专利名称：一种多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种生物材料，特别是ー种多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法及其在制备组织工程支架中的应用。
背景技术：
组织工程学(Tissue Engineering)是应用细胞生物学、生物材料和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物的ー门新兴学科。人体组织的病损会导致严重的功能障碍。目前的修复方法主要包括自源性移植、异源性移植和人造材料移植。自源性移植和异源性移植均是移植来自人体的组织，只不过自源性移植的是来自患者本身的组织，而异源性移植的是来自他人的组织。但是不论是自源性移植还是异源性移植均受到组织源缺乏，形状、大小等不匹配，可能会造成额外伤害等的限制。因此使得组织工程学逐步兴起。 组织工程支架(Tissue engineering scaffolds)可用于不同的人体组织，一般需要具有三维、多孔且主要孔相互连接的结构，是细胞粘附、増殖和再生为组织的基础，是细胞生长的细胞外基质的替代物。因此组织工程支架材料除了应当满足特定的组织对机械性能的要求、具有良好的生物相容性及生物可降解性之外，最为重要的是其必须还要具有一定的生物活性，即应该能够积极地促进细胞在其表面的粘附、増殖和分化。目前，常用的组织工程支架材料主要分为天然生物材料和人工合成材料。前者主要有壳聚糖、藻酸盐、纤维蛋白凝胶等。这类材料虽然通产具有良好的生物相容性和生物可降解性，但是其机械强度普遍不足。而后者主要有聚乳酸PLA、聚酯类如PLGA等，但是其吸水能力较差，对于细胞的粘附能力较弱，某些产品的降解产物还可能对人体造成毒害。石蜡又称为晶型蜡，通常是白色或无色的无味蜡状固体，熔点47°C左右，不溶于水，可溶于醚、苯等有机溶剤。常用于食品或其他组分或包装材料。生物纤维素材料是近年来新兴ー种生物材料,其是通过醋酸菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)和八叠球菌属(Sarcina)等中的某些微生物发酵制得，其具有独特的超精细网状结构，因此具有良好的生物相容性及生物可降解性以及良好的机械性能。此外，生物纤维素具有良好的吸水性，且即使在高含水量的情况下，仍然能够保持良好的机械性能。但是传统的生物纤维素材料，虽然能够使细胞粘附于其表面，但是由于其纳米纤维形成的空间网状结构十分致密，细胞的粘附性并不好，而且细胞的移动和营养物质的渗透均存在困难，因此其在组织工程学中并不能获得良好的技术效果。
发明内容
针对现有技术中的上述缺陷，本发明首先提供ー种多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法，其包括如下步骤
I)制备固体石蜡微球并低温灭菌；2)在生物纤维素的制备培养基中加入灭菌的固体石蜡微球；
3)接种生物纤维素凝胶产生菌种，进行发酵；以及
4)在发酵结束后，将发酵获得的生物纤维素凝胶材料水浴加热到50-60°C，保持10-20分钟，然后趁热进行过滤，分离出石蜡即获得多孔性生物纤维素凝胶材料。上述的固体石蜡微球可以通过包括如下步骤的方法制备将石蜡融化，通过喷雾设备喷雾到冷的、与石蜡不互溶的介质中，待石蜡凝固形成微球后固液分离得到固体石蜡微球。例如可以将石蜡熔化后喷雾到冷水中即形成固体石蜡微球。还可将分离出的固体石蜡微球进行冷冻干燥处理以进ー步固型。固体石蜡微球的灭菌，可以是在形成微球之前进行高温灭菌，或在形成微球之后 进行低温灭菌。可以采用的灭菌方法有，例如，固体石蜡高温加热熔化，即同时进行了灭菌处理，再在无菌条件下将其喷雾到冷的无菌水中，形成无菌的固体石蜡微球。灭菌方法还可以是将其在浓度为70%的こ醇溶液总浸泡6-12小时，取出后再在无菌条件下用无菌水漂洗。灭菌方法还可以采用紫外线照射等本领域其他已知的手段。固体石蜡微球的直径优选是200-600微米，更优选是300-400微米。固体石蜡微球的直径可以通过调整喷雾时喷嘴的尺寸，液体石蜡的流速来进行调整。上述固体石蜡微球的用量为培养基体积的40-65% (v/v)，更优选为培养基体积的50-55%。上述的发酵优选使用静态浅盘发酵，发酵条件为28_35°C，发酵5-10天。发酵条件优选30°C，发酵7天。上述方法中，优选在发酵完成后，将多孔性生物纤维素材料浸泡在碱性溶液中一段时间后，在用去离子水反复洗涤，以去除其表面附着的培养基和菌体。