细胞同时显示全长重链和轻链的表达。未标记的细胞没有显示表位标签的检出。图14B加阴影的直方图对这两种融合物显示c-myc和V5表达。与对赫赛汀Fab展示观察到的事情类似，与N端融合物相比，可以对将重链在AGA2锚的C端融合的细胞观察到展示效率的显著改善(如通过虚线标示的)。图14C显示表达的HC和LC的图示。图15是一副线图，其描绘了来自scFv亲和力成熟筛选的两种分离的克隆(克隆13和克隆38)的剂量响应曲线。自平衡滴定曲线测定Kd，并与野生型Dl. 3Kd比较。对于克隆 13和克隆38，Kd值分别测定为2. 2和I. 8nM。与野生型Kd (4. OnM)相比，这分别代表I. 8和2. 4倍改善，其与M3突变体位于相同范围中。发明详述本文中提供了用于在酵母细胞的表面上展示多肽(例如，抗体多肽或抗体多肽片段)的方法和组合物。可以与本文中公开的各种方法和组合物联合使用的例示性酵母包括耶氏酵母属的那些酵母，例如，解脂耶氏酵母(Yl)。抗体多肽和抗体多肽片段依照本文中描述的方法和组合物，可以在酵母细胞表面上表达多种抗体多肽或其片段之任一种。“抗体多肽”在该术语在本文中使用时指作为或源自免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链多肽的多肽。如本领域中已知的，野生型IgG抗体一般包含两条相同的重链多肽和两条相同的轻链多肽。给定的抗体包括五类重链(称作a、S、e、Y和iO之一，其分类基于重链恒定区的氨基酸序列。在人类中，存在有a恒定区的两种亚类和Y恒定区的四种亚类。这些不同类的重链分别产生五类抗体，即IgA (包括IgAl和IgA2亚类)、IgD、IgE、IgG (包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亚类)和IgM。给定的抗体还包含两类轻链(称作K或、)之一，其分类基于轻链恒定域的氨基酸序列。在某些实施方案中，本文中公开的方法提供了在酵母，例如耶氏酵母属菌株诸如解脂耶氏酵母的细胞表面上表达抗体多肽。在某些实施方案中，在酵母中表达全长重链、全长轻链、或这两者。在某些实施方案中，在酵母中表达全长重链、全长轻链、或这两者的片段。“抗体片段”或“抗体多肽片段”在该术语在本文中使用时指不包括如上文所定义的全长抗体多肽，但是仍至少包含全长抗体多肽的一部分的自抗体多肽分子衍生的多肽。抗体多肽片段经常包含如下的多肽，其包含全长抗体多肽的切割部分，尽管该术语不限于此类经切割的片段。因为抗体多肽片段在该术语在本文中使用时涵盖包含自抗体多肽(例如重或轻链抗体多肽)衍生的单一多肽链的片段，所以应当理解抗体多肽片段独自可以不结合抗原。例如，抗体多肽片段可以包含重链抗体多肽中会包含在Fab片段中的那部分；此类抗体多肽片段通常不会结合抗原，除非它与自轻链抗体多肽衍生的另一抗体多肽片段(例如，轻链抗体多肽中会包含在Fab片段中的那部分)联合，使得抗原结合位点得到重建。抗体多肽片段可以包括例如如下的多肽，其会包含在Fab片段、F(ab’)2片段、scFv (单链Fv)片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、多特异性抗体片段诸如双特异性、三特异性、和多特异性抗体(例如,双抗体、三抗体、四抗体)、微型抗体、螯合重组抗体、三体(tribody)或二体(bibody)、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、结合域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼源化(camelize)抗体、和含有Vhh的抗体中。应当领会，“抗体片段”或“抗体多肽片段”包括“抗原结合抗体片段”和“抗原结合抗体多肽片段”。见例如美国专利号7，422，890、7，422，742、和7，390, 884，通过提及而将每篇完整收入本文。“人源化抗体多肽”在该术语在本文中使用时指已经工程化改造为包含其可变区中的一个或多个人可变区(轻和/或重链)框架区以及重和/或轻链多肽的非人(例如，小鼠、大鼠、或仓鼠)互补决定区(CDR)和人重和/或轻链恒定区的抗体多肽。在某些实施方案中，人源化抗体包含除了 CDR区外的完全人的序列。相对于非人源化抗体，人源化抗体对人通常不太有免疫原性，并且如此在治疗应用中提供某些益处。本领域普通技术人员 会知道人源化抗体，而且还会知道适合于生成人源化抗体多肽的技术。见例如美国专利号7，442，772,7, 431，927,6, 872，392、和5，585，089，通过提及而将每篇完整收入本文。“嵌合抗体多肽”在该术语在本文中使用时指已经工程化改造为包含至少一个人恒定区的抗体多肽。重和或轻链可以具有人恒定区。相对于非嵌合抗体，嵌合抗体对人通常不太有免疫原性，并且如此在治疗应用中提供某些益处。本领域普通技术人员会知道嵌合抗体，而且还会知道适合于生成嵌合抗体多肽的技术。见例如美国专利号7，442，772、7，431，927,6, 872，392、和5，585，089，通过提及而将每篇完整收入本文。在某些实施方案中，表达的抗体多肽或抗体多肽片段是人抗体多肽或片段。在某些实施方案中，表达的抗体多肽或其片段是非人抗体多肽或其片段，例如，小鼠或大鼠抗体多肽或其片段。在某些实施方案中，表达的抗体多肽或其片段是嵌合的，即它含有人重和/或轻链恒定区。在某些实施方案中，表达的抗体多肽或其片段是人源化的，即它含有可变区中的一个或多个人框架区以及重和/或轻链的非人(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)互补决定区(CDR)。在某些实施方案中，要在酵母细胞的表面上表达的抗体多肽包含抗体的重链多肽。在某些实施方案中，在酵母细胞的表面上表达重链多肽的片段，例如，重链多肽中会包含在Fab片段(例如，VH-CHl)、Fv片段、或scFv片段中的那部分。在某些实施方案中，要在酵母细胞的表面上表达的抗体多肽包含整个或部分的重链恒定区，例如，Fe区、铰链区，等等。在某些实施方案中，要在酵母细胞的表面上表达的抗体多肽缺乏重链恒定区。在某些实施方案中，要在酵母细胞的表面上表达的抗体多肽缺乏重链恒定区的一部分，例如，Fe区。在某些实施方案中，要在酵母细胞的表面上表达的抗体多肽包含抗体的轻链多肽。在某些实施方案中，在酵母细胞的表面上表达轻链多肽的片段，例如，Fv片段、或scFv片段。在某些实施方案中，要在酵母细胞的表面上表达的抗体多肽包含轻链恒定区。在某些实施方案中，要在酵母细胞的表面上表达的抗体多肽缺乏轻链恒定区。在某些实施方案中，抗体多肽片段是包含如下的氨基酸链的多肽，其作为Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、多特异性抗体片段诸如双特异性、三特异性、或多特异性抗体(例如，双抗体、三抗体、四抗体)、微型抗体、螯合重组抗体、三体或二体、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、结合域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼源化抗体、或含有Vhh的抗体的一部分。在某些实施方案中，抗体多肽片段是scFv片段。在某些实施方案中，在酵母细胞的表面上表达重链抗体多肽或抗体多肽片段和轻链抗体多肽或抗体多肽片段两者。例如，可以在本文中描述的任何酵母(例如，解脂耶氏酵母)中表达完全重链抗体多肽和完全轻链抗体多肽。作为另一个例子，可以与轻链抗体多肽中包含在Fab片段、Fv片段、或scFv片段中的那部分一起在酵母中表达重链抗体多肽中包含在Fab片段、Fv片段、或scFv片段中的那部分。如本领域普通技术人员会理解的，在酵母细胞表面上表达重链抗体多肽和轻链抗体多肽(或其抗体多肽片段)时，此类抗体多肽或片段可以彼此联合以重建功能性抗原结合分子。在某些实施方案中，在第一交配型的第一单倍体酵母细胞表面上表达重链抗体多肽或抗体多肽片段，在第二交配型的第二单倍体酵母细胞表面上表达轻链抗体多肽或抗体多肽片段，并将第一和第二单倍体酵母细胞交配以生成二倍体酵母细胞。相反地，在第一交配型的第一单倍体酵母细胞表面上表达轻链抗体多肽或其片段，在第二交配型的第二单倍 体酵母细胞表面上表达重链抗体多肽或其片段，并将第一和第二单倍体酵母细胞交配以生成二倍体酵母细胞。由于此类交配生成的此类二倍体酵母细胞会表达重链抗体多肽和轻链抗体多肽(或其抗体多肽片段)。酵母交配型是本领域中已知的。例如，在单倍体形式中，酿酒酵母(S. cerevisiae)以两种交配型之一存在MATA和MATB。此外,可以将MATA交配型解脂耶氏酵母细胞工程化改造成MATB交配型。单倍体MATA和MATB酵母细胞可以彼此交配以形成二倍体酵母细胞。本领域普通技术人员会知道可以交配的酵母物种，而且还会知道合适的交配型。在某些实施方案中，可以如下生成表达抗体多肽或抗体多肽片段的单倍体酵母细胞，即用包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核酸序列的载体或表达盒(见题目为“表达盒和载体”的部分)转化单倍体酵母细胞。或者，可以如下生成表达抗体多肽或其片段的单倍体酵母细胞，即用包含编码抗体多肽或其片段的核酸序列的载体转化二倍体酵母细胞，并使经转化的二倍体酵母细胞形成孢子以生成单倍体酵母细胞。在某些实施方案中，通过用两种载体或表达盒(包含编码重链抗体多肽或抗体多肽片段的核酸序列的第一载体或表达盒和包含编码轻链抗体多肽或抗体多肽片段的核酸序列的第二载体或表达盒)转化单倍体酵母细胞而在酵母细胞表面上表达重链抗体多肽或抗体多肽片段和轻链抗体多肽或抗体多肽片段两者。在某些实施方案中，通过用单一载体转化单倍体酵母细胞而在酵母细胞表面上表达重链抗体多肽或抗体多肽片段和轻链抗体多肽或抗体多肽片段两者，所述载体包含表达盒，该表达盒包含编码重链抗体多肽或抗体多肽片段和轻链抗体多肽或抗体多肽片段的核酸序列。此类酵母细胞可以是单倍体或二倍体。在某些实施方案中，要在酵母细胞表面上表达的重链抗体多肽或抗体多肽片段和/或轻链抗体多肽或抗体多肽片段是包含锚多肽(见下文题目为“锚多肽”的部分)的融合多肽。虽然经由其重链抗体多肽或片段来锚定抗体多肽或片段是典型的，但是经由轻链抗体多肽或片段进行锚定也是有可能的。见例如Lin等，App. Microbiol Biotechol, 2003年8月；62 (2-3) : 226-32，通过提及而将其完整收入本文。在某些实施方案中，仅将抗体多肽或其片段的重链与锚多肽融合。在某些实施方案中，仅将抗体多肽或其片段的轻链与锚多肽融合。在某些实施方案中，将抗体多肽或其片段的重链和抗体多肽或其片段的轻链两者与锚多肽融合。在某些实施方案中，在融合多肽的氨基端融合锚多肽。