优选用0. 05-2M的氢氧化钠溶液浸泡1-4小时。上述分离出固体石蜡的方法，优选将发酵后、内嵌有固体石蜡微球的生物纤维素材料水浴加热到50-60°C，保持10-20分钟，使固体石蜡融化，再趁热进行过滤，从而分离出石蜡。更优选在过滤后用50-60°C的去离子水和/或表面活性剂溶液反复洗涤生物纤维素材料。上述发酵中优选接种木醋杆菌或木葡糖酸醋杆菌为发酵菌种。接种量优选为培养基重量的8-12%，更优选10%。上述发酵中可以使用任何能够使发酵菌种生长繁殖并产生物纤维素的培养基。本发明还提供上述任一方法制得的多孔性生物纤维素材料。本发明还进ー步提供上述的多孔性生物纤维素材料在制备组织工程支架中的应用，其以上述的多孔性生物纤维素材料为材料，通过本领域的常规方法制备成组织工程支架。本发明所提供的方法能够在生产生物纤维素时，使固体石蜡微球被包覆其中，在去除石蜡之后，就会形成多孔性的生物纤维素凝胶材料。所制备的多孔性生物纤维素凝胶材料，在保持了生物纤维素材料良好机械性能、生物相容性以及生物可降解性的同时，使生物纤维素具备了多孔性，为细胞的活动以及营养物质的渗透提供了空间，并进一步提高了细胞的吸附性能，更适用于制备组织工程支架。
图I是多孔性生物纤维素凝胶材料的电镜照片；
图2是多孔性生物纤维素凝胶材料(左)与普通生物纤维素凝胶材料(右)经过细胞培养后的染色电镜照片。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式
作进ー步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I :固体石蜡微球的制备及灭菌 将固体石蜡水浴加热到85°C，使其融化，将融化的液体石蜡通过喷雾装置，喷到冷水中搅拌，使石蜡凝固，过滤分离出固体石蜡，用去离子水反复洗涤后，过200-600微米孔径的筛，再冷冻干燥即可制得固体石蜡微球。再将固体石蜡微球在70%的こ醇溶液中浸泡8小时，取出后在无菌条件下，用无菌水反复洗涤，得到灭菌的固体石蜡微球备用。实施例2 :固体石蜡微球的制备及灭菌
将固体石蜡水浴加热到90°C，使其熔化，继续保持该温度20min，以实现杀菌，通过已灭菌的喷雾装置，将液体石蜡喷雾到冷的无菌水中，使石蜡凝固，过滤分离出固体石蜡，无菌条件下用无菌水反复洗涤，过200-600微米孔径的筛，即得灭菌的固体石蜡微球，备用。实施例3 :多孔性生物纤维素材料的制备
取葡萄糖50g，蔗糖50g，蛋白胨20g，磷酸ニ氢钾lg，磷酸氢ニ钾lg，用去离子水配成IOOOg培养基。然后将培养基倒入发酵浅盘中，用量筒量取500ml的实施例I中制得的灭菌固体石蜡微球，加入到发酵浅盘中，并搅拌均匀，再接种木葡糖酸醋杆菌，接种量10%，28°C下发酵7天，获得内嵌有固体石蜡微球的生物纤维素材料。从发酵浅盘中取出上述材料，将其在0. IM的氢氧化钠溶液中浸泡2小时后，用去离子水反复清洗，以去除其表面附着的培养基成分和菌体。再将其水浴加热到55°C，保持10分钟，使石蜡融化，趁热过滤，固形物用55°C的去离子水反复清洗。即制得本发明中的多孔性生物纤维素凝胶材料。实施例4 :多孔性生物纤维素凝胶材料的制备
取葡萄糖75g，蔗糖25g，蛋白胨10g，酵母膏15g，硫酸镁lg，磷酸ニ氢钾lg，磷酸氢ニ钾lg，用去离子水配成IOOOg培养基。然后将培养基倒入发酵浅盘中，用量筒量取450ml的实施例2中制得的灭菌固体石蜡微球，加入到发酵浅盘中，并搅拌均匀，再接种木葡糖酸醋杆菌，接种量8%，30°C下发酵10天，获得内嵌有固体石蜡微球的生物纤维素凝胶材料。从发酵浅盘中取出上述材料，将其在0. 15M的氢氧化钠溶液中浸泡I小时后，用去离子水反复清洗，以去除其表面附着的培养基成分和菌体。在将其水浴加热到60°C，保持12分钟，使石蜡融化，趁热过滤，固形物用60°C的去离子水反复清洗。即制得本发明中的多孔性生物纤维素材料。实施例5 :多孔性生物纤维素凝胶材料的制备
取葡萄糖25g,乳糖75g,酵母膏25g,硫酸铵5g,磷酸ニ氢钠0. 5g,磷酸氢ニ钠0. 5g，用去离子水配成IOOOg培养基。然后将培养基倒入大三角瓶中，用量筒量取450ml的实施例I中制备的灭菌固体石蜡微球，加入到大三角瓶中，再接种木葡糖酸醋杆菌，接种量12%，35°C下摇床动态发酵5天，获得内嵌有固体石蜡微球的生物纤维素凝胶材料。从大三角瓶中取出上述材料，将其在0. IM的氢氧化钠溶液中浸泡4小时后，用去离子水反复清洗，以去除其表面附着的培养基成分和菌体。在将其水浴加热到50°C，保持20分钟，使石蜡融化，趁热过滤，固形物用60°C的肥皂水反复清洗。即制得本发明中的多孔性生物纤维素凝胶材料。实施例6