在某些实施方案中，在融合多肽的羧基端融合锚多肽。在某些实施方案中，通过本文中公开的多种方法之任一种获得抗体多肽或抗体多肽片段。此类抗体多肽或其片段可以作为细胞的一部分获得。或者，抗体多肽或其片段可以在其表达后自细胞纯化。可以使用用于纯化多肽的标准技术。可以通过本领域普通技术人员已知的多种方法之任一种来检测和筛选表达感兴趣多肽的酵母细胞。例如，可以采用FACS (荧光激活细胞分选)。在FACS中，使酵母细胞与结合感兴趣多肽(例如，本公开内容的抗体多肽或抗体多肽片段结合的抗原)的经标记试剂接触。可以使用任何标记物，只要它是可检测的。合适的标记物包括但不限于荧光模块、化学发光模块，等等。本领域普通技术人员会知道合适的标记物。在某些实施方案中，用间接标记物标记试剂，所述间接标记物可以通过结合与间接标记物结合的经可检测标记的试剂(例如，荧光或化学发光模块)来检测。多种间接标记物是本领域中已知的，包括但不限于生物素(其可以被亲合素或链霉亲合素结合)、表位标签(例如本文中描述的任何表 位标签)，等等。可以使用对特定表位标签特异性的经标记抗体或其片段来检测表位标签。或者，可以通过结合对特定表位标签特异性的第一抗体或其片段，并用经标记的第二抗体或其片段检测第一抗体或片段来检测表位标签。然后，将酵母细胞通过细胞分选仪，其分开细胞并且测定经标记药剂是否与每个个别细胞联合。展现荧光的那些细胞在其表面上表达感兴趣多肽。或者，可以在用结合感兴趣抗体多肽或片段的药剂(例如抗原)包被的平板上“淘选”细胞。或者，可以将细胞结合至固体支持物(例如珠)，其与结合感兴趣抗体多肽或片段的药剂(例如抗原)连接。然后，可以分离固体支持物(例如，通过离心、若支持物是顺磁性的，则磁性除去，等等)；结合固体支持物的任何细胞在其表面上表达感兴趣多肽。本领域普通技术人员会知道适合于鉴定和分离在其表面上表达感兴趣多肽的酵母细胞的其它方法。见例如 Yeung 和 ffittrup, Biotechnol. Prog. , Mar-Apr; 18 (2) : 212-20，2002 ；Ackerman 等，Biotechnol. Prog.，May-Jun;25(3) :774-83，2009 ；ffang 等，J. TmmunoI.Methods, Sep; 304 (1-2) : 30-42，2005 ;及 Chao 等，Nat. Protoc.，I ⑵:755-68，2006，通过提及而将每篇完整收入本文。本领域普通技术人员会知道可以依照本文中描述的方法和组合物在酵母(例如，解脂耶氏酵母)细胞表面上表达的其它抗体多肽和片段。锚多肽可以依照本文中描述的方法和组合物使用多种锚多肽之任一种在酵母细胞表面上表达多肽(例如，抗体多肽或抗体多肽片段)。“锚多肽”在该术语在本文中使用时指拴系至细胞表面，并且如此可以用于将其它多肽(例如，抗体多肽或抗体多肽片段)与拴系至细胞表面的多肽。例如，锚多肽可以是跨膜或细胞壁蛋白，诸如例如，糖基磷脂酰肌醇(GPI)细胞壁蛋白。多种锚多肽是本领域中已知的，并且可以依照本文中公开的组合物和方法用于在酵母表面上表达多肽。此类锚肽包括但不限于酿酒酵母Agal_Aga2 (交配型A凝集素基因)异二聚体、酿酒酵母a-凝集素(Saglp)、Pirlp、Pir2p、Pir4p、Flolp、耶氏酵母属CWPI及其片段(见例如 Ueda 等,J. Biosci. Bioeng. 90:125-36，2000 ；Abe, H. , Shimma 等，Pi r. Glycobiology13, 87-95, 2003 ；Andres, I.，等，Biotechnol Bioeng 89, 690-7，2005 ；ffang, Q.，等，Curr.Microbiol. 56, 352-7，2008 ；Tanino, T.,等，Biotechnol. Prog. 22, 989-93，2006 ；Yue等，J. Microbiol. Methods. 2008年2月；72 (2) :116-23 ;通过提及而将每篇完整收入本文)。在某些实施方案中，使用锚多肽将感兴趣多肽(例如，抗体多肽或抗体多肽片段)与酵母细胞表面，例如，解脂耶氏酵母细胞的表面拴系在一起。例如，可以将锚多肽与感兴趣多肽融合，使得在细胞表面上表达锚多肽和感兴趣多肽两者。在某些实施方案中，可以通过用载体或表达盒(见题目为“表达盒和载体”的部分)转化酵母细胞来生成表达感兴趣多肽(例如，抗体多肽或抗体多肽片段)的酵母细胞，所述载体或表达盒包含与编码锚多肽的第二核酸序列以符合读码框的方式融合的编码感兴趣多肽的第一核酸序列。在某些实施方案中，在第二核酸序列5’融合第一核酸序列，使得自融合序列生成的融合多肽包含N端感兴趣多肽和C端锚多肽。在某些实施方案中，在第二核酸序列3’融合第一核酸序列，使得自融合序列生成的融合多肽包含N端锚多肽和C端感兴趣多肽。在某些实施方案中，将第一核酸序列与第二核酸序列以符合读码框的方式直接 融合。在某些实施方案中，将第一核酸序列与接头序列融合，将接头序列与第二核酸序列融合。如题目为“表达盒和载体”的部分中更为详细描述的，接头序列通常编码接头多肽，诸如不限于GlySer接头多肽,例如，(Gly4Ser) 3或(GlySer) 5。表达盒和载体在某些实施方案中，在酵母细胞表面上表达多肽(例如，抗体多肽或抗体多肽片段)通过用包含编码所述多肽的核酸序列的表达盒转化所述酵母来进行。如本文中使用的，术语“表达盒”指如下的核酸序列，其最低限度包含(I)编码感兴趣多肽的核苷酸序列，和
(2)驱动感兴趣多肽表达的核苷酸序列(例如，启动子)。在某些实施方案中，由表达盒的核苷酸序列编码的感兴趣多肽包含抗体多肽或抗体多肽片段。表达盒可以包含编码本文中描述的任何抗体多肽或片段，例如自Fab片段、Fv片段、或scFv片段衍生的抗体多肽或片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，感兴趣多肽是Fab片段的重链。在某些实施方案中，感兴趣多肽是Fab片段的轻链。在某些实施方案中，由表达盒的核苷酸序列编码的感兴趣多肽包含锚多肽。表达盒可以包含编码本文中描述的任何锚多肽，例如酿酒酵母Agal_Aga2异二聚体、酿酒酵母a凝集素(Saglp)、Pirlp、Pir2p、Pir4p、Flolp、耶氏酵母属CWPI及其片段的核苷酸序列。在某些实施方案中，由表达盒的核苷酸序列编码的感兴趣多肽包含与锚多肽以符合读码框的方式融合的抗体多肽或抗体多肽片段。例如，表达盒可以包含编码抗体多肽或片段的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列与编码锚多肽的第二核苷酸序列以符合读码框的方式融合。在某些实施方案中，在编码锚多肽的第二核苷酸序列5’以符合读码框的方式融合编码抗体多肽或片段的第一核苷酸序列，使得在表达核苷酸序列时，抗体多肽或片段在锚多肽的N端。在某些实施方案中，在编码锚多肽的第二核苷酸序列3’以符合读码框的方式融合编码抗体多肽或片段的第一核苷酸序列，使得在表达核苷酸序列时，抗体多肽或片段在锚多肽的C端。在某些实施方案中，表达盒包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列，其与编码锚多肽的核苷酸序列以符合读码框的方式融合，使得没有居间核苷酸残基。在此类实施方案中，自表达盒表达的多肽会包含在无居间氨基酸残基的情况中与锚多肽直接融合的抗体多肽或片段。在某些实施方案中，表达盒包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列，其与编码接头多肽的接头序列以符合读码框的方式融合，所述接头序列与编码锚多肽的核苷酸序列以符合读码框的方式融合，使得接头序列在编码抗体多肽或片段的第一核苷酸序列与编码锚多肽的核苷酸序列间以符合读码框的方式融合。在此类实施方案中，自表达盒表达的多肽会包含抗体多肽或抗体多肽片段、接头多肽、和锚多肽。在此段中描述的任何实施方案中，可以在编码锚多肽的核苷酸序列5’或3’融合编码抗体多肽或片段的核苷酸序列。可以依照目前描述的组合物和方法使用多种接头多肽之任一种。接头多肽充当融合多肽内包含的两种感兴趣多肽间的间隔物。有利地，接头多肽不干扰两种感兴趣多肽的功能，或仅以微小的程度干扰。在某些实施方案中，接头多肽容许两种感兴趣多肽有显著的构象自由，使得两种感兴趣多肽相对于彼此能够采取多种空间位置和取向。接头多肽的非限制性例子是 GlySer 接头多肽，例如，(Gly4Ser) 3 (SEQ ID NO: 14)或(GlySer) 5(SEQ IDNO: 15)。在某些实施方案中，接头多肽可以位于抗体多肽或抗体多肽片段的两部分间。例如，可以将编码接头多肽的接头序列在I)编码scFv片段的重链可变区的重链核酸序列和2)编码scFv片段的轻链可变区的轻链核酸序列间以符合读码框的方式融合。在某些实施 方案中，感兴趣多肽包含超过一个接头序列。例如，融合多肽可以包含DscFv抗体多肽片段，其可以包含scFv片段的重和轻链可变区多肽间的第一接头多肽、2)锚多肽、和3)scFv抗体多肽和锚多肽间的第二接头多肽。本领域普通技术人员会知道其它合适的接头多肽及其编码核苷酸序列。在某些实施方案中，表达盒包含前导核酸序列，其包含编码前导多肽的核苷酸序列。可以依照目前描述的组合物和方法使用多种前导多肽之任一种。前导多肽经由分泌装置发挥功能以帮助驱动对多肽的加工，最终导致正确加工的表面展示的多肽。前导序列在加工期间自多肽切割，并且不是完全加工的多肽的一部分。如本领域普通技术人员会理解的，前导核酸序列通常会在编码感兴趣多肽的核苷酸序列5’以符合读码框的方式融合，使得前导多肽在表达的融合多肽的N端。前导多肽的非限制性例子包括前LIP2、前原LIP2、前 XPR2、和前原 XPR2。见例如 Pignede 等，J. Bacteriol. , May; 182 (10) :2802-10, 2000 ；Davidow 等,J. Bacteriol. , Oct; 169 (10) : 4621-9，1987 ;及 Madzak 等,J. Biotechnol. , 4 月8日；109(1-2) :63-81, 2004，通过提及而将每篇完整收入本文。本领域普通技术人员会知道其它合适的前导多肽及其编码核苷酸序列。在某些实施方案中，表达盒包含表位核酸序列，其包含编码表位标签的核苷酸序列。可以依照目前描述的组合物和方法使用多种表位标签之任一种。表位标签通常是短的多肽序列，其便于表达多肽的检测、测量、定量、和/或纯化(或分离)。表位标签可以位于给定多肽内的任何地方，例如，在N端、在C端、或在内部。表位标签的非限制性例子包括C-Myc (髓细胞组织增生(myelocytomatosis)细胞癌基因)、V5 (自猿病毒5的P和V蛋白的C端序列衍生)、多组氨酸(例如，6-his，或六组氨酸)、谷胱甘肽-S-转移酶、链霉亲合素、生物素、血凝素、Flag标签(FLAG八肽)、和E标签[GAPVPYPDPLEPR，SEQ ID NO: 13]。