取实施例3-5中制得的多孔性生物纤维素凝胶材料，根据实际需要制备成所需的组织工程支架。实验例I :多孔性生物纤维素凝胶材料的电镜分析
取实施例3中制得的多孔性生物纤维素凝胶材料，进行电镜扫描，照片见附图I。从中 可以明显看出，本发明中的多孔性生物纤维素凝胶材料中形成了许多微小的小孔。实验例2
配制0-|^11培养基，接种小鼠原成骨细胞此31341。将实施例3中制得的多孔性生物纤维素凝胶材料和作为对照的普通生物纤维素凝胶材料(发酵时不加入固体石蜡微球而同样条件发酵制得)切割成2cm2，厚度0. 6mm的小圆片，灭菌后，在接种了 MC3T3-E1的MEM培养基中浸泡I小时，取出后置于预先放置了培养基的细胞培养瓶中，37°C，5%ニ氧化碳条件下进行孵育，每2天换液一次，7天后取出生物纤维素凝胶材料圆片，用PBS洗涤3次后再用去离子水洗涤3次备用。
将经过细胞培养的多孔性生物纤维素凝胶材料和对照用3%的甲醛溶液洗涤固定后用罗丹明鬼笔环肽和DAPI分别进行染色，再进行电镜分析。照片见附图2。从图2可以看出，细胞在多孔性生物纤维素凝胶材料和对照上均有附着，在多孔性生物纤维素凝胶材料上更为密集，且在微孔中分布的更多。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤 1)制备经过灭菌的固体石蜡微球； 2)在生物纤维素的制备培养基中加入灭菌的固体石蜡微球； 3)接种生物纤维素凝胶产生菌种，进行发酵；以及 4)在发酵结束后，将发酵获得的生物纤维素凝胶材料水浴加热到50-60°C，保持10-20分钟，然后趁热进行过滤，分离出石蜡即获得多孔性生物纤维素凝胶材料； 其中所述固体石蜡微球通过包括下述方法制备将石蜡融化，通过喷雾设备喷雾到冷的、与石蜡不互溶的介质中，待石蜡凝固形成微球后固液分离得到固体石蜡微球。
2.根据权利要求I所述的多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法，其特征在于步骤4)的趁热过滤后用50-60°C的去离子水和/或表面活性剂溶液反复洗涤多孔性生物纤维素凝胶材料。
3.根据权利要求I所述的多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法，其特征在于其中的固体石蜡微球的直径为200-600微米。
4.根据权利要求3所述的多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法，其特征在于其中的固体石蜡微球的直径为300-500微米。
5.根据权利要求I所述的多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法，其特征在于灭菌的固体石蜡微球的用量为培养基体积的30-65%。
6.根据权利要求5所述的多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法，其特征在于灭菌的固体石蜡微球的用量为培养基体积的50-55%。
7.根据权利要求I所述的多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法，其特征在于制得的灭菌固体石蜡微球是经过冷冻干燥处理的。
8.根据权利要求I所述的多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法，其特征在于其中所述的生物纤维素凝胶产生菌种为木葡糖酸醋杆菌。
9.通过上述任一权利要求中所述的方法制得的多孔性生物纤维素凝胶材料。
10.权利要求9中所述的多孔性生物纤维素凝胶材料在制备组织工程支架中的用途。
全文摘要
本申请涉及一种多孔性生物纤维素凝胶材料及其在制备组织工程支架中的应用。本发明在生物纤维素的培养基中加入固体石蜡微球进行发酵，在发酵时，微生物产生的生物纤维素会将固体石蜡微球包覆在其内，发酵结束后，再去除被包覆的固体石蜡即可获得多孔性生物纤维素凝胶材料。本发明中的多孔性生物纤维素凝胶材料，能够为细胞的移动和营养物质的渗透提供空间，并进一步提高细胞的依附性能，更适于用于制备组织工程支架。
文档编号A61L27/56GK102764451SQ20121018761
公开日2012年11月7日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者钟春燕 申请人:钟春燕