本领域普通技术人员会知道其它合适的表位标签及其编码核苷酸序列。在某些实施方案中,表达盒包含启动子。如本领域中已知的,启动子是驱动下游核苷酸序列转录成核糖核酸(RNA)的核苷酸序列，所述转录是经由多种转录因子之任一种介导的。在某些实施方案中，转录的RNA编码感兴趣多肽。在某些实施方案中，表达盒包含与融合序列可操作连接的启动子，所述融合序列包含(I)第一核酸序列，其包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列，其以符合读码框的方式融合(2)第二核酸序列，其包含如下的核酸序列，所述核酸序列包含编码锚多肽的核苷酸序列。有利的启动子是那些通常在感兴趣的细胞中发挥功能的。例如，已知在酵母中，例如在耶氏酵母属物种，诸如但不限于解脂耶氏酵母中发挥功能的许多启动子。在某些实施方案中，使用在解脂耶氏酵母中发挥功能的启动子来驱动编码抗体多肽或抗体多肽片段的RNA表达。在某些实施方案中，使用在解脂耶氏酵母中发挥功能的启动子来驱动编码锚多肽的RNA表达。在某些实施方案中，使用在解脂耶氏酵母中发挥功能的启动子来驱动编码与锚多肽融合的抗体多肽或抗体多肽片段的RNA表达。可以依照目前描述的组合物和方法使用多种启动子之任一种以在酵母细胞表面上表达感兴趣多肽。在某些实施方案中，用于表达多肽(例如，抗体多肽或抗体多肽片段)的启动子是组成性的。多种组成性启动子是本领域中已知的，包括但不限于TEFl和甘油 醛-3-磷酸脱氢酶启动子。在某些实施方案中，用于表达多肽(例如，抗体多肽或抗体多肽片段)的启动子是诱导型的。在从业人员期望控制何时表达感兴趣多肽时，诱导型启动子是有用的。许多诱导型启动子是本领域中已知的，包括但不限于P0X3和LIP2启动子。在某些实施方案中，用于表达多肽(例如，抗体多肽或抗体多肽片段)的启动子是半组成性的。“半组成性启动子”在该术语在本文中使用时指不是完全组成性的，并且很大程度上或仅在某些条件下驱动某些基因表达的启动子。例如，半组成性启动子可以以生长阶段依赖性方式驱动基因表达。许多半组成性启动子是本领域中已知的，包括但不限于hp4d启动子。本领域普通技术人员会知道在感兴趣的细胞中，例如在耶氏酵母属物种，诸如但不限于解脂耶氏酵母中发挥功能的合适的组成性、诱导型和半组成性启动子。在某些实施方案中，在酵母细胞表面上表达多肽(例如，抗体多肽或抗体多肽片段)通过用包含表达盒，例如本文中描述的任何表达盒的载体转化所述酵母来进行。“载体”如该术语在本文中使用时指包含表达盒，而且进一步包含一种或多种别的元件的核酸。在某些实施方案中，载体包含便于载体在选择条件下复制、同源或非同源整合、和/或维持的元件。可以依照目前描述的组合物和方法使用多种载体之任一种来在酵母细胞表面上表达感兴趣多肽。可以使用的载体的非限制性例子包括那些在美国专利公开文本No. 2008-0171359中披露的，通过提及而将其完整收入本文。本领域普通技术人员会知道用于给定的感兴趣细胞(例如，酵母细胞)的其它合适的载体。此外，可以修饰多种载体之任一种以用于在酵母细胞表面上表达感兴趣多肽。例如，商品化或其它载体可以适合于用于给定的酵母物种，但是此类载体可以不包含如下的表达盒，所述表达盒包含与融合序列可操作连接的启动子，所述融合序列包含(I)第一核酸序列，其包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列，其以符合读码框的方式融合(2)第二核酸序列，其包含如下的核酸序列，所述核酸序列包含编码锚多肽的核苷酸序列。此类载体可以修饰为包含启动子和编码抗体多肽或抗体多肽片段和锚多肽的核酸序列。许多分子技术适合于修饰载体，其中许多可参见 Sambrook, J.，Fritsch, E. F.和 Maniatis, T. Molecular Cloning:A LaboratoryManual.第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989，通过提及而将其内容完整收入本文。本领域普通技术人员会知道适合于修饰载体以用于在酵母(例如，解脂耶氏酵母)细胞表面上表达感兴趣多肽的多种其它分子技术。在某些实施方案中，载体包含编码选择标志的核苷酸序列。“选择标志”在该术语在本文中使用时指容许含有选择标志的细胞在缺乏选择标志的细胞不能存活和/或增殖的条件下存活和/或增殖的多肽。选择标志的术语和概念是本领域普通技术人员公知的。选择标志的非限制性例子包括那些关于亮氨酸(例如，LEU2)、尿嘧啶(例如，URA3dl)、腺嘌呤(例如，ADE2)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、甘油利用(Gut)、色氨酸(Trp)、甘油-3-磷酸脱氢酶(G3p)、和潮霉素B磷酸转移酶(hph)的。本领域普通技术人员会知道可以依照本文中公开的组合物和方法使用的其它合适的标志物。在某些实施方案中，将载体整合入细胞(例如，耶氏酵母属细胞诸如解脂耶氏酵母)的基因组中。用于将载体整合入细胞的基因组中的多种技术是本领域中已知的。在某些实施方案中，载体包含捷塔元件。捷塔元件是容许载体通过同源重组整合入携带Yltl反 转录转座子的解脂耶氏酵母菌株的基因组中，或者在缺乏Yltl反转录转座子的酵母中通过非同源重组来整合的序列。在某些实施方案中，捷塔元件包含反转录转座子，诸如但不限于Yltl或Tyl6反转录转座子的长末端重复。本领域普通技术人员会知道其它元件，而且会能够依照本文中公开的组合物和方法在载体中使用它们。在某些实施方案中，不将载体整合入细胞的基因组中。例如,可以例如通过转化将复制型载体导入酵母细胞中。复制型载体含有适合于在宿主细胞中维持、复制和/或其它功能的元件。例如，载体可以含有一种或多种常染色体复制元件。此类常染色体复制元件的非限制性例子包括着丝粒(CEN)和复制起点(ORI)。在某些实施方案中，着丝粒包含 CENl 或 CEN3 (Vernis, L.等，Mol. Cell Biol. 17，1995-2004，2007，通过提及而将其完整收入本文)。在某些实施方案中，复制起点包含0RI1068或0RI3018 (Fournier等，Yeast, Jan ;7(1) : 25-36, 1991，通过提及而将其完整收入本文)。在某些实施方案中，不整合入细胞的基因组中的载体可以含有自主复制序列(ARS)。见例如Fournier等，Yeast7，25-36，1991 和 Matsuoka 等，Mol. Gen. Genet. 237，327-333，1993，通过提及而将每篇完整收入本文)。在某些实施方案中，ARS包含着丝粒和复制起点。ARS的非限制性例子包括ARS18 和 ARS18。在某些实施方案中，表达盒包含与锚核苷酸序列核酸序列可操作连接的启动子，所述锚核苷酸序列核酸序列包含编码锚多肽的核苷酸序列，其中所述锚核酸序列可以在包含感兴趣的第二融合配偶体的融合蛋白中作为第一融合配偶体表达。在某些此类实施方案中，表达盒包含另一核酸序列，其包含编码感兴趣的第二融合配偶体的核苷酸序列。感兴趣的第二融合配偶体可以是多种多肽之任一种。例如，感兴趣的第二融合配偶体可以是抗体多肽或抗体多肽片段，尽管第二融合配偶体不限于此类抗体多肽或片段。因为第二融合配偶体会与锚多肽融合，所以第二融合配偶体也会在细胞表面上表达。在某些实施方案中，此段中包括的表达盒包含如下的核酸序列，所述核酸序列包含限制性位点以容易融合感兴趣的第二融合配偶体。多种限制性位点之任一种可以包含在表达盒中。本领域普通技术人员会知道合适的限制性位点，而且会能够工程化改造包含它们的表达盒。在某些实施方案中，编码感兴趣多肽的核苷酸序列经密码子优化以用于表达多肽的生物体(例如，酵母细胞)。密码子优化是将编码感兴趣多肽的核苷酸序列修饰为使得核苷酸序列经优化以在特定生物体中表达，但是多肽的氨基酸序列保持相同的过程。密码子是被细胞翻译成给定氨基酸的三个核苷酸的序列。因为存在着20种天然编码的氨基酸，但是三个核苷酸的序列存在有64种可能的组合，所以大多数氨基酸由多种密码子编码。给定物种中某些密码子经常比编码相同氨基酸的其它密码子更好地得到翻译，并且每种物种在其密码子偏爱上有所不同。因此，来自一种物种的基因在导入另一种物种中时可以较差地表达。一种克服此问题的方式是利用遗传密码的简并性，并且修饰编码感兴趣多肽的核苷酸序列，使得核苷酸序列现在含有在感兴趣的物种中有效使用的密码子，但是该核苷酸序列仍编码相同多肽。有可能确定哪些密码子在感兴趣的生物体中最广泛使用。实际上，这已经对多种生物体，包括解脂耶氏酵母完成。下文表I中显示了基于2，945，919个密码子的解脂耶氏酵母样品密码子优化表。本领域普通技术人员会知道而且会能够确定其它生物体的密码子选择。表I :解脂耶氏酵母密码子选择表
UUU 15. 9(46804) CU 21. 8(64161)~ AU 6.8(20043)GU 6. 1(17849)
UUC 23. 0(67672) CC 20. 6(60695) AC 23. 1(68146) GC 6. 1(17903)
UUA I. 8(5280)CA 7. 8(22845) AA 0. 8(2494)GA 0. 4(1148)
UUG 10. 4(30576) CG 15. 4(45255) AG 0. 8(2325)GG 12. 1(35555)
CUU13. 2(38890)CU 17. 4(51329)AU 9. 6(28191)GU6. 0(17622)
CUC22. 6(66461)CC 23. 3(68633)AC 14. 4(42490)GC4. 4(12915)
CUA5. 3(15548)CA 6. 9(20234)AA 9. 8(28769)GA21. 7(63881)
CUG33. 5(98823)CG 6. 8(20042)AG 32. I(94609)GG7. 7(22606)
AUU 22. 4(66134)CU 16. 2(47842)AU8. 9(26184)GU 6. 7(19861)
AUC 24. 4(71810)CC 25. 6(75551)AC31. 3(92161)GC 9. 8(28855)
AUA 2.2(6342)CA 10. 5(30844)AA12.4(36672)GA 8.4(24674)
AUG 22. 6(66620)CG 8. 5(25021)AG46. 5(136914)GG 2.4(7208)
GUU 15. 8(46530) CU 25. 5(75193) AU 21. 5(63259) GU 16. 6(48902)
GUC 21. 5(63401) CC 32. 7(96219) AC 38. 3(112759) GC 21. 8(64272)
权利要求
1.一种表达盒，其包含 与融合序列可操作连接的启动子，所述融合序列包含与第二核酸序列以符合读码框的方式融合的第一核酸序列，所述第一核酸序列包含编码锚多肽的核苷酸序列，所述第二核酸序列包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列。
2.一种表达盒,其包含 与第一核酸序列可操作连接的启动子，所述第一核酸序列包含编码锚多肽的锚核苷酸序列，其中所述第一核酸序列可以在融合多肽中作为第一融合配偶体表达，所述融合多肽包含由第二核酸序列编码的感兴趣的第二融合配偶体。
3.权利要求2的表达盒，其进一步包含编码所述感兴趣的第二融合配偶体的第二核酸序列。
4.权利要求3的表达盒，其进一步包含整个或部分的限制性位点。
5.权利要求3的表达盒，其中所述感兴趣的第二融合配偶体包含抗体多肽或抗体多肽片段。
6.权利要求I或权利要求5的表达盒，其中所述抗体多肽片段是scFv片段。
7.权利要求I或权利要求5的表达盒，其中所述抗体多肽片段是Fab片段的重链。
8.权利要求I的表达盒载体，其中所述抗体多肽片段是Fab片段的轻链。
9.权利要求I或3-8中任一项的表达盒，其中在所述第二核酸序列3’融合所述第一核酸序列，使得自所述融合序列生成的融合多肽包含N端抗体多肽或抗体多肽片段和C端锚多肽。
10.权利要求1-8的表达盒，其中在所述第二核酸序列5’融合所述第一核酸序列，使得自所述融合序列生成的融合多肽包含N端锚多肽和C端抗体多肽或抗体多肽片段。
11.前述权利要求中任一项的表达盒，其中所述启动子是组成性的。
12.前述权利要求中任一项的表达盒，其中所述启动子是诱导型的。
13.权利要求12的表达盒，其中所述启动子是POX2或LIP2启动子。
14.前述权利要求中任一项的表达盒，其中所述启动子是半组成性的。
15.权利要求14的表达盒,其中所述启动子是hp4d启动子。
16.前述权利要求中任一项的表达盒，其进一步包含前导核酸序列，所述前导核酸序列包含编码前导多肽的核苷酸序列，其中在所述第一和第二核酸序列5’以符合读码框的方式融合所述前导核酸序列。
17.权利要求16的表达盒，其中所述前导多肽选自下组前LIP2、前原LIP2、前XPR2、和前原XPR2。
18.前述权利要求中任一项的表达盒，其进一步包含接头核酸序列，所述接头核酸序列包含编码接头多肽的核苷酸序列。
19.权利要求18的表达盒，其中所述接头核酸序列在所述第一和第二核酸序列间以符合读码框的方式融合。
20.权利要求18的表达盒，其中所述抗体多肽包含scFv抗体多肽，且其中所述接头核酸序列在编码所述scFv多肽的可变区的重链核酸序列和编码可变区的轻链核酸序列间以 符合读码框的方式融合。
21.权利要求18-20中任一项的表达盒，其中所述接头多肽包含(Gly4Ser)3(SEQIDNO:14)或(GlySer)5(SEQ ID NO:15)。
22.前述权利要求中任一项的表达盒,其进一步包含一种或多种核酸序列,所述一种或多种核酸序列包含编码一种或多种表位标签的核苷酸序列。
23.权利要求22的表达盒，其中所述一种或多种表位标签选自下组c-Myc、V5、六组氨酸、谷胱甘肽-S-转移酶、链霉亲合素、生物素、血凝素、Flag标签、和E标签。
24.前述权利要求中任一项的表达盒，其中所述锚多肽选自下组=Agalp多肽或其片段、Aga2p多肽或其片段、和Saglp多肽或其片段。
25.前述权利要求中任一项的表达盒，其中所述抗体多肽或抗体多肽片段、所述锚多肽、或这两者经密码子优化以在耶氏酵母属细胞中表达。
26.一种包含前述权利要求中任一项的表达盒的载体。
27.权利要求26的载体,其进一步包含捷塔(zeta)元件。
28.权利要求27的载体，其中所述捷塔元件是反转录转座子的长末端重复。
29.权利要求28的表达盒，其中所述捷塔元件是Yltl或Tyl6反转录转座子的长末端重复。
30.权利要求26的载体，其进一步包含一种或多种常染色体复制元件。
31.权利要求30的载体，其中至少一种常染色体复制元件包含着丝粒(CEN)和复制起点(ORI)。
32.权利要求31的载体，其中所述着丝粒是CENl或CEN3，而所述复制起点是ORI1068或 0RI3018。
33.权利要求26的载体，其进一步包含自主复制序列(ARS)，其中所述ARS包含着丝粒和复制起点。
34.权利要求33的载体，其中所述ARS包含ARS18。
35.权利要求33的载体，其中所述ARS包含ARS68。
36.权利要求26-35中任一项的载体,其进一步包含一种或多种核酸序列,所述一种或多种核酸序列包含编码一种或多种选择标志的核苷酸序列。
37.权利要求30的载体，其中所述一种或多种选择标志选自下组LEU2、URA3dl、ADE2、Lys、Arg、Gut、Trp、G3p、和 hph。
38.一种在耶氏酵母属细胞的表面上展示抗体多肽或抗体多肽片段的方法，该方法包括 将第一载体导入第一耶氏酵母属细胞中，所述第一载体包含与融合序列可操作连接的启动子，所述融合序列包含与第二核酸序列以符合读码框的方式融合的第一核酸序列，所述第一核酸序列包含编码抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列，所述第二核酸序列包含编码锚多肽的核苷酸序列；并 将所述第一耶氏酵母属细胞在耶氏酵母属细胞操作条件下温育一段时间。
39.权利要求38的方法,其中所述第一载体是权利要求20-25中任一项的载体。
40.权利要求38或39的方法，其中所述抗体多肽片段是scFv片段。
41.权利要求38或39的方法，其中所述抗体多肽片段是Fab片段的重链。
42.权利要求41的方法，其进一步包括将第二载体导入所述第一耶氏酵母属细胞中，所述第二载体包含与编码Fab片段轻链的核酸序列可操作连接的第二启动子。
43.权利要求38或39的方法，其中所述抗体多肽片段是Fab片段的轻链。
44.权利要求43的方法，其进一步包括将第二载体导入所述第一耶氏酵母属细胞中，所述第二载体包含与编码Fab片段重链的核酸序列可操作连接的第二启动子。
45.权利要求42或44的方法，其中所述第一耶氏酵母属细胞是单倍体，且其中导入所述第二载体的步骤包括将包含所述第一载体的所述第一单倍体耶氏酵母属细胞与包含所述第二载体的第二单倍体耶氏酵母属细胞交配； 其中所述第一和第二耶氏酵母属细胞是相反交配型的。
46.权利要求38-45中任一项的方法,其中在所述第二核酸序列5’融合第一核酸序列，使得由所述融合序列生成的融合多肽包含N端抗体多肽或其抗体多肽片段和C端锚多肽。
47.权利要求38-45中任一项的方法,其中在所述第二核酸序列3’融合第一核酸序列，使得由所述融合序列生成的融合多肽包含N端锚多肽和C端抗体多肽或抗体多肽片段。
48.权利要求38-47中任一项的方法，其中所述耶氏酵母属细胞操作条件包括低诱导温度。
49.权利要求48的方法，其中所述低诱导温度包括约15摄氏度和25摄氏度间的温度。
50.权利要求49的方法，其中所述低诱导温度包括约20摄氏度的温度。
51.权利要求38-50中任一项的方法，其中所述耶氏酵母属细胞操作条件包括短诱导时间。
52.权利要求51的方法，其中所述短诱导时间包括约24小时或更少。
53.权利要求52的方法，其中所述短诱导时间包括约16小时或更少。
54.权利要求53的方法，其中所述短诱导时间包括约16小时。
55.权利要求38-54中任一项的方法,其中所述耶氏酵母属细胞操作条件包括低pH。
56.权利要求55的方法，其中所述低pH包括约2和约4间的pH。
57.权利要求56的方法，其中所述低pH包括约3的pH。
58.权利要求38-57中任一项的方法，其中耶氏酵母属细胞操作条件包括高通气条件。
59.权利要求58的方法，其中所述高通气条件包括在摇瓶中温育。
60.权利要求38-59中任一项的方法，其中耶氏酵母属细胞操作条件包括将所述第一耶氏酵母属细胞在极限培养基中温育。
61.权利要求60的方法，其中所述极限培养基是缺乏酵母提取物、细菌用蛋白胨、或这两者的培养基。
62.权利要求38-61中任一项的方法，其中所述第一载体整合入所述耶氏酵母属基因组中。
63.权利要求38-62中任一项的方法，其中所述耶氏酵母属细胞表达蛋白伴侣。
64.权利要求63的方法,其中所述蛋白伴侣选自下组蛋白质二硫键异构酶、Kar2/Bip、及其组合。
65.权利要求38-64中任一项的方法,其中所述锚多肽选自下组Agalp多肽或其片段、和Aga2p多肽或其片段、或Saglp多肽或其片段。
66.通过权利要求38-65中任一项的方法获得的抗体多肽或抗体多肽片段。
67.一种选择包含结合靶多肽的抗体多肽或抗体多肽片段的耶氏酵母属细胞的方法，包括提供在其表面上展示抗体多肽或抗体多肽片段的亲本耶氏酵母属细胞； 使所述亲本耶氏酵母属细胞与测试多肽接触；并 如果所述展示的抗体多肽或抗体多肽片段结合所述靶多肽，那么选择所述亲本耶氏酵母属细胞。
68.权利要求67的方法，其中通过权利要求38-65中任一项的方法生成所述亲本耶氏酵母属细胞。
69.权利要求67或68的方法，其进一步包括 自所述选定的亲本耶氏酵母属细胞分离所述抗体多肽或抗体多肽片段的第一表达盒; 在编码所述抗体多肽或抗体多肽片段的核苷酸序列中引入一处或多处变化以生成经修饰的表达盒； 将所述经修饰的表达盒导入缺乏所述第一表达盒的第二耶氏酵母属细胞中以生成经修饰的耶氏酵母属细胞； 将所述经修饰的耶氏酵母属细胞在耶氏酵母属细胞操作条件下温育一段时间； 将所述经修饰的耶氏酵母属细胞与所述靶多肽接触；并 如果所述经修饰的耶氏酵母属细胞以比所述亲本耶氏酵母属细胞更大的亲和力或亲合力结合所述靶多肽，那么选择所述经修饰的耶氏酵母属细胞。
70.一种试剂盒，其包含权利要求1-25中任一项的表达盒。
71.—种试剂盒，其包含权利要求26-37中任一项的载体。
72.权利要求70或71的试剂盒，其进一步包含耶氏酵母属细胞。
73.权利要求70或72的试剂盒，其进一步包含关于使用所述表达盒的书面用法说明书。
74.权利要求71或72的试剂盒，其进一步包含关于使用所述载体的书面用法说明书。
全文摘要
本文中提供了用于在酵母细胞的表面上展示多肽(例如，抗体多肽或抗体多肽片段)的方法和组合物。可以与本文中公开的各种方法和组合物联合使用的例示性酵母包括耶氏酵母属(Yarrowia)的那些酵母，例如，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
文档编号C12N15/10GK102803491SQ201180014889
公开日2012年11月28日 申请日期2011年1月21日 优先权日2010年1月21日
发明者S.里卡尔特, G.莱隆德尔 申请人:奥克西雷恩英国有限公司